Abstract
Antall nyrekreft har økt de siste ti årene, og pasient overlevelse i avanserte stadier er fortsatt svært dårlig. Derfor nye terapeutiske tilnærminger for nyrekreft er avgjørende. Englerin A er et naturlig produkt med en svært potent og selektiv cytotoksisitet mot renale kreftceller. Dette gjør det til en lovende medikament kandidat som kan forbedre nåværende behandlingsalternativer standarder for pasienter med nyrekreft i alle ledd. Men lite er kjent om englerin A virknings i målretting spesielt nyrekreftceller. Vår studie er den første til å undersøke den biologiske mekanismen av englerin En handling i detalj. Vi rapporterer at englerin A er spesifikk for nyretumorceller og ikke påvirker normale nyreceller. Vi finner at englerin En behandling induserer nekrotisk celledød i nyrekreftceller, men ikke i normale nyreceller. Vi viser videre at autophagic og pyroptotic proteiner er upåvirket av forbindelsen, og at nekrotisk signalering i disse celler falt sammen med produksjon av reaktive oksygenarter og kalsium-innstrømning inn i cytoplasma. Som den første studien å analysere de biologiske effektene av englerin A, gir vårt arbeid et viktig grunnlag for evaluering og validering av forbindelsens bruk som en anti-svulst narkotika. Det gir også en sammenheng der for å identifisere spesifikke mål eller mål for englerin A i nyrekreftceller
Citation. Sulzmaier FJ, Li Z, Nakashige ML, Fash DM, Chain WJ, Ramos JW (2012) Englerin en selektivt induserer nekrose i human Nedsatt kreftceller. PLoS ONE 7 (10): e48032. doi: 10,1371 /journal.pone.0048032
Redaktør: Kalpana Ghoshal, The Ohio State University, USA
mottatt: 6 juli 2012; Godkjent: 26 september 2012; Publisert: 22 oktober 2012
Copyright: © Sulzmaier et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, National Institute of General Medicine (R01GM088266 til JWR) og Victoria S. og Bradley L. Geist Foundation (47030 til WJC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
nyre kreft er en av de vanligste kreftformen i USA med anslagsvis 60,920 nye tilfeller og 13,120 dødsfall i 2011. Om lag 85% av alle nyrekreft er klassifisert som nyre-celle karsinom, en malignitet som oppstår fra renal epitel [1], [2]. Den primære behandling for pasienter med nedsatt-cell carcinoma er kirurgisk fjerning. Men omtrent 25% av pasientene viser tegn til lokal invasjon eller metastase lage en komplett eksisjon vanskelig [2]. Når sykdommen er i et avansert stadium, er kirurgi alene ikke er tilstrekkelig, og fem-års overlevelses faller fra 70% til under 20% [1], [3]. Historisk har state of the art behandling for pasienter med nyrecellekarsinom vært immunmodulerende behandling med interferon-α eller interleukin-2 [4]. Imidlertid har de siste årene sett en økning i bruk av mer målrettede måter å behandle avansert stadium nyrekreft. Oppdagelsen av von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor genet fører til utvikling av reseptor tyrosin kinase-basert terapi rettet mot VEGF eller TGF-α signalveien [5], [6]. VHL regulerer angiogenese og et tap av dette gen i cancerceller resulterer i økt produksjon av vekstfaktorer som VEGF [7]. Alternativt blir reseptor tyrosin kinase hemmere som Sorafenib som blokkerer signal gjennom berørte veier nå godkjent eller i kliniske studier for behandling av avansert nyrekreft [8]. Men disse stoffene er ikke aktuelt for alle pasienter med avansert nyrekreft og alvorlige bivirkninger er rapportert i enkelte tilfeller [2], [9].
Englerin A er en Guaiane sesquiterpene som viste spennende spesifisitet som hemmer av nyrekreft cellevekst [10]. Naturproduktet ble isolert fra barken av
Phyllanthus engleri
, en plante innfødt til Tanzania og Zimbabwe. Englerin A ble screenet for spesifikk cytotoksisk aktivitet mot et panel av kreftcellelinjer (NCI 60-celle panel). I dette skjermbildet kan forbindelsen viste nedsatt kreft bestemt GI
50 verdier som var opp til 1000fold lavere enn i andre kreftcellelinjer. GI
50 verdier bestemt var så lav som 11 nM for visse renale kreftcellelinjer [10], [11]. Englerin En ikke bare viste ekstraordinære spesifisitet for nyrekreftceller, i noen tilfeller sin styrke var enda høyere enn toppmoderne behandlinger som Sorafenib [10], [12]. Etter den innledende beskrivelsen i 2009, har laboratorier over hele verden beskrevne syntetiske strategier for å gjøre det naturlige produkt [13], [14], [15], [16], [17], så vel som økende mengder av struktur-aktivitetsforhold data [11], [18], [19], [20], [21], [22]. Til tross for sin høye effekt, er litteratur om englerin En fortsatt begrenset og publiserte artikler hovedsakelig avtale med syntesen av forbindelsen. Vi rapporterer nå for første gang en mekanisme som englerin A virker på nyrekreftceller til å hemme cellevekst. Våre resultater viser at englerin A induserer spesifikt nekrotisk celledød hos nyrecancercellelinjer, men ikke påvirker levedyktigheten av en glioblastom kreftcellelinje eller normale nyreceller. Vår studie gir ytterligere innsikt i den biologiske aktiviteten til englerin A.
Materialer og metoder
Reagenser
Englerin A ble syntetisert i laboratoriet av Dr. William J. Chain henhold til protokollen tidligere publiserte [12]. Staurosporin ble kjøpt fra EMD Chemicals (Merck, Darmstadt, Tyskland), ionomycin og klorokindifosfat ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO).
Cellelinjer og cellekultur
menneskelige nyrecellekarsinom linjene A-498 og UO-31, så vel som den menneskelige glioblastom cellelinje SF-295 ble hentet fra den DCTD Tumor Repository av National Cancer Institute, Frederick, Maryland. Celler ble dyrket i RPMI-1640 (Mediatech Inc, Manassas, VA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Life Technologies, Grand Island, NY), 1% MEM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA, Mediatech) og 1% penicillin- streptomycin (PenStrep, Mediatech). HEK293-celler ble kjøpt fra ATCC (Rockville, MD) og holdt i DMEM (Mediatech) supplert med 10% FBS, 1% NEAA og 1% PenStrep. Nyreproksimaltubul celler (RPTC) ble kjøpt fra Lifeline Cell Technology (Frederick, MD). Celler ble dyrket i komplett medium RenaLife (livline Cell Technology). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fuktet inkubator.
cellenes levedyktighet Assay
Celler ble sådd ut i 96-brønners plater i 90 ul RPMI uten fenolrødt og uten antibiotika, supplert med 10% FBS og 2 mM L-glutamin. Celle ble sådd ut ved en tetthet på 5000 celler per brønn. Cellene ble tillatt å feste seg i 60 min ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig atmosfære. Etter 60 minutter ble 10 ul englerin En arbeidsoppløsning eller et ekvivalent volum av DMSO fortynnet i RPMI-medium tilsatt. En englerin En stamoppløsning ble fremstilt ved oppløsning av forbindelsen i DMSO ved en konsentrasjon på 10 mM. All ytterligere englerin en arbeider oppløsninger ble fremstilt ved å fortynne denne stamløsning med RPMI-medium til den ønskede sluttkonsentrasjon som angitt. Volumet av englerin En stamoppløsning eller DMSO bærerkontrollen derfor aldri oversteg 0,1% av det endelige volum. Etter tilsetning av forbindelsen, ble celler inkubert i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved bruk av en celle Proliferation Assay (XTT) i henhold til produsentens protokoll (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).
Celler ble sådd ut i en tetthet på 5000 celler per brønn i en 96-brønners plate i 90 pl kultur media uten fenol rød og antibiotika. Celler ble tillatt å ankre opp for 60min etter vanlige dyrkningsforhold. Etter inkuberingsperioden ble 10 ul englerin A fortynninger eller oppløsningsmidlet DMSO som kontroll ble tilsatt til brønnene. Cellene ble inkubert i 48 timer, med forbindelsen før utsette dem for en Cell Proliferation Assay (XTT) i henhold til produsentens protokoll (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).
Mikros
Lysfelt mikrobilder ble tatt med en Zeiss Axiovert200M mikroskop med 40x objektiv. Kjøpte bildene ble analysert ved hjelp AxioVision programvare. Skala barer representerer 20 mikrometer.
Annexin V /PI analyse
Celler ble behandlet med enten en mikrometer englerin A, carrier DMSO eller fem mikrometer staurosporin til angitt tid (1t eller 3 timer) . Etter inkubasjon ble cellene trypsinert og farget for ekstracellulære fosfatidylserin uttrykk ved hjelp FITC-merket Annexin V og propidiumjodid (PI) som co-flekken for å teste cellemembranen integritet (BD Biosciences, San Jose, California). Fargestoffer ble brukt i henhold til produsentens protokoll. Fargede celler ble analysert ved hjelp av en FACScan flowcytometer (BD Biosciences) og Cellquest Pro analyseprogramvare.
Cell lyse og immunblot
Cellelysater ble utarbeidet etter MLB lysebuffer (1% NP-40, 25 mM HEPES-KOH (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,25% natrium-deoksycholat, 10% glycerol, 10 mM MgCl
2, 1 mM EDTA og protease /fosfatase-hemmere). Cellelysater ble løst ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av immunoblotting. Proteinekspresjon ble påvist med spesifikke primære antistoffer mot PARP, caspase 3 og GAPDH (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), samt caspase 1 (EMD Millipore, Billerica, Massachusetts), Beclin-1 (Epitomics, Burlingame, CA) og LC-3 (Novus Biologicals, Littleton, CO). Binding av primære antistoffer ble påvist ved anvendelse av IRDye 680 geit-anti-mus og IRDye 800 geite-anti-kanin sekundære antistoffer. Bånd ble visualisert ved hjelp av en Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor biovitenskap, Lincoln, NE).
Caspase tre aktivitetsanalyse
Caspase 3 aktivitet i celler behandlet med englerin A, staurosporin eller DMSO bærer kontroll ble analysert ved hjelp av en Caspase 3 Activity Assay Kit (Roche Diagnostics). Etter inkubasjon med det sammensatte cellene ble lysert og cellelysatene ble analysert i henhold til produsentens protokoll.
ROS påvisningsmetode
Celler behandlet med englerin A, staurosporin eller bærerkontroll DMSO ble testet for deres produksjon av reaktive oksygen- og nitrogenforbindelser ved hjelp av Total ROS Detection Kit (Enzo Lifesciences, Farmingdale, New York). Cellene ble behandlet i henhold til produsentens protokoll. Den relative endringen i reaktivt oksygen eller reaktive nitrogenforbindelser ble målt ved hjelp av en FACScan flowcytometer (BD Biosciences) og Cellquest Pro analyseprogramvare.
Intracellulær Ca
2+ analysen
intracellulære kalsiumkonsentrasjon ble målt etter at cellene ble behandlet med englerin A, bærer DMSO eller ionomycin positiv kontroll. Etter 30 min inkubering med forbindelsen 2 uM Fluo-3 AM (Life Technologies) ble tilsatt for etterfølgende 30 min inkubering. Etter inkubering ble cellene trypsinert og vasket med 1 x PBS. Fluo-3-binding til Ca
2 + -ioner ble målt ved en økt fluorescensemisjonen av farvestoffet ved 520 nm etter eksitasjon ved 485 nm. Celler ble analysert ved hjelp av en FACScan flowcytometer (BD Biosciences) og Cellquest Pro analyseprogramvare.
Resultater
kjemisk syntetisert englerin En reduserer levedyktigheten til nyrekreftcellelinjer
Englerin A har blitt beskrevet å ha potent hemmer nyrekreftcellevekst [10]. Nylige publikasjoner beskriver fremgangsmåter for en syntetisk produksjon av englerin A uten behov for isolering av naturlig produkt [13], [14], [16], [17]. Alle englerin A i vår studie (kjemisk struktur se Fig. 1
A
) har blitt syntetisert ved å følge protokollen beskrevet i vår siste artikkel av Li og kolleger [12]. For å bedømme styrken av det syntetiske englerin En skjermet vi sine cytotoksiske effekter på to humane renale kreftcellelinjer (UO-31 og A-498) som har blitt beskrevet før for å være følsomme overfor det naturlige produkt. Som kontrollcellelinje vi brukte en human glioblastoma cellelinje (SF-295), som tidligere er rapportert for å være ikke svarer til englerin A [10]. Videre analyserte vi effektene av englerin En behandling på levedyktigheten av en immortalisert nyrecellelinje avledet fra normale humane embryoniske nyreceller (HEK293) og normale humane renale epitelceller (nyreproksimaltubul celler, RPTC). Levedyktigheten ble bestemt ved å måle metabolsk aktivitet av cellene.
(A) Kjemisk struktur av englerin A. (B) Glioblastoma (SF-295), normale immortaliserte nyre celler (HEK-293), nyreproksimaltubul celler (RPTC) og nyrekreftceller (UO-31, A-498) ble inkubert med den indikerte konsentrasjon av englerin A i 48 timer. Cellenes levedyktighet ble analysert ved anvendelse av en XTT-celleproliferasjonsanalyse. Resultatene er vist i% levedyktighet i forhold til en celleprøve som ble behandlet med bærer DMSO. Viste verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM av alle forsøkene (n≥6). IC50 verdier ble beregnet med Prism 5 ved hjelp av en ikke-lineær regresjon fit (log (hemmer) vs. normalisert respons – variabel skråningen).
Vi fant at englerin Et redusert levedyktighet nyrekreftceller, mens det hadde ingen cytotoksiske effekter på glioblastom kontroll cellelinje (fig. 1
B
). Interessant, gjorde det sammensatte ikke påvirke levedyktigheten til HEK293 celler heller, og bare endret celleviabilitet i RPTCs ved svært høye konsentrasjoner (Fig. 1
B
,
forlot
). IC
50 verdier ble bestemt som 140,3 nM for UO-31 celler og 53.25 nM for A-498 celler. IC
50 for RPTCs var omtrent syv størrelsene høyere og ble beregnet som 2,53 M.
Englerin A forårsaker morfologiske endringer som er forskjellige fra staurosporin-indusert apoptose
For å utelukke englerin A virkning på celle spredning som ville ha stått for den observerte nedgangen i metabolsk aktivitet vi analysert cellemorfologi etter behandling med englerin A med en lysfelt mikroskop. Morfologiske endringer også tillatt oss å skille mellom apoptotiske og nekrotiske celledød. For denne analysen vi dessuten sammenlignet cellen morfologi som svar på inkubasjon med staurosporin, en kjent induktor av apoptose [23].
Vi fant at englerin En behandling av nyrekreftceller resulterte i en åpenbar endring i celle morfologi peker til celledød (fig. 2). Ingen forskjeller i celleform eller strukturen kunne observeres i glioblastom-celler SF-295 ble behandlet med forbindelsen. Nyrekreftceller behandlet med englerin A tapt filopodia utvidelser, til slutt nå en rund, symmetrisk struktur, før fullstendig frakobling fra matrisen. Staurosporin indusert apoptose i både glioblastom og nyrekreftceller. Apoptotisk celledød ble karakterisert ved krymping av cellene og dannelsen av apoptotiske legemer som omgir den døende cellen. Selv om behandling med englerin A forårsaket en relativ nedgang i celle volum, kan vi ikke observere dannelsen av klare apoptotiske legemer. Både staurosporin og englerin A forårsaket nyrekreftceller til å dø, men i morfologisk forskjellige måter.
Mikrografer viser morfologi av celler behandlet med englerin A eller staurosporin, en kjent induser av apoptose. Celler ble behandlet med enten 1 uM englerin A eller bærer DMSO i 60 minutter, eller 1 uM staurosporin i 5 timer. Bildene ble tatt med en Zeiss Axiovert200 M mikroskop med en 40 × fase objektiv. For hver behandling, ble 5-10 tilfeldige synsfelt ervervet. Forsøket ble gjentatt tre ganger, mikrografer vises er representativ for den gjennomsnittlige cellemorfologi ved behandling. Skala barer representerer 20 mikrometer.
Englerin en behandling resulterer i et tap av membranintegritet, men ikke i oppregulering av ekstern fosfatidylserin indikasjon på tidlige apoptotic stadier
morfologisk annet utfall i celler behandlet med apoptose-indus staurosporin ledet oss til å analysere om nyrekreftceller dør gjennom nekrotiske signalprosesser snarere enn apoptose når inkuberes med englerin A. Men direkte tiltak av nekrose er knappe og den vanligste måten å bekrefte nekrotisk celle døden er ved å utelukke at en celle dør ved apoptose [24]. Tidlig apoptotiske trinn er kjennetegnet ved en økning av fosfatidylserin (PS) på den ekstracellulære siden av cellemembranen, fulgt av tap av membranintegritet i de sene stadier apoptotiske [25]. Vi brukte FITC-merket Annexin V og propidiumjodid for å analysere disse to parametrene ved flowcytometri, som er en vanlig metode for å bestemme om celledød er apoptotiske eller nekrotiske [26], [27]. Vi kvantifisert celle-subpopulasjoner som svarer til begynnelsen av apoptotiske og apoptotiske sene /nekrotiske trinn ved å måle prosentandelen av celler som uttrykker ekstracellulært PS med eller uten tap av membranintegritet (fig. 3).
Celler ble behandlet med enten ett uM englerin En eller bærer DMSO i 60 min, eller 5 uM staurosporin i 3 timer. Etter inkubering ble cellene trypsinert og farget for ekstracellulær fosfatidylserin ekspresjon ved bruk av FITC-merket Annexin V og propidiumjodid (PI) som co-flekken for å teste cellemembranintegritet. Vist er et resultat er representativt for tre uavhengige forsøks gjentas. Kvantifiseringen og statistikk av alle data er avbildet som søylediagrammer og viser fordelingen av celler som testet positiv for Annexin V binding (tidlig apoptotiske etapper) eller Annexin V bindende og propidiumjodid opptak (sene apoptotiske stadier /nekrotisk død). Verdier som vises er gjennomsnitt ± SEM (n = 3), er statistisk signifikante forskjeller merket med stjerne (*** p 0,001), N.S. = Ikke signifikant.
Som forventet, hadde kontrollcellelinjen SF-295 ikke viser en betydelig økning i apoptotiske cellepopulasjoner som behandles med englerin A eller DMSO-bærer-kontroll. Staurosporin behandling forårsaket apoptotisk celledød i alle cellelinjer ledsaget av en økning i både tidlige og sene apoptotiske cellepopulasjoner. Nedsatt kreftceller A-498 var den mest følsomme, og viser den høyeste andelen (27%) av sen apoptotiske /døde celler. SF-295 og UO-31 cellelinjer viste forhøyede bestander i de tidlige apoptotiske stadier av ca 12-20%. En klar økning i begynnelsen av apoptotiske celler var også synlig etter 1 time behandling med staurosporin (fig. S1).
Interessant nok englerin En behandling har ingen effekt på cellepopulasjoner på samme måte. Vi fant ingen signifikant endring av tidlige apoptotisk cellepopulasjoner (Annexin V enkelt positiv) i enten UO-31 eller A-498-celler etter behandling med englerin A. Behandlingen førte til at cellene mister membranintegritet tidlig, noe som fører til en dobbel positiv farging av cellene. Selv om prosentandelen av celler i tidlig apoptotiske sektoren ikke økte, ble det observert en statistisk signifikant økning til tilnærmet 10-15% døde celler i UO-31 celleprøver og en dobbel positiv populasjon av opp til 27% i A-498-celler etter 1 time for behandling (Fig. 3, bar grafer). Selv på et senere tidspunkt punkt antall single positive, tidlig apoptotiske celler ikke øke i englerin A behandlinger (Fig. S1). DMSO behandling av både nyrekreft cellelinjer (UO-31 og A-498) induserte ikke en signifikant oppregulering av enten enkelt positive (Annexin V) eller dobbelt positiv (Annexin V og PI) populasjoner.
Englerin En indusert celledød er uavhengig av PARP cleavage og caspase 3-aktivitet
apoptotisk celledød er delvis mediert av effektor caspases som caspase 3 som spalte og aktivere nedstrøms mål som poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) . PARP er antatt å hjelpe til apoptotisk signalering ved å tappe cellenes energiressursene [28]. Spalting og aktivering av disse proteiner er derfor en markør for en aktivert apoptotisk signalkaskade. For ytterligere å bekrefte at nyrekreftceller behandlet med englerin A ikke dør ved apoptose vi testet spalting av PARP (Fig. 4
A
) og spalting og aktiviteten av caspase 3 (Fig. 4
A og B
). Som en kontroll, behandling av SF-295-celler med staurosporin i 4 eller 5 h resulterte i spaltede proteinbånd på 17 og 19 kDa som angir de aktive proteinfragmenter. Tilsvarende staurosporin behandling av SF-295-celler førte til spaltning av PARP som indikert ved 89kDa spaltet fragment. Vi fant at englerin A ikke påvirker spaltingen av disse to proteinene i SF-295 eller renale kreftceller (UO-31 og A-498). Vi kunne ikke oppdage band for kløyvde caspase 3 eller PARP ved behandling av cellelinjer med englerin A for 1 eller 4 timer (Fig. 4
A
). Kontroll behandlinger av alle cellelinjer med transportøren DMSO for samme tidsperiode resulterte ikke i påviselig kløyving av caspase 3 eller PARP (Fig. 4
A,
panel til høyre).
Celler ble behandlet med enten 1 uM englerin A, bærer DMSO eller 5 uM staurosporin til angitt tid. (A) Etter inkuberingen ble cellene lysert og lysater ble analysert ved immunblotting for PARP-spaltning eller full-lengde og spaltet caspase 3 (Casp3-fl, Casp3-cl). Lik protein lasting ble bekreftet ved sondering for GAPDH. Full-lengde og spaltede band er angitt. Forsøket ble gjentatt tre ganger. (B) eventuelt, etter inkubering ble cellene lysert og kaspase 3 aktivitet ble testet ved anvendelse av en kaspase 3 aktivitet assay kit. Verdier som vises er midler ± SEM (n = 6), er statistisk signifikante forskjeller merket med stjerne (*** p 0,001). (C) Cellene ble behandlet med enten 1 uM englerin A, bærer DMSO for 60min eller 50 uM klorokin-difosfat (klor) i 18 timer. Etter inkubering ble cellene lysert og lysater ble analysert ved immunblotting for Beclin-1, LC3-I /II og caspase en spaltning (proenzym p45 og spaltet aktiv subenhet p20). Lik protein lasting ble bekreftet ved sondering for GAPDH. Alle membraner ble analysert ved hjelp av IRDye sekundære antistoffer og et Licor Odyssey system. Membraner som vises er fra representative eksperimenter.
For å bekrefte dette resultatet vi analysert caspase 3-aktivitet med en ELISA basert metode som måler enzymatisk aktivitet direkte gjennom spalting av en caspase 3 substrat. Som forventet, staurosporin behandling resulterte i en økning av kaspase 3 aktivitet både i glioblastom kontrollcellelinje og den renale kreftcellelinje A-498. Englerin En behandling ikke førte til noen vesentlig økning i enzymaktivitet indikerer caspase 3 aktivering (Fig. 4
B
).
Englerin En induserer ikke caspase en cleavage
Pyroptosis er en modus for celledød forårsaket av betennelse veier. Signalering er uavhengig av apoptose-relatert effektor caspaser 3 og 7, men innebærer frigjøring av aktiv interleukin-1β mediert av caspase 1 [29], [30]. Her har vi målt caspase-1-spaltningssetet som en indikator på pyroptotic celledød. Vi fulgte dynamikken i kaspase en aktivering ved å detektere nivået av det 45 kDa pro-enzym og den 20 kDa redusert caspase en isoform etter behandling med englerin A (fig. 4
C
). Interessant nok har vi funnet at en kaspase er aktivert til et lavt nivå i begge typer av testede cellelinjer, med forskjellige ekspresjonsnivåer som er høyest i SF-295-celler og laveste i A-498-celler. Vi oppdaget små band for spaltes caspase 1 isoformer i prøver av SF-295 glioblastom celler og UO-31 nyrekreftceller. Men behandling med englerin A ikke signifikant øke nivåene av caspase en cleavage indikasjon på pyroptotic signalering. Band intensiteter for den spaltes caspase 1 fragment er tilsvarende lav. Nivåer av P45 pro-enzymet knapt endre på englerin En behandling (Fig. 4
C
)
Englerin En induserer ikke autofagi
Autophagy er en cellulær prosess der cytoplasma materiale brytes ned ved hjelp av lysosomer. Mekanismen per se er en resirkulering bane som er vanligvis forbundet med celleoverlevelse. Det er imidlertid rapportert om celler som gjennomgår en modus for celledød hvor cellene opp-regulerer autophagic signale (selv om autofagi er ikke årsaken til celledød i dette scenariet). Resultatet kalles autophagic celledød [31], [32]. Aktiveringen av autophagy kan analyseres ved å følge behandlingen av autophagic markør LC3 og dens omdannelse fra LC3 jeg isoformen til LC3 II formen som er ledsaget av en endring i molekylvekt [31]. En annen tidligere markør for autofagi er Beclin-1, som er oppregulert ved induksjon av autofagi og utløser dannelsen av autophagosomes [33], [34].
Vi er fast bestemt om englerin En behandling indusert autofagi i den eksperimentelle cellelinjer ved å følge endringer i LC3 og Beclin-1 (fig. 4
C
). Som en positiv kontroll for påvisning av LC3 II isoform vi behandlet alle cellelinjer med 50 uM klorokin (klor) i 18 timer, et stoff vist seg å arrestere autofagi ved autophagosomal trinnet som resulterer i økte nivåer av LC3 II [35], [ ,,,0],36]. Behandling med klorokin resulterte i en sterk økning av LC3 II nivået i alle testede celler. Den LC3 jeg isoform ble observert hos alle cellelinjer under alle behandlingsforhold. Imidlertid førte behandling med englerin A eller bæreren DMSO ikke resultere i en betydelig oppregulering av LC3 II. Selv om vi var i stand til å oppdage svake bånd for denne LC3 isoformer i SF-295 og UO-31 celler, nivået hvis LC3 II ikke signifikant økning på englerin En behandling (Fig. 4
C
).
Beclin-1 nivåene kan bli detektert i alle eksperimentelle cellelinjer. Laveste nivåene ble funnet i SF-295 celler, høyeste nivå i A-498 celler. Behandling med englerin A eller klorokin ikke resulterte i forskjeller i Beclin-1-nivåer i enten glioblastom eller nyrekreftceller. Englerin En ikke føre til en betydelig oppregulering av Beclin-1 uttrykk nivåer (Fig. 4
C
).
Englerin A fører til at produksjonen av reaktive oksygenforbindelser
Oksidativ belastning indusert ved overdreven produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) er en kjent faktor som forårsaker nekrotisk celledød [24]. Vi søkte derfor å analysere om englerin En medført en økning av intracellulær ROS. Vi behandlet SF-295 og A-498-celler med forbindelsen og målte totalt innhold av reaktive oksygen- og nitrogenforbindelser (fig. 5
A
).
(A) Celler ble behandlet med enten 1 uM englerin A eller bærer DMSO i 60 min. Den relative endringen i reaktivt oksygen (ROS) eller reaktive nitrogenforbindelser (RNS) sammenlignet med celler behandlet med bæreren DMSO ble målt ved bruk av den totale ROS deteksjon kit. Histogrammene viser fluorescensstyrkene i et representativt eksperiment (venstre panel). Kvantifiserte relative endringer i ROS /RNS vist (høyre panel) er gjennomsnitt ± SEM (n = 5), er statistisk signifikante forskjeller merket med stjerne (* p 0,05). (B) Celler ble behandlet med enten 1 uM englerin A eller bærer DMSO i 60 min, eller 10 uM ionomycin i 50 min. Fluo-3-binding til Ca
2 + -ioner ble målt ved en økt fluorescensemisjonen av farvestoffet ved 520 nm etter eksitasjon ved 485 nm. Histogrammene viser fluorescensstyrkene i et representativt eksperiment (venstre panel). Kvantifiserte relative endringer i intracellulære kalsiumioner vist (høyre panel) er midler ± SEM (n = 3), er statistisk signifikante forskjeller merket med stjerne (* p 0,05, *** p 0,001).
i vår studie fant englerin A ikke påvirke den relative mengden av ROS i SF-295 celler i forhold til en behandling med transportøren kontroll DMSO. Men A-498 celler reagerer sterkt på englerin A ved å produsere ROS-konsentrasjoner betydelig høyere enn i kontrollcellene. Den totale mengden av reaktive arter var omtrent 2,5 ganger høyere når A-498 celler ble behandlet med englerin A.
Englerin En induserer en økning i intracellulær Ca
2+ konsentrasjon
Kalsium har vist seg å regulere nekrotisk signalering. Overdreven tilstrømning av ekstracellulær Ca
2+ inn i cellene kan stimulere både produksjon av reaktive oksygenforbindelser og nekrotisk celledød [24]. Vi målte virkningene av englerin A på intracellulær Ca
2 + konsentrasjoner ved hjelp av kalsiumindikator Fluo-3. Dette fargestoff tillot oss å kvantifisere mengden av intracellulære kalsiumioner etter behandling med englerin A (fig. 5
B
). Den relative Ca
2+ konsentrasjonen endret seg ikke når SF-295-celler ble inkubert med englerin A. Ionomycin, en kjent induser av Ca
2+ innstrømning inn i cellen, doblet de målte ionene [37]. Behandling av A-498 nyrecancerceller med englerin En økt betydelig intracellulært kalsium til et enda høyere grad da ionomycin. Mens ionomycin doblet mengden av intracellulært kalsium, englerin A resulterte i fire ganger høyere konsentrasjoner.
Diskusjoner
Den økte forekomsten av nyresvulster hele verden presenterer et alvorlig problem [1], [ ,,,0],38]. For pasienter med nyresvulster i avanserte stadier, effektive kjemoterapeutika er knappe og brukte narkotika som Sunitinib har blitt assosiert med alvorlige bivirkninger [9]. Jakten på nye behandlingsformer har derfor fokusert på behandlinger som ikke bare er effektivt i bekjempelse av svulster, men også spesifikke nok til å ikke skade ikke-kreftceller og for å unngå uheldige bivirkninger. Den naturprodukt englerin A er et stoff som potensielt passer disse kriteriene. Den høye selektivitet og potens mot nyrekreftceller setter den i fokus for mange forskningsmiljøer. Men lite er kjent om dens virkemåte, i tillegg rettet mot disse cellene med en høy spesifisitet [10]. For å fullt ut vurdere englerin En bruk som en terapeutisk agent og å forutse mulige bivirkninger er det nødvendig å forstå mekanismen som forbindelsen påvirker nyrekreftceller.
Her viser vi for første gang hvordan englerin A dreper nyrekreftceller. Viktigere, vi rapporterer også at englerin A er faktisk spesifikt for kreftnyreceller og påvirker ikke normale nyreceller. Når det gjelder virknings, fant vi at englerin En induserer en nekrotisk form for celledød i de sensitive cellene. Apoptotiske markører som fosfatidylserin eksternalisering, effektor caspaseaktivering eller PARP cleavage er ikke oppregulert etter behandling med englerin A. Plasma membran permeabilization skjer raskt og celler danner ikke apoptotiske legemer. Samtidig Autophagy nivåer ikke er påvirket av behandlingen og forbindelsen synes ikke å indusere pyroptosis-lignende prosesser. Imidlertid modusen av celledød innbefatter en øket produksjon av reaktive oksygenforbindelser og økende nivåer av intracellulære kalsiumioner, enten som en del av nekrotisk signalering eller et resultat av dette.
Styrken av en forbindelse er et viktig mål for sin kvalifisering som et rusmiddel. Halvparten av maksimal hemmende konsentrasjoner (IC
50) i det nanomolare området eller lavere, er ønskelig.
