Abstract
Mekanismen bak tid og rom kontroll av kreft celle dynamikk og dens mulige tilknytning til cellevekst har ikke vært godt etablert. Ved å utnytte den intraavbildningsteknikk, fant vi at kreft cellemotilitet og invasive egenskapene var nært knyttet til cellesyklusen.
In vivo
inokulering av menneskets tykktarm kreft celler som bærer fluorescens ubiquitinering basert cellesyklusen indikator (Fucci) viste en uventet fenomen: S /G2 /M celler var mer bevegelige og invasiv enn G1 celler. Microarray-analyser viste at
Arhgap11a
, en uncharacterized Rho GTPase aktiverende protein (RhoGAP), ble uttrykt i en celle-syklus avhengig måte. Ekspresjon av ARHGAP11A i kreftceller dempes RhoA-avhengige mekanismer, som stress fiberdannelse og fokal adhesjon, noe som gjorde at cellene mer tilbøyelige til å migrere. Vi viste også at RhoA undertrykkelse av ARHGAP11A indusert styrking av relativ Rac1 aktivitet, noe som fører til en økning i de invasive egenskaper. RNAi-baserte hemming av Arhgap11a redusert invasjonen og
in vivo
utvidelse av kreft. I tillegg analyse av humane prøvene viste betydelig oppregulering av
Arhgap11a
i tykktarm kreft, som ble korrelert med kliniske status invasjon. Denne studien antyder at ARHGAP11A, en cellesyklus avhengig RhoGAP, er en kritisk regulator av kreft celle mobilitet og er derfor et lovende terapeutisk mål i invasiv kreft
Citation. Kagawa Y, Matsumoto S, Kamioka Y, Mimori K, Naito Y, Ishii T, et al. (2013) Cell Cycle-Dependent Rho GTPase aktivitet Dynamisk Regulerer Cancer Cell motilitet og invasjon
In Vivo
. PLoS ONE 8 (12): e83629. doi: 10,1371 /journal.pone.0083629
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 29 august 2013; Godkjent: 05.11.2013; Publisert: 30.12.2013
Copyright: © 2013 Kagawa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Grants-i-Aid for Scientific Research på innovative områder (22113007), etter det første programmet fra departementet for utdanning, vitenskap, sport og kultur fra Japan, med tilskudd fra det internasjonale menneskerettighets Frontier Science Program (RGY0077 /2011) ; og med tilskudd fra Takeda Science Foundation, Cell Science Research Foundation, Kanae Stiftelsen for fremme av medisinsk vitenskap, og Nakajima Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ubegrenset ekspansjon på grunn av ukontrollert cellesyklusprogresjon og økt penetrasjon inn i normal nabomiljø er en formidabel og livstruende aspektet av kreftceller. Faktisk har regulering cellesyklus vært en viktig problemstilling innen kreftcellebiologi.
I tillegg har kreft svært dynamiske egenskaper, inkludert invasjonen av omkringliggende vev, infiltrasjon av systemisk sirkulasjon, og banebrytende av en ny «nisje» for kolonisering langt fra sin opprinnelse [1], [2]. Selv om faktorene for kreftcellemobilisering, slik som Rho familie små G-proteiner, er blitt grundig studert [3], blir forbindelsen mellom cellesyklusregulering og celle bevegelighet av kreftceller uklar. For å belyse dette dynamiske samspillet vil det være verdifullt å observere tid og rom egenskaper av cellesyklusregulering og celle mobilitet samtidig
in vivo
.
Nylig ble intra multiphoton mikros ansatt for å dissekere intakt celle fenomener forskjellige biologiske systemer, for eksempel immunresponsen [4], [5], inflammatoriske reaksjoner [6], og benremodellering [7]. Denne avanserte avbildningsteknikk har gjort oss i stand til å forstå de dynamiske atferd av levende celler i vev og organer. Kreftceller er også svært mobile og deres trekkende atferd har blitt evaluert ved hjelp av denne avbildningsteknikk [8] -. [10], selv om dens korrelasjon med proliferativ natur celler forblir unnvikende
Her har vi lyktes i å visualisere dynamisk hendelser i kreftcelle invasjon og metastasering ved hjelp av intra multiphoton mikroskopi. Ved hjelp av fluorescerende ubiquitinering basert cellesyklusen indikator (Fucci), et spesielt fluorescerende protein sonden som brukes for å overvåke cellesyklus i levende celler, identifiserte vi en nær sammenheng mellom cellesyklusen og mobilisering egenskapene til kreftceller.
Resultatene
Dynamisk visualisering oppdager cellesyklus-assosiert kreft celle mobilisering og invasjon
in vivo
Vi utnyttet intra multiphoton mikroskopi og Fucci teknologi [11] for å studere celle syklus og migrasjon i et levende system. I denne Fucci system, Geminin (GMNN), en kjernefysisk protein anriket på S /G2 /M faser, og Cdt1, beriket i G1 fasen, ble henholdsvis merket med klima og rød-fluorescerende proteiner (Figur 1A,
øvre
panel). Fucci-uttrykke HCT116 humane invasive tykktarm kreft celler (figur 1A,
lavere
panel) ble inokulert i cecum eller subkutane vev av et redusert immunforsvar NOD /SCID mus [12] – [14]. Fire uker etter implantering, ble svulster observert intravitally. Vi fortrinnsvis oppdaget S /G2 /M-fase Fucci-grønne celler langs marginale områder av kreft invasjon hoder etter podet inn i cecum veggen (figur 1B). Lignende fordelings endringer i Fucci-grønne og -Red cellene ble oppdaget når kreftcellene ble podet inn i mesenteriet eller kolon veggen (figur S1). Fortrinns fordeling av kreft celler i S /G2 /M faser ble også observert i kirurgisk resected humane tarmkreft prøver (Figur S2). Kreftceller på invasjons hoder ble fortrinnsvis farget med antistoffer mot GMNN [15], [16] sammenlignet med de i ikke-tumor regioner eller kreftsentre.
(A) Etablering og analyser av HCT116 tykktarm kreft celler stabilt uttrykke Fucci. (
Øvre
) Et Fucci Systemet muliggjør overvåkning av cellesyklusen i levende celler i sanntid. Kjerner av celler i G1 /G0, tidlig S, og S /G2 /M-fasene er merket rødt, gult og grønt, respektive. (
Nedre
) Snapshots av Fucci-uttrykker HCT116-celler. Skala barer representerer 20 mikrometer. (B) intra multiphoton avbildning av Fucci-positive HCT116-celler podet inn i NOD /SCID-mus. (
Venstre
) En representant bilde av Fucci-uttrykker HCT116-celler implantert i cecum (grønn: Fucci-grønn (MAG), S /G2 /M; red: Fucci-red (mKO2), G1, blå : kollagenfibre (andre harmoniske generasjon (SHG) imaging)). Skala barer representerer 75 mikrometer. (
Høyre
) Kvantifisering av antallet Fucci-grønne og -Red HCT116-celler i ulike områder av inokulert svulster. Sentrale og kantsoner ble definert som områder lenger eller nærmere enn 75 mikrometer fra grensen mellom tumor og normalt vev, henholdsvis. (C) Representative bilde på kanten av en Fucci-uttrykk HCT116 tumormassen. Hele området (
venstre
) og en tidsserie (
høyre
) av forstørrede bilder (ett per 400 s) av kreftceller invadere interstitium (grønn: Fucci-grønn (MAG), S /G2 /M; red: Fucci-red (mKO2), G1, blå. kollagenfibre (SHG bildebehandling) (se også Movie S1) Faktiske bilder (
øvre
paneler) og celle baner (
lavere
paneler) er vist. Scale søylene representerer 100 mikrometer (
venstre
) og 10 mikrometer (
midt
). (D) representant bilde av extravasating Fucci-uttrykker HeLa-celler. hele området (
venstre
) og en tidsserie (
høyre
) av forstørrede bilder av kreftceller extravasating fra blodårer (en per 12 min) (grønn: Fucci-grønn (MAG) , S /G2 /M; red: Fucci-red (mKO2), G1, blå: kollagenfibre (SHG bildebehandling) (se også Movie S2) Faktiske bilder (
øvre
paneler) og celle baner (
senke
paneler) vises Scale søylene representerer 100 mikrometer (
venstre
) og 10 mikrometer (
høyre
) (E) Cellular motilitet i Fucci-grønn-og. – rød-positive celler ble målt til 4 t (se også Movie S3). (
Venstre
) Grønne og røde kuler representerer Fucci-klima- og -rød-positive celler, henholdsvis, og gule linjer viser de tilhørende baner. Skala barer representerer 100 mikrometer. (
Høyre
) Mean sporing hastigheter på Fucci-klima- og -rød-positive celler. Data (n = 379 for Fucci grønn og n = 259 til Fucci rød) ble oppnådd fra individuelle celler i tre uavhengige forsøk. Hastighetene for de to gruppene ble sammenlignet med Mann-Whitney
U
-test (p = 0,0191). Median og interkvartilt områder for hver gruppe er kledde på dot tomter.
Deretter undersøkte vi de dynamiske egenskapene til kreftceller
in vivo
. Fucci-uttrykke HCT116 kreftceller var svært mobil ved inokulasjon i subcutaneous vev, og noen kreftceller var aktivt invaderende, ser ut til å «dykke» i det omkringliggende interstitium under avbildning time-kurs (figur 1C, Movie S1). Spesielt, nesten alle dykke cellene var grønne (figur 1C,
pilspisser
), kanskje noe som tyder på at kreft celle motilitet og invasjon være avhengig av cellesyklusen. Videre kan vi oppdage sin migrasjonsbevegelser i løpet av ekstravasasjon for metastasering (figur 1D; Movie S2). Noen celler ble funnet å migrere ut fra kreftcelleaggregater som sitter fast i blodårer, og disse var også alle grønne. En viss periode med observasjon (i opp til 2 timer) av tumor sentrale regioner resulterte i fangst av basale svak oppførsel, så vel som streaming bevegelse med blodstrømmen, av forskjellige kreftcelletyper, noe som tillot oss å avbilde et tilstrekkelig antall celler for kvantifisering (figur 1D; Movie S3). Detaljerte statistiske analyser av celle relativ hastighet tydelig vist at grønne kreftceller (i S /G2 /M fase) har betydelig høyere bevegelighet enn røde G1 celler (gjennomsnittlig relativ hastighet 1,39 ± 0,08 um /min for Fucci-grønn vs. 1,09 ± 0,06 mikrometer /min for Fucci-rød; p = 0,00191) (figur 1E). Vi har bekreftet at en viss intravital imaging (opp til tre timer) ikke påvirker mobiliteten av kreftceller (figur S3). Ved å spore individuelle celler i løpet av en periode av tid, utelukket vi muligheten for at en slik bevegelighet endring i S /G2 /M-fasene reflekteres bevegelse om cytokinese. Disse resultatene indikerer at visse molekyler fortrinnsvis uttrykt i S /G2 /M Fucci-grønn faser lette migrasjon og invasjon av kreftceller.
Identifikasjon av ARHGAP11A som en cellesyklusavhengig mobilitet-kontrollerende molekyl
for å belyse det molekylære grunnlaget for kontroll av cellesyklus avhengige motilitet, utførte vi cDNA microarray-baserte komparative analyser blant Fucci-grønne og -Red celler dyrket
in vivo plakater (Figur 2A). I microarray analyse, 2032 sonder (1,656 gener) viste to fold endringer i uttrykk (figur 2B, Tabell S1). Som forventet, de fleste av disse genene koder for proteiner forbundet med celledeling og mitose. Basert på genet ontologi kategorier, hentet vi gener relatert til cellulær bevegelse fra 1,656 kandidater og funnet ut at en uncharacterized Rho GTPase aktiverende protein (RhoGAP),
Arhgap11a
, ble fortrinnsvis uttrykt i grønn S /G2 /M fase kreftceller (figur 2B, Tabell S1). Alle de tre prober for
Arhgap11a
genet ble høyt rangert (5., 12., og 41.) blant 2,023 sonder. Det har blitt vist at Rho familien små G-proteiner, slik som Rho, Rac, og Cdc42, og deres regulatoriske molekyler, slik som RhoGAP, samvirkende styre cellular motilitet i både normale celler og kreftceller [17] – [21]. Fortrinns uttrykk for
Arhgap11a
i Fucci-grønne celler ble bekreftet på både mRNA (Figur 2C) og proteinnivåer (figur 2D). I tillegg demonstrerte vi en tidsavhengig gradvis økning i
Arhgap11a
ekspresjon under progresjon gjennom cellesyklusen fra G1 til S /G2 /M (figur 2E, figur S4), for å styrke det konseptet at
Arhgap11a
ekspresjon blir kontrollert i et cellesyklusprogresjon-avhengig måte. Cellesyklusavhengig ekspresjon av Arhgap11a ble også påvist i andre koloncancercellelinjer foruten HCT116, slik som DLD1, HT29 og KM125M (figur 2F) og HeLa (fig S5) så vel som i ikke-cancercellelinjer så som HEK293-celler ( fig S6), noe som tyder på tilstedeværelsen av en generell mekanisme for dette karakteristiske uttrykk regulering av
Arhgap11a
i mange celletyper. Til belysning av mekanismen som ligger under cellesyklusavhengig ekspresjon av Arhgap11a, undersøkte vi ytterligere transkripsjonen kontroll av dette genet. E2F familietranskripsjonsfaktorer er dokumentert å fungere i en cellesyklus-avhengig måte [1]. Vi la merke til at en antatt E2F-bindende sekvens (TTTCGCGC) [23] ble plassert på -27 til -20 basepar fra transkripsjonsstart stedet Arhgap11a. Kromatin immunoutfelling (chip) eksperimenter demonstrerte direkte tilknytning av E2F1 med den regionen (figur 2G), som kan være involvert i cellesyklusavhengig transkripsjonen aktivering av dette locus. En luciferase reporter-analyse viste E2F1 avhengig transkripsjonen aktivering av Arhgap11a promoteren, som ble blokkert ved assosiasjon med Rb-proteinet (figur 2 H), noe som tyder på en mulig rolle av E2F /Rb-baner i den transkripsjonelle regulering av Arhgap11a. Vi realisere involvering av andre transkripsjonsfaktorer siden Arhgap11a ble vesentlig uttrykt også i G1 fasen (figur 2D), selv om vi kan anta Rb /E2F veien ville være minst ansvarlig for økningen i Arhgap11a uttrykk i S-fasen.
(A) Fucci signal-baserte mikromatriseanalyser. Fucci-positive HCT116-celler ble separert i Fucci-grønn (MAG) – og Fucci-red (mKO2) – positive celler ved FACS. mRNA ble ekstrahert fra disse cellene, og sammenlignet med microarray analyse (to dye-swap eksperimenter, noe som gir fire uavhengige mikromatriseanalyser). (B) Totalt 2,023 sonder (1,656 gener) viste To gangers endringer i uttrykk (tabell S1) (P 0,05). Av dem,
Arhgap11a
var høyt rangert, og alle tre prober for
Arhgap11a
var blant de topprangerte prober for RhoGAPs. De tre sonder var spesifikke for de angitte potions av
Arhgap11a
mRNA (
forlot
). De tre markerte prikker (# 1, # 2, # 3) i spredningsplott representerer kaste endringer (
midt
). (C) Cellesyklus avhengig uttrykk for
Arhgap11a
mRNA ble bekreftet av qPCR. Uttrykket data ble normalisert til
GAPDH product: (n = 3). (D) Cellesyklus avhengig uttrykk for
Arhgap11a
proteiner. (
Høyre
) Flowcytometrisk analyser av Fucci-uttrykker HCT116-celler. Cellesyklus profiler var fargekodet: G1, rød; tidlig S, gul; og S /G2 /M, grønn (
øverst til høyre
). DNA-innholdet ble målt ved fluorescens Hoechst33342 av (
nederst til høyre
), noe som bekrefter at Fucci signaler som nøyaktig representerer cellesyklusnivå (n = 3). (
Venstre
) Cellesyklus avhengig uttrykk for ARHGAP11A og cellesyklus markører, som bestemmes av Western blotting (n = 3). (E) Tidsavhengig uttrykk for
Arhgap11a
under progresjonen av cellesyklusen fra G1 til S /G2 /M. Fucci-rød (mKO2) -positive HCT116-celler ble sortert ved hjelp av en FACSAria cellesorterings og ble dyrket i de angitte tidsperioder. Flowcytometri analyser (
øvre
) og forholdstall på Fucci farger (
forlot
) er vist for hvert tidspunkt. (
Høyre
) Relativ uttrykk for
Arhgap11a
ble undersøkt av qPCR (n = 6). Data ble analysert ved enveis ANOVA (
p
= 0,0001) og Bonferroni multippel sammenligningstest (***
p
0,01). (F) Cellesyklus avhengig
Arhgap11a
uttrykk i ulike menneskelige tykktarmskreft cellelinjer. Fucci ble introdusert i ulike menneskelige tykktarmskreft cellelinjer (HCT116, DLD1, HT29, og KM12SM). I alle cellelinjene,
Arhgap11a
uttrykk var betydelig høyere i S /G2 /M (
grønn
) enn i G1-celler (
rød
). (G) En kromatin immunoprecipitation (chip) analysen med et anti-E2F1 antistoff viste at E2F1 bundet til den antatte E2F-bindingssetet i
Arhgap11a
promoter (n = 3). (H) Luciferase reporter analysen av
Arhgap11a
promoter-regionen (-500 bp), inkludert E2F-bindingssetet (GTTTCGCGC) ved -20 bp fra transkripsjon utgangspunkt. Co-transfeksjon med E2F1 forbedret transkripsjonen aktivitet, mens samtidig ekspresjon av RB-blokkerte det. Verdier for luciferase-aktiviteten ble normalisert på tvers av hvert eksperiment og, for å kontrollere for forskjeller i transfeksjonseffektivitet, p-galaktosidase.
ARHGAP11A er en GTPase-akselererende protein for Rho, men ikke for Rac eller Cdc42, og hemmer Rho-avhengige cellular fenomener
ARHGAP11A hadde allerede blitt klonet og oppført i en NCBI database, men det molekylære funksjon hadde ennå ikke blitt karakterisert. Spesielt var det uklart om sin antatte GAP domene faktisk utøver en GTPase akselererende effekt. For å bestemme dens funksjon, isolerte vi Halo-merket ARHGAP11A (eller Halo-Tag bare som en kontroll) uttrykt i HEK293-celler (figur 3A), og inkubert det
in vitro
med flere Rho familie proteiner, så som RhoA , Rac1, og Cdc42 (figur 3B). I denne analysen, målte vi GAP-aktivitet ved å detektere uorganisk fosfat frigjøres på grunn av GTP-hydrolyse av Rho-proteiner [24]. Denne cellefrie in vitro-analysen viste at ARHGAP11A sterkt akselerert GTP hydrolyse av RhoA, men ikke den av Rac1 eller Cdc42 (figur 3B). Mengden av aktive former for Rho familie proteiner ble også vurdert av pull-down analysen med GST-Rhotekin (for Rho) eller GST-CRIB (for Rac og Cdc42) i HEK293 celler [25]. Transfeksjon av ARHGAP11A reduserte mengder av aktive RhoA, RHOB, og RhoC, men ikke fra Rac1 eller Cdc42 (Figur 3C). Vi bekreftet også at dette RhoGAP aktivitet ble i hovedsak avskaffet når det antatte GAP domenet ble slettet (figur 3D). Disse resultatene klart bekrefter at ARHGAP11A er en GAP spesifikk for Rho, men ikke for Rac eller Cdc42, hvis effekten er mediert av sitt spådd GAP domene.
(A) Halo-Tagged ARHGAP11A og Halo-Tag proteiner uttrykt og renset fra HEK293 celler. (B) Påvisning av GTPase aktivitet ved å tallfeste uorganisk fosfat utgitt av GTP hydrolyse av Rho familien proteiner. ARHGAP11A forbedret GTPase aktivitet RhoA, men ikke fra Rac1 eller Cdc42. (C) Påvisning av aktive og totale former av ulike Rho-familien proteiner (RhoA, RHOB, RhoC, Rac1, og Cdc42) i HEK293 celler transfektert med Halo-ARHGAP11A eller kontroll. Uttrykk for ARHGAP11A reduserte mengder av de aktive formene av RhoA, RHOB, og RhoC. (D) Vurdering av mutant ARHGAP11A uten den antatte GAP domene (ΔGAP).
Aktiv RhoA er blitt vist å stimulere fokal adhesjon og stress fiberdannelse ved aktivering av Rho-assosiert proteinkinase (ROCK) og /eller mDia (figur 4A) [26]. Concordantly, eksogene uttrykk for konstitutivt aktiv RhoA (RhoA-Q63L) [27] i HCT116-celler indusert avvikende økninger i F-aktin stresset fiber og fokale vedheft formasjon, visualisert ved hjelp av paxillin tilslag (Figur 4B). I motsetning til undertrykkelse av Rho-aktivitet ved CT04 (1 pg /ml), er en potent inhibitor Rho [28], reduseres dannelsen av stress fibre og fokal adhesjon (figur 4C). Under disse eksperimentelle forhold, ekstra uttrykk for ARHGAP11A betydelig hemmet dannelsen av både F-aktin stress-fibre (figur 4D,
midten
panel, og 4E) og fokale sammenvoksninger (figur 4D,
midt
panel, og 4F). Ekspresjon av ARHGAP11A også reduserte nivået av fosforylert myosin lettkjede (pMLC) (fig S7). I sammendrag, ARHGAP11A, som en RhoGAP, trykt Rho-avhengige fenomener, slik som fokal adhesjon og stress fiberdannelse, i HCT116 kreftceller. Vi har også bekreftet funksjon av ARHGAP11A i HeLa-celler (figur 4G-I).
(A) Skjematisk illustrasjon av RhoA-medierte cellulære reaksjoner. (B) Effekt av overekspresjon av vill-type (WT) eller konstitutivt aktiv (Q63L) RhoA på dannelsen av F-aktin stress-fibre (visualisert ved hjelp av Alexa 568-phalloidin) og fokale sammenvoksninger (farget med anti-paxillin). GFP ble ko-transfektert til å identifisere de transfekterte celler. Skala barer representerer 15 mikrometer. (C) Virkning av CT04, en potent inhibitor RhoA, på dannelsen av F-aktin spennings fibre (visualisert ved hjelp av rhodamin-phalloidin) og fokal adhesjon (farget med anti-paxillin). Kjerner ble farget med DAPI. Skala barer representerer 15 mikrometer. (D) Effekt av overekspresjon av Halo-Tagged ARHGAP11A eller dens kontroll på dannelsen av F-aktin stress-fibre (visualisert ved hjelp av Alexa 568-phalloidin) og fokale sammenvoksninger (farget med anti-paxillin) i HCT116 cellene. Pilspisser identifisere Halo-Tag-uttrykke celler (merket med Oregon grønn-konjugert Halo-Tag ligand). Skala barer representerer 10 mikrometer. (E) Kvantifisering av midlere intensitet av F-aktin i Halo-kontroll (n = 80) og Halo-ARHGAP11A-uttrykkende (n = 80) HCT116-celler. Data ble samlet fra tre uavhengige forsøk. (F) Kvantifisering av fokale sammenvoksninger i Halo-kontroll (n = 80) og Halo-ARHGAP11A-uttrykke (n = 80) HCT116-celler. Data ble samlet fra tre uavhengige forsøk. (G) Effekt av overekspresjon av Halo-Tagged ARHGAP11A eller dens kontroll på dannelsen av F-aktin stress-fibre (visualisert ved hjelp av Alexa 568-phalloidin) og fokale sammenvoksninger (farget med anti-paxillin) i HeLa celler. Pilspisser identifisere Halo-Tag-uttrykke celler (merket med Oregon grønn-konjugert Halo-Tag ligand). Skala barer representerer 10 mikrometer. (H) Kvantifisering av midlere intensitet av F-aktin i Halo-kontroll (n = 80) og Halo-ARHGAP11A-uttrykkende (n = 80) HeLa-celler. Data ble samlet fra tre uavhengige forsøk. (I) Kvantifisering av antall fokal adhesjon i Halo-kontroll (n = 40) og Halo-ARHGAP11A-uttrykkende (n = 46) HeLa-celler. Data ble samlet fra tre uavhengige eksperimenter.
ARHGAP11A stimulerer kreftcelle motilitet ved å styrke Rac aktivitet
Cell bevegeligheten er kjent for å være gjensidig regulert av diverse Rho familien små G-proteiner [29] . Mens aktiv RhoA (eller Rho eller RhoC) stabiliserer cytoskeletons ved å forbedre spenning fiber og fokal adhesjonsdannelse, aktivering av Rac1 (eller Cdc42) gjør cellene fleksibel og mobil, som fører til dannelse av lamellipodia eller filopodia [29]. Virksomheten i de motvirkende proteiner RhoA og Rac1 er gjensidig kontrollert [30], og hemming av ett resultater i forhold styrking av den andre (figur 5A). Her, ved hjelp Raichu-Rac1, en FRET basert biosensor av Rac1 aktivitet ved encellede nivå [31], [32] undersøkte vi Rac1 aktivitet i HCT116 cellene. Rac1 aktivitet var signifikant høyere i ARHGAP11A-uttrykke celler sammenlignet med mock-transfektert (transfektert med Halo-Tag) eller ikke-transfekterte celler (Figur 5 B og C), noe som tyder på at mekanismen som undertrykkelse av Rho aktivitet fører til motparten aktivering av Rac1 ved enkeltcellenivå. Lignende ARHGAP11A-mediert aktivering av Rac1 ble også observert i HeLa-celler (figur S8).
(A) Skjema representerer balansen mellom RhoA og Rac1 for cellemigrasjon. (B) Analyser av Rac1 aktivitet på enkeltcellenivå i HCT116-celler som uttrykker Halo-ARHGAP11A eller dens Halo kontroll. Representative bilder av Raichu-Rac1-uttrykker HCT116 cellene under Halo-kontroll (
venstre
) eller Halo-ARHGAP11A transfeksjon (
høyre
) betingelser. Rac1 aktivitet ble overvåket av CFP /YFP FRET Nøkkeltall hentet fra Raichu-Rac1. Uttrykk for Halo-Tag ble identifisert med TMR-konjugert Halo-Tag ligand. Målestokk representerer fem mikrometer. (C) Kvantifisering av FRET forholdstall i Halo-kontroll (n = 30) og Halo-ARHGAP11A-uttrykke (n = 30) HCT116-celler. (D) Tredimensjonal kultur HCT116 transfektert med Halo-kontroll eller Halo-merket ARHGAP11A, supplert med Y27632 (for Halo-kontroll bare). Målestokk representerer 50 mikrometer. (E) proporsjoner av runde typen HCT116 i 3D kultur transfektert med Halo-ARHGAP11A eller Halo-kontroll. Rund-type celler ble tellet i tre visuelle felt for hver av de tre uavhengige eksperimenter. Kolonnene representerer gjennomsnitt ± S.E.M. (F)
In vitro
invasjon analysen bruker 3D Matrigel plate. Migrerte celler ble visualisert ved farging kultur membran med Diff Quik flekk (Dade Behring). HCT116 transfektert med Halo-ARHGAP11A eller Halo-kontroll, og villtype HCT116 behandlet med Y27632 ble anvendt i analysen. (G) Kvantifisering av invasjons indekser fra 3D Matrigel plate analyser. Invasjons indekser ble beregnet i henhold til ligningen vist i Metode delen. Kolonner representerer gjennomsnitt ± standardavvik
Deretter undersøkte vi effekten av Rho hemming av ARHGAP11A om kontroll av kreftcelle morfologi og mobilitet. For å analysere de morfologiske egenskapene til kreftceller, vi en brukt tre-dimensjonale (3D) Matrigel kultursystem (figur 5 D og E) [33]. I resultatene, over-uttrykk for ARHGAP11A førte til spindel-lignende figurer av HCT116 cellene, som representerer en invasjon utsatt fenotype. Lignende morphogenic endringer kan også observeres når Rho-mediert signalisering ble hemmet av Y27632, en potent ROCK hemmer [34]. Vi videre målte
in vitro
trekkende egenskaper HCT116 celle i 3D Matrigel plater (Figur 5 F og G) [35], og concordantly, overekspresjon av ARHGAP11A eller Y27632 behandling økt migrasjon av HCT116
in vitro
. På den annen side, sterk hemming av Rho-aktivitet ved høy konsentrasjon av Y72632 blokkert migreringen (data ikke vist). Disse resultatene tyder klart på at tilstrekkelig grad av RhoA hemming som oppnås ved overekspresjon av ARHGAP11A forbedret trekkfugl aktivitet av HCT116 kreftceller.
Funksjonell virkningen av ARHGAP11A på mobilisering av HCT116 humane tykktarmskreftceller
in vivo
og muligheten for ARHGAP11A som et terapeutisk mål i invasiv kreft
for å analysere funksjonen til ARHGAP11A, genererte vi HCT116 cellelinjer som ARHGAP11A uttrykk ble stabilt redusert med shRNA (SH). Redusert ekspresjon av ARHGAP11A ble bekreftet ved både mRNA (figur 6A) og protein (figur 6B) nivåer. En BrdU spredning analysen viste ingen forskjeller mellom kontroll- og SH celler, noe som tyder på at ARHGAP11A ikke påvirker celle iboende spredning
in vitro plakater (figur 6C). På den annen side, en
in vitro
celle invasjon analysen med en Matrigel plate viste at invasjonen egenskaper var signifikant redusert i SH-celler (figur 6D). Neste vi undersøkt hvilken rolle ARHGAP11A i
in vivo
motilitet av inokulerte kreftceller. Ved å bruke intra multiphoton bildeteknikker, vi viste at SH cellene var mindre bevegelige enn kontrollcellene i subkutant inokulert svulster, som klart ARHGAP11A regulerer motilitet av HCT116 kreftceller in vivo (figur 6E, Film S4). Vi fant også at SH cellene var mindre i stand til å vandre ut fra blodårer enn var kontrollceller under bloduttredelse av blod-resident kreftceller (Figur 6F). Til slutt undersøkte vi hvilken rolle ARHGAP11A i svulstvekst
in vivo plakater (figur 6G). ARHGAP11A-knockdown SH-celler utviste mindre progresjon på dag 28, sammenlignet med villtype-celler (SH # 1, 6,47 ± 0,33 mm; SH # 2 6,66 ± 0,32 mm; vill-type, 9,76 ± 0,82 mm; og SH-kontroll, 9.38 ± 0,97 mm).
(A) Etablering av ARHGAP11A-knockdown HCT116-cellelinjer (SH # 1, # 2). Redusert ARHGAP11A mRNA uttrykk ble bekreftet av qPCR. (B) ARHGAP11A protein uttrykk i kontroll og SH-knockdown HCT116-celler ble undersøkt ved Western blotting. (C) BrdU proliferasjonsanalyse av disse HCT116-cellelinjer. Kolonner representerer gjennomsnitt ± standardavvik (D)
In vitro
invasjon analysen bruker 3D Matrigel kulturplater. Kolonner representerer gjennomsnitt ± standardavvik (E)
In vivo
funksjonelle analyser av ARHGAP11A-knockdown HCT116-celler. Representative bilder av kontroll (
grønn
) og ARHGAP-knockdown (
rød
) HCT116-celler inokulert subkutant i NOD /SCID mus (
øvre
). En rå «fusjonert» image og bilder hentet fra de grønne og røde kanaler som skal vises. Celle motilitet ble målt etter 7 timer. Grønne og røde sirkler representerer kontroll og ARHGAP11A-knockdown SH # 1 HCT116 cellene, henholdsvis, og gule linjer viser sine baner (se også Movie S4). Målestokk representerer 50 mikrometer. (
Nedre
) Mean sporing hastigheter på kontroll og SH celler. Data (n = 440 for kontroll og n = 215 til SH 1 #) ble oppnådd fra individuelle celler i to uavhengige eksperimenter. Hastighetene for de to gruppene ble sammenlignet med Mann-Whitney
U
-test (p = 0,0034). Median og interkvartilt områder for hver gruppe er kledde på dot tomter. (F) Ekstravasasjon av kontroll (
grønn
) og SH # 1 (
rød
) HCT116-celler. (
Venstre
) Grønne celler ble fortrinnsvis påvist i ekstravaskulære områder, noe som tyder på en høy potens for ekstravasasjon. (
Høyre
) Gjennomsnittlig antall ekstravasert celler per synsfelt. Data ble hentet fra 10 synsfelt. (G) In vivo tumor ekspansjon av HCT116-celler. Wild-type kontroll HCT116-celler (
sorte
sirkler) og HCT116-celler behandlet med egge kontroll shRNA (
sorte
firkanter), SH # 1 (
røde
sirkler), og SH # 2 (
røde
firkanter) blir vist. Kreftceller (1,0 × 10
6/100 mL PBS) ble primært inokulert i subcutaneous vev. Tumorstørrelsene ble målt hver uke i 4 uker etter inokulering. Data representerer gjennomsnitt ± S.E.M. av fem uavhengige eksperimenter. Data ble analysert ved toveis ANOVA (
p
= 0,0037). (H) Redusert uttrykk for ARHGAP11A i HCT116 cellene behandlet med sirnas målgruppe ARHGAP11A (vurdert ved qPCR). (I)
In vivo
siRNA behandling av HCT116 svulster. Kontroll HCT116-celler (5,0 × 10
6) ble implantert i NOD /SCID-mus, og en uke senere ble behandlet med PBS (
svart fylt
sirkler), atelokollagen (
svart fylt
trekanter), egge kontroll siRNA pluss atelokollagen (
svarte fylt
firkanter), eller to sirnas (# 1 og # 2) mot ARHGAP11A pluss atelokollagen (
rød åpne
sirkler og firkanter, henholdsvis). Tumor størrelser ble målt ukentlig. Data representerer gjennomsnitt ± S.E.M. av fem uavhengige eksperimenter. Data ble analysert ved toveis ANOVA (
p
= 0,0001). (J) Bilder av tumorer skåret på dag 35 (
forlot
). Målestokk representerer 10 mm. (
Høyre
) En representative bilder av SCID-mus med HCT116 humane tykktarm kreft celler, 35 dager etter behandling med en siRNA (siRNA 1 #) eller med en egge RNA duplex (kontroll), sammen med atelokollagen. Målestokk representerer 10 mm.
Neste, vi evaluert potensialet for ARHGAP11A som en roman terapeutisk mål for hemming av kreft progresjon.
