Abstract
leppe- og ganespalte transmembranprotein 1-Like (CLPTM1L), ligger i en region av kromosom 5 som kopiantall vinning har vist seg å være den hyppigste genetiske hendelse i de tidlige stadiene av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Dette locus har blitt funnet av flere genome wide association studier for å bli assosiert med lungekreft i både røykere og ikke-røykere. CLPTM1L har blitt identifisert som en overuttrykt protein i humane ovarie tumorcellelinjer som er resistente overfor cisplatin, som er den eneste innsikt så langt inn i funksjonen av CLPTM1L. Her finner vi CLPTM1L uttrykk økes i lunge adenokarsinomer i forhold til tilpasset normale lungevev og i lungetumorcellelinjer av mekanismene ikke eksklusive kopiere nummer gevinst. Ved tap av CLPTM1L akkumulering i lungetumorceller, ble cisplatin og camptothecin indusert apoptose økes i direkte proporsjon med nivået av CLPTM1L knockdown. BCL-xL akkumulering ble betydelig redusert ved tap av CLPTM1L. Uttrykk for eksogene BCL-xL avskaffet allergi å apoptotiske drepe med CLPTM1L knockdown. Disse resultater viser at CLPTM1L, en overuttrykt protein i lungetumorceller, beskytter mot genotoksiske spenning indusert apoptose ved regulering av Bcl-xL. Dermed impliserer denne studien anti-apoptotiske CLPTM1L fungere som en mulig mekanisme for mottakelighet for lunge tumorigenesis og motstand mot cellegift
Citation. James MA, Wen W, Wang Y, Byers LA, Heymach JV, Coombes KR, et al. (2012) Funksjonell Karakterisering av CLPTM1L som Lung Cancer Risk Kandidat Gene i 5p15.33 Locus. PLoS ONE 7 (6): e36116. doi: 10,1371 /journal.pone.0036116
Redaktør: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 13 august 2011; Godkjent: 30 mars 2012; Publisert: 04.06.2012
Copyright: © 2012 James et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842, human Protein Atlas-prosjektet, og NCI U19CA148127 stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
CLPTM1L er så kalt basert på homologi med leppe- og ganespalte transmembranprotein 1, som ble identifisert som forstyrret i en familie med leppe- og ganespalte [1]. CLPTM1L ble identifisert som en oppregulert transkripsjon i en cisplatin resistent eggstokkreft tumor cellelinje [2]. Imidlertid er tolkning av resultatene av denne undersøkelsen vanskelig, ettersom det ikke er noen innblanding av mekanisme og virkningen av overekspresjon av CLPTM1L i cisplatin følsomhet ble motstridende i forskjellige ovarie tumorcellelinjer, avhengig av deres pre-eksisterende nivå av motstand. Ikke desto mindre ble en rolle for CLPTM1L i resistens mot cisplatin foreslått. Interessant nok har de homologe CLPTM1 blitt funnet å bli uttrykt på et høyere nivå i doxorubicin-resistente brystsvulster, og ekspresjon av CLPTM1 er prediktive for respons på doksorubicin [3]. En nylig undersøkelse viser at en genetisk variant innenfor den CLPTM1L genet (rs402710) er assosiert med akkumuleringen av DNA-addukter i tumor tilstøtende lungevev [4]. Denne samme SNP, blant annet i området for CLPTM1L og tert-gener er forbundet med risikoen for lungekreft [5], [6], [7]. I en fersk undersøkelse om livmorhalskreft integrere genet dosering og uttrykk data ble CLPTM1L /TERT locus funnet å ha kopiantall gevinst i svulster og uttrykk mønstre som korrelerte med kopi nummer gain [8]. En annen fersk studie viste at med kopi nummer gevinst over 5p, ble CLPTM1L uttrykk ca. 5 ganger i livmorhalskreft cellelinjer enn normale livmorhals epitelceller, mens uttrykk av de andre genene på 5p15.33 ikke ble endret [9]. Disse innsikt i funksjon av CLPTM1L, og det faktum at kopiantall gevinst av regionen av kromosom 5p inneholder CLPTM1L er den hyppigste cytogenetisk hendelse i de tidlige stadiene av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [10] er overbevisende begrunnelse for studiet av rollen til CLPTM1L i lunge cancer, så vel som andre krefttyper.
skade DNA, slik som den som forårsakes av genotoksiske kjemoterapeutiske midler, induserer apoptose gjennom dobbelt-trådede brudd forbundet kinaser, og etterfølgende transkripsjonsregulering av apoptotiske effektorer primært gjennom p53 [11]. BCL-2 familiemedlemmer som reguleres av p53 inkludert Bax er sentrale for aktivering av apoptose av denne veien og handle etter permeabilizing mitokondrie membranen [12]. Anti-apoptotiske Bcl-2 familiemedlem BCL-XL beskytter kreftceller fra p53 indusert apoptose [13] og virker gjennom binding og inaktivering av Bax [14] og binding av proteiner som rekrutterer Bax til mitokondriemembranen [15]. Bcl-xL blir ofte overuttrykt i lungesvulster, er assosiert med dårlig prognose [16], [17], og spiller en viktig rolle i resistens mot genotoksiske kjemoterapeutiske midler i lungen og andre krefttyper [18], [19], [20] [21], [22], [23]
Selv om en forbindelse av CLPTM1L til kreft er foreslått av kopiantall gain, genom bredt forening og studier i eggstokkreft tumor cellelinjer.; funksjonen av CLPTM1L og dens rolle i tumordannelse er hittil ukjent. Her rapporterer vi at CLPTM1L er en vanlig overexpressed antiapoptotisk faktor i lungesvulster. Knockdown av CLPTM1L transkript i NSCLC-celler resulterer i en økning i følsomheten for genotoksiske spenning mediert dreping apoptotiske og reduserer ekspresjon av Bcl-xL på en måte som er avhengig av dosen av CLPTM1L uttrykk. Videre uttrykk for eksogene BCL-xL opphever allergi å gentoksisk spenning indusert apoptose av CLPTM1L knockdown. Denne beskyttende effekt er ikke eksklusivt for cisplatin mediert drap. Snarere virker CLPTM1L indirekte som en generell inhibitor for mitokondriell vei av apoptose via Bcl-xL regulering. Disse resultatene viser en rolle for CLPTM1L i kjemoterapeutisk resistens i lunge kreftceller, og foreslå en rolle for CLPTM1L i lunge tumorigenesis via beskyttelse mot apoptose gjennom økt opphopning av BCL-XL.
Resultater
Expression av CLPTM1L i lungesvulster
Gitt rapporter om kopiantall gevinst i lungekreft, GWAS bevis, og økt uttrykk av CLPTM1L i cisplatin resistente ovarietumorceller, forsøkte vi å finne ut om CLPTM1L ble overuttrykt i lungesvulster. Uttrykk av CLPTM1L mRNA hos NSCLC pasient svulster ble sammenlignet med matchet tumor tilstøtende vev ved qPCR. CLPTM1L ble økt med et gjennomsnitt på 2,24 ganger nå en samlet betydning for dette uttrykket i 30 Stage jeg NSCLC pasienter (p = 0,0028, Two-tailed t-test) (Figur 1a). Selv TERT uttrykk var i gjennomsnitt 1,76 ganger høyere i tumorvev, gjorde generelle forskjeller i TERT uttrykk ikke nå betydning og ble ikke signifikant korrelert med CLPTM1L uttrykk (r
2 = 0,0018, p = 0,994) (figur S1 A). Utvalget besto av 22 adenokarsinom og 8 plateepitelkarsinom pasienter Tabell S1 beskriver kjente karakteristikker av studiepopulasjonen. Det var ingen forskjell i tumor over-uttrykk mellom plateepitelkarsinom og adenokarsinomer (data ikke vist). Analyse av uttrykk microarray data fra 148 lungetumorcellelinjer og 59 «normale» cellelinjer udødeliggjort med TERT og Cdk4 bekreftet disse resultatene, avslører en 2,02 ganger gjennomsnittlig forskjell i CLPTM1L uttrykk i forhold til udødeliggjort cellelinjer (p = 1.48E-9, Two -endepåfestet t-test) (figur 1B). Disse data viser også at ekspresjon av CLPTM1L økes i tumorceller av andre enn kopitallet variasjon mekanismer, som analyse med unntak av disse tumorcellelinjer med kopitall variasjon forble signifikant (p = 1.28E-8, to-halet t-test) og lignende i størrelse (1,83 ganger) (figur 1C). Kopier nummer endringen var identisk mellom CLPTM1L og tert gener. Imidlertid ble ikke observert noen sammenheng mellom CLPTM1L uttrykk og TERT uttrykk innen tumorcellelinjer (r
2 = 0,0126, p = 0,175) (figur S1B). Analyse av ekspresjon ble også gjennomført for forskjellige lungetumor subtyper. Adenokarsinom cellelinjer viste en gjennomsnittlig 2,15 ganger større CLPTM1L uttrykk via vanlige immortaliserte cellelinjer (p = 3.59E-7, Two-tailed t-test) og småcellet lungekreft cellelinjer viste en gjennomsnittlig 2,07 ganger større uttrykk (p = 1,15 E-9, Two-tailed t-test) (figur 1D). Derfor synes økt CLPTM1L uttrykk for å være en funksjon av lungekreft uavhengig av subtype.
A) CLPTM1L transkripsjon opphopning målt ved qPCR i lunge adenokarsinom vev i forhold til gjennomsnittet av matchet normal tumor tilstøtende vev i 30 pasienter demonstrere en 2,23 ganger gjennomsnittlig økning i uttrykk i tumorvev. B) akkumulering CLPTM1L transkripsjon som målt ved microarray i lungetumorcellelinjer i forhold til gjennomsnittet av ikke-transformerte immortaliserte cellelinjer som viser et 2,02 gangers gjennomsnittlig økning i ekspresjon i tumorcellelinjer. C) Cellelinje uttrykk data unntatt disse kreftcellelinjer med kopi nummer variasjon demonstrere en 1,83 ganger økning i tumorcellelinjer. D) Cellelinje oppdelt i adenokarsinom-cellelinjer og småcellet lungecancercellelinjer. Svarte striper representerer gjennomsnittsverdier. p-verdier ble oppnådd ved hjelp av en to-tailed t-test.
CLPTM1L gir resistens mot Gentoksisk stress indusert apoptose i Lung tumorceller
Siden økt uttrykk av CLPTM1L er assosiert med lungesvulster, rettet vi å modulere CLPTM1L nivået i lunge adenokarsinom cellelinjer og bestemme responsen på gentoksiske stoffer. Knockdown av CLPTM1L i A549 og H838 lunge adenokarsinom-cellelinjer ble utført ved anvendelse av tre uavhengige virale vektorer shRNA og resulterte i en rekke av virkningsgrader opp til 90% som målt ved kvantitativ real-time PCR og ved immunoblot (figur 2A og B). Effekten av CLPTM1L knockdown på å drepe av cisplatin, ble bestemt i disse cellelinjene. Cellene ble telt, sådd ut i like antall på omtrent 50% konfluens, og analysert for levedyktighet ved celletelling etter 48 timer cisplatin behandling. Dreping av lungetumorceller med cisplatin ble øket ved tap av CLPTM1L på en doseavhengig måte, som strekker seg fra 53% levedyktighet i A549-celler med vektoren alene til 12% levedyktighet i celler med shCLPTM1L-3 (figur 2C). På samme måte, vi indusert apoptose i A549-celler med stabil knockdown av CLPTM1L ved hjelp av camptothecin, ble en topoisomerase I-inhibitor A549-celler sådd ut i like antall og analysert for levedyktighet ved MTS-analyse etter 48 timers behandling med camptothecin. Igjen, tap av CLPTM1L gjennom shRNA knockdown lysfølsomt lunge kreftceller til doseavhengig apoptotisk drapet på en måte som samsvarer med nivået på CLPTM1L uttrykk (figur S2), som viser at anti-apoptotiske virkninger av CLPTM1L er ikke eksklusivt for cisplatin. Lignende resultater ble observert i H838-celler, som viste økt følsomhet for camptothecin indusert dreping ved knockdown av CLPTM1L uttrykket (figur 2D). I samsvar med disse funn eksogene over-ekspresjon av CLPTM1L i H1299-celler, som var bestemt til å uttrykke relativt lave nivåer av endogen CLPTM1L transkript sammenlignet med A549-celler ved mikromatriseanalyse (data ikke vist), ført til en økning i cellelevedyktighet fra 27% til vektor alene til 36% med CLPTM1L overuttrykk (p 0,04) etter behandling med camptothecin forhold til DMSO løsemiddel kontroller (figur 2E)
A) knockdown av CLPTM1L uttrykk i A549 celler via stabil shRNA.. Bekreftelse av knockdown av western blot (innfelt). B) knockdown av CLPTM1L uttrykk i H838 celler via stabil shRNA. Bekreftelse av knockdown av western blot (innfelt). C) Relativ celleviabilitet av A549 celler med CLPTM1L knockdown etter 48 timers behandling med media eller cisplatin. D) Relativ celle levedyktighet H838 celler med CLPTM1L knockdown etter 48 timers behandling med DMSO kjøretøy eller en mikrometer camptothecin. E) Relativ celle levedyktighet H1299 celler med CLPTM1L over-uttrykk etter 48 timers behandling med DMSO kjøretøy eller 10 mikrometer camptothecin. Feilstolpene representerer ett standardavvik fra gjennomsnittet av biologiske triplikater.
Annexin V immunfluorescens detektert ved strømningscytometri ble anvendt som en markør for tidlig apoptose i A549-celler med eller uten CLPTM1L knockdown og cisplatin behandling. Vi har observert en doseavhengig økning i apoptose med tap av CLPTM1L (figur 3A). Mens bare 16% av celler med vektoren alene apoptotiske etter 10 uM cisplatin behandling i 24 timer ble 76% av celler med shCLPTM1L-3 apoptotiske. Motstand mot cisplatin-indusert apoptose ble funnet å være proporsjonal med mengden av CLPTM1L transkript akkumulering i disse cellene, med en r
2 fra 0,9808 (p = 2 x 10
-8) mellom prosent knockdown og prosent apoptotiske celler ( Figur S3A). Cisplatin konsentrasjoner ved nedre grense for sensitivitet ble brukt til å tillate oppløsning på sensitiviteter tillagt ved ulike nivåer av CLPTM1L knockdown. DNA-ødeleggende midler cisplatin og nitrosamin 4- (metyl-nitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon (NNK) begge forårsaket akkumuleringen av DNA-trådbrudd uavhengig av CLPTM1L uttrykk som registreres av COMET-metoden (figur S4) . Derfor er den observerte økningen i følsomhet tositivity til cisplatin ved tap av CLPTM1L skyldes en effekt på apoptose eller apoptotisk signalering i stedet for en effekt på grad av akutt DNA-skade. Følsomhet for cisplatin-indusert apoptose ble også økt med tap av CLPTM1L uttrykk ved shRNA i H838 tumorceller (Figur 3B), målt ved kolo caspase 3/7 aktivitetsanalyse. Igjen motstand mot cisplatin-indusert apoptose var proporsjonal med mengden av CLPTM1L transkript akkumulering i cellene, med en r
2 fra 0,8847 (p = 1,3 x 10
-4) mellom prosent knockdown og relativ kaspase 3 aktivitet (figur S3b). Utseendet av celler i kultur er i overensstemmelse med økt følsomhet overfor cisplatin-indusert apoptose ved tap av CLPTM1L (figur 3C).
A) Annexin V-binding ved flowcytometri av A549-celler med CLPTM1L knockdown etter 48 timers behandling med cisplatin . B) Relativ caspase 3/7 aktivitet i H838 celler med CLPTM1L knockdown etter 48 timers behandling med cisplatin. Feilfelt representerer ett standardavvik fra gjennomsnittet. ** – P 0,01 * – p 0,02 ved tosidig t-test. C) mikrografer av A549 celler med CLPTM1L knockdown etter 24 timers behandling med 50 mikrometer cisplatin viser økt gentoksisk celledød ved tap av CLPTM1L.
Regulering av BCL-xL Expression er avgjørende for CLPTM1L Påvirkning av apoptose
for å undersøke mekanismene for CLPTM1L beskyttelse mot apoptose, vi målte proteinnivåer apoptotiske regulatorer i ubehandlede A549 celler sammenlignet med de som ble behandlet med cisplatin. For vurdering av kravet om CLPTM1L for regulering av apoptose, ble de mest effektive knockdown konstruksjoner i A549 celler (SH2 og SH3) evaluert. Behandling av A549 celler med 20 pM cisplatin-indusert oppsamling av p53 og den pro-apoptotiske p53 målet, Bax, og redusert akkumulering av anti-apoptotiske protein Bcl-2, i samsvar med den DNA-skade indusert indre apoptotisk reaksjonsvei (figur 4A). Uttrykk av disse apoptotic regulatorer var upåvirket av knockdown av CLPTM1L alene. Imidlertid er anti-apoptotiske protein Bcl-xL, mens upåvirket av cisplatin behandling i A549-celler, ble redusert ved CLPTM1L nivåer ble squelched med shRNA uttrykk. Knockdown av CLPTM1L med shRNAs redusert BCL-XL protein nivåer med 81% og 76% i cisplatinbehandlede celler (p 0,003, To-tailed t-test), målt ved tre uavhengige vestlige analyser (figur 4B). Vi har derfor stabilt uttrykte eksogene BCL-XL i celler med og uten knockdown av CLPTM1L å vurdere rollen til BCL-XL CLPTM1L beskyttelse mot apoptose. Re-uttrykk for BCL-xL ble bekreftet ved Western blot (Figur 4C). Mens knockdown av CLPTM1L økt apoptose i tomme vektor transfekterte celler med 71%, eksogene BCL-xL eliminert CLPTM1L avhengig apoptose (figur 4D). Motstand mot gentoksisk spenning indusert apoptose tett samsvarer med BCL-XL nivåer, og BCL-xL tilberedning helt avskaffet allergi å gentoksisk spenning indusert apoptose av CLPTM1L.
A) Western blotting for apoptotiske regulatorer i A549 celler med CLPTM1L knockdown etter behandling med cisplatin viste nedsatt BCL-xL uttrykk ved tap av CLPTM1L. BCL-XL blotter for to separate representative klonale populasjoner av A549 celler med CLPTM1L knockdown (# 1 og # 2) er vist. B) Grafisk fremstilling av BCL-xL uttrykk i celler med CLPTM1L knockdown fra tre separate klonal populationsA549. Feilfelt representerer ett standardavvik fra gjennomsnittet. * – P 0,003 av t-test C) Western blot bekrefter uttrykk for eksogene BCL-XL i A549 celler med CLPTM1L knockdown. D) Relative levedyktige celler i A549 celler med CLPTM1L knockdown og ektopisk BCL-xL uttrykk etter behandling med cisplatin demonstrere avskaffelsen av apoptotisk effekt av CLPTM1L tap ved ektopisk BCL-xL uttrykk.
Diskusjoner
overlevelse av celler som gjennomgår DNA-skade fra genomisk instabilitet eller genotoksiske stress fører til opphopning av genetiske lesjoner som karakteriserer humane tumorer. Oppheving av cellesyklus sjekkpunkt og apoptotiske sikringstiltak mot replikering av skadet DNA er et kjennetegn på kreft. Resultatet av beskyttelse mot DNA-skader indusert apoptose omfatter både sårbarhet for ukontrollert somatisk mutasjon og nedsatt følsomhet for strålebehandling og kjemoterapi. Den tidligere referert studie av Zienolddinny et al. antyder at CLPTM1L polymorfismer kan påvirke DNA-skade opphopning [4]. Basert på våre observasjoner, er det sannsynlig at beskyttelse mot apoptose ved CLPTM1L bidrar til akkumulering av DNA-skader, og dermed overdragelse mottakelighet for tumorigenesis. En alternativ hypotese er at CLPTM1L spiller en rolle i erkjennelse eller reparasjon av DNA-skade, som påvirker akkumuleringen av slike skader. En annen er at CLPTM1L direkte påvirker mengden av DNA-skader som er pådratt av gentoksiske stoffer. Våre data (figur S4) antyder at CLPTM1L uttrykket ikke direkte påvirke nivåer av akutt DNA skade påført ved cisplatin eller NNK. Videre denne studien viser at CLPTM1L har en apoptotisk rolle nedstrøms DNA-skade og gjennom regulering av Bcl-xL uttrykk, som er egnet til å påvirke akkumulering av DNA-skader. Observasjonen av differensial opphopning av BCL-xL på modulering av CLPTM1L uttrykk, sammen med tilberedning av en apoptose resistent fenotype med uttrykk av eksogene BCL-XL, dokumentere at CLPTM1L fungerer oppstrøms av BCL-XL til gi resistens mot gentoksisk spenning indusert apoptose. I eksogene Bcl-xL ekspresjonseksperimenter, viser det seg at mindre Bcl-xL er uttrykt i vektorinneholdende celler enn det som ble observert i tidligere eksperimenter, selv om redusert akkumulering i celler med CLPTM1L knockdown forblir tydelig. Samtidig er apoptotisk drap litt mer robust i vektor som inneholder celler observert i tidligere forsøk, men trenden med økt følsomhet ved tap av CLPTM1L og BCL-xL gjenstår. Viktigere, viser denne studie at anti-apoptotiske funksjon av CLPTM1L er ikke eksklusivt for cisplatin følsomhet, men er et generelt inhibering av mitokondriell vei av apoptose.
Vanlig overekspresjon av CLPTM1L i tumorer støtter oppfatningen av et oncogent eller svulst fremme rolle for CLPTM1L i lungekrefttilfellene. Protein uttrykk studier utført og kommentert av Human Protein Atlas-prosjektet [24] bekrefter våre funn. Immunhistokjemi med normalt humant alveolare celler og lungetumorer viste negativ ekspresjon av CLPTM1L i normale vev, mens ekspresjon i 12 lungesvulster gjennomsnitt en score på 1,91 på en skala fra 0-3 (fig S5). En score på 0 er negativ, en er «svak», 2 er «moderat» og 3 er «sterk». Seks av disse pasientene ble diagnostisert med plateepitelkarsinom og seks ble diagnostisert med adenokarsinom. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i uttrykket mellom de to patologiske tilstander. Totalt 66 normale vev fra ulike organer scoret et gjennomsnitt på 0,98 (svak). Ingen av lungesvulster som ble testet var negative. Lung tumorcellelinjer A549 (NSCLC) og SCLC-21H (småcellet) viste sterk farging og moderat farging, henholdsvis.
Microarray data fra svulst og foreviget cellelinjer viser at andre enn kopiantall gevinst resultat mekanismer i økt ekspresjon i en undergruppe av tumorer. I genom brede foreninger, de fem p15.33 locus står for det største bidraget til lungekreft risiko for tre kjente loci hos mennesker [6]. Den 5 p locus er også innblandet i kutant plateepitelkarsinom og melanom [25], eggstokkreft [26], testikkelkreft bakterie celle kreft [27] og livmorhalskreft ved kopi nummer gevinst [8]. I livmorhalskreft studien, CLPTM1L dukket opp fra 5 p locus som har uttrykk mønstre som korrelerte med kopi nummer gevinst. En annen fersk studie av kopitall og uttrykk endringer i livmorhalskreft cellelinjer viste at med kopi nummer gevinst over 5 p, ble CLPTM1L uttrykk økt ca 5 ganger i løpet av normale livmorhals epitelceller, mens uttrykk av de andre genene 5 p15.33 var ikke endrede [9]. Den TERT-genet er også innenfor denne genetiske regionen. Ved analyse av SNP i 5 p-regionen, er det funnet at lungekreft er forbundet SNP’er ikke er forbundet med telomerlengde (data ikke vist), i samsvar med to andre studier [28], [29]. I motsetning til en studie av Rafnar et al. viste en forening (
p
= 0,017 og 0,027, henholdsvis) mellom 5 p varianter (rs401681 og rs2736098) og telomerlengde, selv om denne effekten ble bare sett når kvinner eldre enn 75 år med homozygot genotype ble inkludert [30 ]. Så vidt vi vet, har ingen felles koding mutasjoner i enten CLPTM1L eller TERT blitt identifisert. Det er sannsynlig at både TERT og CLPTM1L bidra til mottakelighet på dette locus, har en co-grunnlegger effekt. En fersk studie [5] gir flere linjer med bevis for at lungekreft sammenslutning av rs31489 i CLPTM1L genet er en uavhengig observasjon fra foreningen av rs2376100 i TERT genet. Den nyeste tette genotyping studie av 5 p15.33 funnet flere foreninger på 5p15.33, med regionen av foreningen blir sentrert over CLPTM1L [7]. Vår forrige analyse viser at rs31489 er den varianten sterkest assosiert med familiær lungekreft på dette locus. Den aktuelle studien indikerer at CLPTM1L spiller også en viktig funksjonell rolle i forhold til kreft, og at dette genet kan være minst delvis ansvarlig for foreningen av variantene i 5p15.33 regionen med lungekreft. Fortsatt innsats for å ytterligere definere den genetiske variasjonen kjøre lungekreft mottakelighet i denne genetiske regionen er et viktig neste skritt i å vurdere forholdet mellom CLPTM1L og andre gener i regionen med lunge svulst mottakelighet.
Felles overekspresjon av CLPTM1L i lunge tumorer og en funksjonell rolle i genotoksiske spenning indusert apoptose identifisere CLPTM1L som en viktig faktor som påvirker overlevelsen av skadet DNA-tumorceller og potensielt lungekreft følsomhet. Målrette CLPTM1L samt BCL-XL kan vise seg å være nyttige tilnærminger til chemoprevention og lungekreft behandling. Rettet mot disse anti-apoptotiske proteiner kan også ha potensial for sensibilisering av svulster til tradisjonelle chemotherapies og radiotherapies.
Materialer og metoder
RT-Kvantitativ Real-Time PCR
Pasient matchet tumor og tumor-tilstøtende normale RNA prøver ble innhentet fra vev anskaffelser Kjerne ved Washington University i St. Louis i henhold til protokoll godkjennes av Institutional Review Board ved Washington University i St. Louis School of Medicine, human Forskning Protection Office. Skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter som deltar i dette vevet bank. RNA ble isolert fra cellelinjer ved bruk av tri-Zol reagens og protokoller (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitativ real-time PCR (qPCR) ble utført under anvendelse av metoden som beskrevet tidligere (Chaparro, Wen et al., 2005). I korte trekk, ble et mikrogram av total RNA per prøve omdannet til cDNA ved hjelp av Superscript First-Strand Synthesis system for RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitativ RT-PCR-analysen ble gjort ved hjelp av SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, California). En mikroliter av cDNA ble tilsatt til en 25 ul samlet volum reaksjonsblanding inneholdende vann, SYBR grønn PCR masterblanding, og primere. Hver sanntids analyse ble gjort i duplikat på en BioRad MyIQ maskin. Data ble oppsamlet og analysert med Stratagene MX3000 programvare.
β-aktin-genet
(ACTB) ble anvendt som en intern kontroll for å beregne den relative ekspresjonsnivået (A C
T) for hver prøve. Primersett effektivitet og linearitet ble beregnet, og normaliseringen ble utført i henhold til MIQE retningslinjer. Folden endring av genekspresjon i tumorvev sammenlignet med de sammenkoblede normale vev ble beregnet som 2
d, hvor d = A C
T
normal -. A C
T tumor
Microarray analyse
Expression mikromatriser ble utført ved hjelp av Illumina HumanWG-6 V3-plattformen, som inneholder 48,800 sonder som tilsvarer 20.700 unike gener. RNA (500 ng) ble merket og hybridisert til BeadChip arrays som spesifisert av produsenten (www.illumina.com). Array data ble pre-behandlet med MBCB algoritmen (Ding, LH et al, Nucl Acids Research, 2008, 36:. E58). Og differensial ble bestemt ved å beregne ganger endring og T test
Cell Culture, knockdown og Overuttrykte
A549-celler (ATCC, Manassas, VA), nylig godkjent av Genetica Laboratores, Inc. (Cinncinati, OH), ble dyrket i RPMI-1640 pluss 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, California) . Celler ble transduced med lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) vektorer basert på pLKO.1 vektor og designet spesifikt mot menneske CLPTM1L transkripsjon (Sigma, St. Louis). Tom vektor eller vektor slå ned CLPTM1L avskrift ble først pakket i 293T celler (Orbigen, San Diego, California) med hjelpe plasmider og deretter omformet til A549 celler med 8 mikrogram /ml polybren (Sigma, St. Louis, MO). Mediet ble byttet ut 24 timer etter transduksjon, og cellene ble delt 1:4 48 timer etter transduksjon. Ved 72 timer etter transduksjon, ble celler som lentivirale konstrukter som er valgt med 1 ug /ml puromycin i 2-4 dager, inntil mock-infiserte celler var døde. Overlevende celler ble samlet
pBABEpuro ekspresjonsvektor eller pBABEpuro. CLPTM1L, klonet ved PCR fra pOTB7-CLPTM1L, (Thermo Scientific), inn EcoRI /Sall områder av pBABE-puro, ble transfektert inn H1299 celler. Transfekterte celler ble utvalgt med puromycin til narretransfekterte celler var døde.
pSSFV Bcl-xL ekspresjonsvektor (Addgene plasmid 8749) eller tom vektor ble transfektert inn i celler med og uten knockdown av CLPTM1L som beskrevet ovenfor. Transfekterte celler ble selektert med geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Levedyktighet Assay
Celler som stabilt uttrykker shRNA vektorer som beskrevet ovenfor, ble sådd ut på 12-brønns vevs-kulturskåler i like tettheter på ca. 50% i tre eksemplarer. Etter festing over natten etterfulgt av 48 timers behandling med de angitte konsentrasjoner av cisplatin (Sigma, St. Louis, MO) oppløst i media, kamptotecin (Sigma, St. Louis. MO) oppløst i DMSO (Sigma, St. Louis, MO) eller DMSO løsemiddel alene. DMSO konsentrasjoner i kulturmedier ble holdt konsekvent og var på eller under 0,08%. Celler ble analysert for levedyktige celler ved trypan blå farging og telles på en Countess automatisk celleteller (Invitrogen, Carlsbad, CA). For camptothecin-analyser, ble cellenes levedyktighet målt ved hjelp av Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) i 24 brønners vevskulturplater i tre eksemplarer. P-verdier ble bestemt ved ensidige t-test.
flowcytometrisystemer
De angitte cellelinjer ble behandlet i 24 timer med de angitte konsentrasjoner av cisplatin på 10 cm vev kultur retter. 10
6-celler ble vasket og suspendert i PBS og farget med Annexin V-FITC. Celler i farging løsning ble fortynnet med 500 mL PBS og analysert på en Coulter strømningscytometer.
caspase 3/7 analysen
De angitte cellelinjer ble belagt med en tetthet på 5 × 10
4 celler pr brønn i en 12 brønners vevskulturplate og behandlet som indikert med genotoksiske midler etter festing over natten. Caspase 3 og 7 aktivitet ble målt ved hjelp av SensoLyte® Homogen Rh110 caspase – 3/7 Assay Kit (AnaSpec, Fremont, California)
Western blotting
De angitte cellelinjer ble behandlet med cisplatin på. de angitte konsentrasjoner på 6-brønners plater i 72 timer. Celler ble lysert med 100 ul 1X NP40-lyseringsbuffer inneholdende proteinaseinhibitorer, skjærbehandlet 10 ganger med en 28 gauge nål, sentrifugeres ved 16 000 x g i 30 minutter, normalisert med proteinkonsentrasjon bestemt ved hjelp av Bradford-metoden, og supernatanten ble kokt i 10 min. 20 ul av normaliserte lysat ble løst ved hjelp av SDS-PAGE og immunblotting analysert med angitte antistoffer. De følgende antistoffer ble anvendt: kanin-anti-CLPTM1L (Sigma, St. Louis, MO), kanin-anti-beta-tubulin (Sigma, St. Louis, MO), muse-anti-BCL2 klon 124 (Dako, Carpinteria, CA), kanin anti-Bax # 2774 (Cell Signaling, Boston, MA), mus anti-p53 (Ab-1) (Oncogene, San Diego, CA), BCL-xL – kanin Bcl2L1 (Abcam, Cambridge, MA). Kvantifisering av vestlige analyser av tre uavhengige kulturer ble gjort ved hjelp av Image J programvare som er tilgjengelig online fra NIH på https://rsbweb.nih.gov. P-verdier bestemt av ensidige t-test.
COMET analysen
gelelektroforese basert metode for påvisning av DNA-skade ble gjennomført ble endret fra Olive, et al.
Natur Protokoller
1, 23-29 (2006). Celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av NNK, cisplatin eller DMSO oppløsningsmiddel 0,1% i 24 timer. Objektglass ble forhåndsbelagt med lavt smeltepunkt agarose (Sigma, St. Louis, MO) 1% i dH2O og tørket. En ml av lavt smeltepunkt agarose 1% i dH2O holdt ved 40 ° C ble tilsatt til 0,4 ml av en suspensjon av 2 x 10
4 celler /ml i kalde medier. Den agarose /celler mix (1 ml /lysbilde) ble spredt på pre-belagt lysbilder.
