Abstract
Bakgrunn
levermetastaser er den vanligste årsaken til død hos pasienter med tykktarmskreft. Til tross for omfattende forskning på biologi av kreft progresjon, er de molekylære mekanismene som driver kolorektal kreft metastase ikke godt karakterisert.
Metoder
HT29 LM1, HT29 LM2, HT29 LM3 cellelinjer ble avledet fra menneskelige tykktarmskreft cellelinje HT29 etter flere runder med
in vivo
utvalg i immunsvikt mus.
Resultater
CD44 uttrykk, et trans glykoprotein involvert i celle-celle og celle- matrisesammenvoksninger, og kreftceller adhesjon til endotelceller ble øket i alle
in vivo
utvalgte cellelinjer, med maksimal CD44 ekspresjon og kreftceller adhesjon til endotelceller i det høyt metastatisk HT29 LM3-cellelinje. Aktivering av c-Met på hepatocytter vekstfaktor (HGF) stimulering i
in vivo
utvalgte cellelinjer er CD44 uavhengig.
In vitro
separasjon av CD44 høye og lave uttrykk celler fra HT29 LM3 cellelinje med FACS sortering bekreftet at c-Met aktivering er CD44 uavhengig på hepatocytter vekstfaktor stimulering. Videre
in vivo
evaluering av CD44 lav og høy uttrykke HT29 LM3 celler viste ingen forskjell i levermetastaser pene.
Konklusjoner
Til sammen våre funn tyder på at den aggressive metastatisk fenotype av
in vivo
utvalgte cellelinjer er forbundet med overekspresjon av CD44 og aktivering av c-MET. Vi viser at c-Met aktivering er CD44 uavhengig på hepatocytter vekstfaktor stimulering og bekrefte at CD44 uttrykk i HT29 LM3 cellelinje er ikke ansvarlig for økningen i metastatisk pene i HT29 LM3 cellelinje
Citation. Elliott VA , Rychahou P, Zaytseva YY, Evers BM (2014) Aktivering av c-Met og oppregulering av CD44 uttrykk er knyttet til metastatisk Phenotype i tykktarmskreft levermetastaser Model. PLoS ONE 9 (5): e97432. doi: 10,1371 /journal.pone.0097432
Redaktør: Frédéric André, Aix-Marseille Universitet, Frankrike
mottatt: 17 februar 2014; Godkjent: 18 april 2014; Publisert: 13. mai 2014
Copyright: © 2014 Elliott et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd R01DK048498 fra NIDDK og T32CA165990 fra NCI. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA [1]. Metastatisk eller residiverende sykdom er den vanligste dødsårsaken hos disse pasientene. Prognosen for CRC er basert på dannelsen av fjernmetastaser, ikke den primære tumor selv. Selv med omfattende forskning på biologi av kreft progresjon, er de molekylære mekanismene som er involvert i metastatisk kaskade ikke godt karakterisert.
Mekanismene for metastasering innebærer en selektiv og sekvensiell rekke trinn, inkludert separasjon fra den primære svulsten, invasjon gjennom omkringliggende vev, inntreden i sirkulasjonssystemet, og etablering og spredning i et fjernt sted [2]. To proteiner som har vist seg å være involvert med flere trinn av metastatisk cascade er CD44 og c-MET. CD44, et transmembran-glykoprotein som hører til en familie av celleadhesjonsmolekyler, er involvert i progresjon og metastasering av flere typer kreft [3] – [6] og har vært assosiert med en dårlig prognose i CRC-pasienter [3]. c-MET er et proto-onkogen som koder for en reseptor-tyrosinkinase, også kjent som hepatocytt-vekstfaktor-reseptor [4]. Den eneste kjente liganden for c-MET er hepatocytt vekstfaktor (HGF); både c-MET og HGF blir oppregulert i et antall av maligniteter og er assosiert med en dårlig prognose, og en tidlig prediktor for ytterligere metastase [5]. Spesielt er c-MET involvert i reguleringen av spredning, motilitet, invasjon og metastasering via sin fosforylering og aktivering av nedstrøms signalveier [4].
En helhetlig forståelse av de mekanismene som driver CRC metastaser er viktig for utviklingen av romanen tilnærminger til behandling av denne kreftformen. Derfor hensikten med vår studie var å identifisere gener som fremmer levermetastaser i CRC. Her etablerte vi tre svært metastatisk CRC cellelinjer og vise at deres mer aggressive metastatisk fenotype er assosiert med en økning i CD44 uttrykk og aktivering av c-MET. Videre viser vi at aktivering av c-MET var uavhengig av nivåene av CD44 tilstede. Til slutt viser vi at økt CD44 uttrykk er ikke ansvarlig for økningen i metastatisk pene den av HT29 LM3 cellelinje. Viktigere,
in vivo
utvalg og isolering av lever-tropisk CRC metastatiske celler tillatt oss å studere biologiske mekanismer for CRC kreft metastasering og identifisere hvilke mekanismer som bidrar til levermetastaser i CRC.
Materialer og metoder
cellelinjer, transfections
HT29 celler og human lunge Mikrovaskulær endotelceller (HMVEC-L) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia), ble tidligere godkjent i november 2011 av Genetica DNA Laboratories (Cincinnati, OH) ble dyrket i McCoys 5A medium, kjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO) supplert med 10% FBS og antibiotika-antimykotisk. EGFP-N1 vektor ble kjøpt fra Clontech (Mountain View, California). GFP-uttrykke celler ble valgt med 500 mikrogram /ml Geneticin (G418), kjøpt fra Life Technologies (Carlsbad, California) og beriket av tre sykluser av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Pre-laget pGL3 ildflue luciferase (LUC) lentiviral partikler ble kjøpt fra Lentigen (Gaithersburg, MD). For lentiviral transduksjon, 5000 celler /brønn ble sådd ut i 96-brønners vevskulturplater og infisert følgende dag med luc lentiviral partikler ved en MOI på 10 i nærvær av 10 ug /ml polybren, kjøpt fra Santa-Cruz Biotechnology (Dallas, TX ).
levermetastaser Modell og
i
vivo
Imaging
Mann atymiske NCR nakne mus mellom 6-8 uker gammel ble kjøpt fra Taconic ( Hudson, NY). Boliger for disse dyrene ble opprettholdt i et HEPA-filtrert miljø innen steriliserte bur med 12 timer lys /12 timer mørke sykluser. Alle dyr prosedyrer ble gjennomført med godkjenning av og i samsvar med University of Kentucky Institutional Animal Care og bruk Committee; protokoll # 2009-0529. For intrasplenic injeksjon av CRC-celler atymiske NCR nakne mus ble bedøvet med isofluran (induksjon 4%, vedlikehold 2%). En 1 cm hud snitt ble gjort i venstre flanke og båret ned gjennom peritoneal veggen. Milten var nøye utsatt, og HT29 GFP-Luc celler (5 × 10
6 celler /100 ul) ble injisert under milten kapsel med en 27-gauge nål. Levedyktigheten til celler som anvendes for inokulering var større enn 95% som bestemt ved Vi-CELL XR (Beckman Coulter). Lett trykk ble påført på det inokulering området inntil det var ingen synlige tegn på blødning. LIGACLIP ekstra enkelt klipp ligere applier med titan LIGACLIP ekstra ligere klipp, kjøpt fra Ethicon (San Angelo, Texas), ble brukt til å klippe lienal og lieno-bukspyttkjertelen årer 5 min etter milt injeksjon av CRC celler; milten ble deretter fjernet. Musene ble avlivet etter 4 uker eller tidligere hvis døende. Lever vev ble bevart for histologisk undersøkelse ved fiksering i 10% bufret formalin etterfulgt av parafin innebygging.
Alle bioluminescent bildene ble anskaffet med en IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA), med scenen varmet opp til 37 ° C under live celle bildebehandling. Bilder ble kjøpt opp 10 min etter i.p. injeksjon av D-Luciferin (150 mg /kg) under anvendelse av 15 s eksponering. GFP fluorescensavbildning ble utført ved anvendelse av en LT-9500 Illumatool /TLS (Lightools Research, Encinitas, CA), som er utstyrt med en eksitasjon kilde (470 nm) og filterplaten (515 nm).
Enzymatisk Isolering av CRC Cells fra levermetastaser
Liberase DH Forskning Grade (05401054001; Roche Applied Science) ble resuspendert i sterilt vann til 2,5 mg /ml konsentrasjon og lagret i single-bruker 100 ul porsjoner ved -80 ° C. Collagenase /Hyaluronidase (07912; StemCell Technologies) ble alikvotert inn i engangsbruk 250 mL alikvoter og lagret ved -80 ° C. Ved innsamling, ble metastatiske svulster plassert i fullstendig cellekultur media supplert med 1X Gibco Antibiotika Anti-fungal (15240-062, Life Technologies) for transport. Metastatiske tumorfragmenter ble hakket til 2 mm terninger ved hjelp av saks og fordøyet i 50 ug /ml Liberase DH (100 ul) og 0,5 x Kollagenase /Hyaluronidase (250 ul), fortynnet i 5 ml McCoy5A serumfritt medium i 4 timer ved 37 ° C med forsiktig omrøring ved magnetisk rørestav. Ingen ufordøyd vev ble observert. Fordøyd celler ble vasket to ganger med komplett cellekulturmedier og overført til 10% FBS McCoy5A media supplert med 1X Gibco Antibiotika-Anti-fungal og 100 mikrogram /ml Primocin (ant-pm-1; InvivoGen).
Western Blot Analysis og Antistoffer
Totalt proteinlysatene (20 mikrogram) ble løst på en 4-12% bis-tris gel og overført til Immobilon PVDF overføringsmembraner. Membranene ble inkubert i 40 minutter ved romtemperatur i blokkeringsløsning (TRIS-bufret saltvann som inneholdt 5% fettfri tørrmelk og 0,1% Tween 20), etterfulgt av en inkubering over natten i primære antistoffer ved 4 ° C. Membraner ble deretter vasket 3 ganger og inkubert med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff i 1 time. Etter ytterligere 3 vaskinger ble immunkomplekser på membraner visualisert ved ECL deteksjon
Følgende antistoffer ble kjøpt og brukt i vår studie. Cell Signaling (Danvers, MA): fosfor-AKT (# 4058), total AKT (# 2920), akt2 (# 3063), fosfor-ERK 1/2 (# 4695), total ERK ½ (# 9107), PTEN (# 9559), fosfor-mTOR (# 2971), total mTOR (# 2972), fosfor-MET (# 3129 for western blotting og # 3077 for IHC), c-MET (# 3148), CD44 (# 3570), fosfor-beta catenin (# 4176), fosfor-FAK (# 8556), og total FAK (# 3285). Santa Cruz (Dallas, TX): AKT 1 (# 5298). BD (San Jose, California): Beta catenin (# 610154) og E-cadherin (# 610404). Abcam (Cambridge, MA): KRAS (# 55391). Millipore (Billerica, MA): p85α (# 05-212). Alle antistoffer ble anvendt ved en konsentrasjon på 1:1,000.
siRNA transfeksjoner og HGF Cell Treatment
For HGF, behandling celler ble sådd ved en konsentrasjon på 800.000 celler /brønn i et seks-brønners plate . Etter 24 timer ble celle mediet skiftet til serumfritt medium i ytterligere 24 timer. Rekombinant human HGF (Peprotech # 100-39) ble deretter tilsatt til brønnene i en konsentrasjon på 50 ng /ml i 5 min. siRNA transfections: ON-TARGET pluss CD44 sirnas (LU-00999907, LU-00999908) og kontroll siRNA (D-001810-10) ble kjøpt fra Dharmacon (Lafayette, CO) og brukes i en konsentrasjon på 100 mikrometer
Immunhistokjemi
Immunhistokjemi (IHC) ble utført som tidligere beskrevet [6]. De parafin-seksjonene ble deparaffinized i xylen og rehydrert i synkende etanol serien. Proteinfarging ble utført ved anvendelse av DAKO EnVision Kit, innkjøpt fra Dako Corp. (Carpinteria, CA). CD44 og p-MET-antistoffer ble anvendt ved en konsentrasjon på 1:100 i DAKO antistoff-fortynningsmiddel. Alle seksjonene ble motfarget med hematoksylin og observert ved lysmikroskopi.
Proliferation Assay
Sperre HT29 og HT29 LM3-celler ble sådd ut i 24-brønners plater i en tetthet på 25.000 celler per brønn. Proliferasjon ble bestemt ved å telle celle ved 24, 48 og 72 timer, ved anvendelse av en Beckman-Coulter Vi Cell XR cellenes levedyktighet Analyzer (Fullerton, CA).
Endothelial Cell Adhesion Assay
Humant mikrovaskulær endotelceller fra lunge (HMVEC-L) ble aktivert med 15 ng /ml av TNFa i 4 timer. Foreldre HT29 og HT29 LM3-celler ble merket med Calcein AM (2,5 mg /ml sluttkonsentrasjon) i 30 minutter ved 37 ° C, vasket og lagt på toppen av monolag av aktiverte HMVEC-L-celler i 30 min. Ufestede celler ble fjernet ved vasking med PBS (5x) og tre GFP bildene ble tatt per brønn for å telle de festede celler.
Flow Cytometry Analysis and Cell Sorting
HT29 LM3-celler ble merket med CD44 – Alexa Fluor 647 antistoff (Biolegend) ved en konsentrasjon på 2,5 mikrogram /ml pr 10
7-celler i 30 min. Cellene ble vasket og resuspendert i sorteringsbuffer (1 x fosfatbufret saltvann, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% varme-inaktivert føtalt bovint serum). Innenfor en prøve av HT29 LM3-celler, sortert vi to populasjoner av celler: 10% av cellene med en høy ekspresjon av CD44 (forkortet som HT29 LM3 CD44 +) og celler som ikke uttrykker CD44 (forkortet som HT29 LM3 CD44-). Ufargede HT29 LM3 celler ble brukt som en negativ kontroll. Etter cellesortering ble cellene ekspandert i cellekultur. Den britiske Flowcytometri service gjennomført celle analyse og cellesortering.
Resultater
In vivo
seleksjonen av lever-tropisk CRC metastatisk Cells
CRC levermetastase er en flertrinns prosess hvor ondartede celler spres fra en primærtumor å kolonisere leveren. Ondartede celler er invasiv og metastatisk; imidlertid bare en begrenset fraksjon av cellene i en primærtumor ansett for å være svært metastatisk.
In vivo
seleksjonsmetoder, med primærkreftcellelinjer og sammenligning mellom rene klonale populasjoner av isolerte lever-tropisk metastatiske celler er en nyttig vitenskapelig tilnærming for identifikasjon av biologiske mekanismer forbedret i løpet av CRC levermetastaser.
i denne studien har vi utviklet den HT29 CRC cellelinje til å uttrykke reporter plasmider, GFP og ildflue luciferase som tillater fluorescens og bioluminesens bildebehandling i en enkelt eksperimentell modell, og utført
i
vivo
utvalg av HT29-celler som spredning til leveren. Kort sagt ble HT29-celler injisert inn i milten hos atymiske nakne mus; splenektomi ble utført 5 min etter intrasplenic injeksjon av CRC celler for å unngå re-metastaser. Experimental levermetastaser (LM, 30-40 metastatiske lesjoner) ble høstet, etablert i vev kultur, og utpekt som HT29 LM cellelinjer. Celler høstes fra disse kulturene ble injisert inn i milten til et annet sett med nakne mus. Sekvensen av
i
vivo
valget er vist i Figur 1A. HT29LM1 og HT29 LM3 variere dramatisk med hensyn til deres metastatisk potensial. Bioluminescent avbildning av mus injisert med HT29 LM2 viste en 2,5 ganger økning i pene forhold til foreldrenes cellelinje (~3.5 uker med ~ 100% pene vs. ~4 uker med ~40% penetrans) (Figur 1b). Dermed
i
vivo
utvalg av HT29 cellelinjer gitt svært metastatiske celler for sammenligning med foreldreceller under isogen bakgrunn.
(A) Illustrasjon av metastatisk CRC
i
vivo
utvelgelsesprosessen. Eksperimentelle levermetastaser ble høstet, etablert i kultur og betegnet HT29 LM1, LM2 og LM3 cellelinjer. (B) Bioluminescent bilder av mus 4 uker etter intrasplenic injeksjon av foreldre HT29 og HT29 LM2 cellelinjer.
Den c-MET Pathway er oppregulert i HT29 cellelinjer utvunnet
Molecular analyse av kreftceller i ulike stadier av utviklingen har vist at endringer i tumorsuppressorgener og onkogener akkumuleres i løpet av tumorprogresjon og korrelerer med klinisk aggressivitet av kreft. Deretter utførte vi komparativ analyse av flere onkogener og tumor suppressor genuttrykk profiler i HT29 LM cellelinjer ved hjelp av Western blot. Figur 2 viser at fosforylering av c-MET ble dramatisk økt i HT29 LM1 og LM2 HT29-cellelinjer, med den høyeste aktivering i HT29 LM3-cellelinjen, sammenlignet med foreldre HT29-celler. Vi observerte en svak økning i total c-MET-proteinet i tillegg. Disse endringer ble notert når cellene ble dyrket i normale eller serumfrie betingelser (separate eksperimenter). Western blot analyse av proteinekstrakter fra HT29 LM cellelinjer viste ingen endringer i Pakt (Ser473), Akt, p85α, PTEN, perk (Tyr 1234/1235), ERK, k-Ras protein uttrykk (data ikke vist). Sammen utgjør disse funnene tyder på at en økning i den metastatisk potensial på HT29-avledede cellelinjer er forbundet med aktivering av c-MET veien.
HT29 LM1, LM2, LM3 og foreldre-cellelinjen ble dyrket i normalt medium for 24 (første 4 baner). I et annet eksperiment, ble cellene dyrket i serumfritt medium i 24 timer og stimulert med komplett medium i 10 min (de resterende 4 baner). Proteinekspresjon profiler ble analysert ved hjelp av Western blot. β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
Expression of CD44 protein er betydelig økt i HT29 cellelinjer utvunnet
uttrykk for viktige proteiner i CD44, β-catenin , og FAK-trasé, som spiller en viktig rolle i CRC metastase [7] – [9] ble analysert ved. Vi har observert en gradvis økning av høy molekylvekt CD44 ekspresjon observert på ~150 kDa i HT29 LM cellelinjer, med maksimal CD44 ekspresjon i HT29 LM3 sammenlignet med foreldre HT29-cellelinjen (figur 3A). Western blot-analyse av proteinekstrakter fra HT29 LM cellelinjer viste ingen endring i p-β-catenin (S675), β-catenin, p-FAK (Tyr397) og FAK-protein ekspresjon (data ikke vist). For ytterligere å bekrefte vår
i
vitro
funn, vi analysert foreldre HT29 og HT29 LM3 seksjoner levermetastaser vev av IHC. I samsvar med Western blot-analyse, ekspresjon av både p-MET og CD44 var signifikant økt i HT29 LM3 sammenlignet med HT29 LM1 (figur 3B). CD44 celleoverflate strømningscytometri-analyse viste også høyere nivå av CD44 ekspresjon på overflaten av HT29 LM3-celler sammenlignet med foreldre HT29-celler (Figur 3C). Sammen tyder disse data på at forbedret metastatisk potensial av HT29 LM cellelinjer er forbundet med en økning i CD44 ekspresjon.
(A) HT29 LM1, LM2, LM3 og foreldre-cellelinjen ble dyrket i normalt medium for 24 h. Proteinekspresjon profiler ble analysert ved hjelp av Western blot. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) IHC analyse av CD44 og p-MET uttrykk i HT29 LM1 og HT29 LM3 levermetastaser vevssnitt. (C) Flowcytometri analyse av CD44 geometriske gjennomsnittet fluorescens intensitet i foreldre HT29 og HT29 LM3 celler.
High Level of c-MET Activation i HT29 LM3 er uavhengig av CD44 uttrykk
Met er en viktig reseptor tyrosinkinase (RTK) som induserer kreftceller proliferasjon, differensiering, overlevelse migrering og [10]. Met er forbigående aktiveres etter HGF induksjon og krever særskilte CD44-isoformer for sin aktivering i forskjellige cancere [11], [12]. For bedre å forstå samspillet mellom MET aktivering og CD44 i foreldre HT29 og HT29 LM3 celler, analyserte vi effektene av HGF stimulering i begge cellelinjer. Som vist i figur 4A, øker HGF-behandling aktivering av c-MET i begge foreldre HT29 og HT29 LM3, med noe høyere aktivering i HT29 LM3-cellelinje sammenlignet med foreldre HT29-cellelinjen. Vi neste transfektert HT29 LM3 celler med siRNA mot alle CD44 isoformer og deretter behandlet disse cellene med HGF. Figur 4B viser tilsvarende nivåer av c-MET fosforylering i nærvær eller fravær av HGF, noe som tyder på at aktivering av c-MET banen i HT29 LM3-celler er uavhengig av CD44 ekspresjon.
(A) Analyse av CD44, p-MET, c-MET, p-AKT og AKT uttrykk i foreldrenes HT29 og HT29 LM3 etter HGF stimulering (50 ng /ml, 5 min) ved Western blot. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) HT29 LM3-celler ble transfektert med CD44 siRNA og stimulert med HGF (50 ng /ml, 5 min) 24 timer etter transfeksjon siRNA. (C) CD44 uttrykk i HT29 LM3 og foreldre HT29 leversnitt metastase vev ble analysert ved IHC. (D) HT29 LM3 celler ble sortert for høy og lav CD44 uttrykk. Celler ble gated og sortert for å samle 10% av cellene med høy CD44 ekspresjon og celler med lav CD44 ekspresjon. (E) Analyse av CD44, p-MET, og c-MET uttrykk i foreldre HT29, HT29 LM3 CD44-, og HT29 LM3 CD44 + celler. (F) Analyse av p-MET, c-MET, CD44, p-AKT, og AKT uttrykk i foreldre HT29, HT29 LM3 CD44-, og HT29 LM3 CD44 + celler etter HGF (50 ng /ml, 5 min). Stimulering
IHC analyse av CD44 i HT29 LM3 vevssnitt viste variabel CD44 uttrykk i levermetastaser; klynger av levermetastaser med høyt uttrykk av CD44 ved metastaser med lav CD44 uttrykk (Figur 4C). For ytterligere å analysere dette fenomenet, brukte vi flowcytometri og celle sortering å isolere to populasjoner av celler basert på celleoverflaten CD44 uttrykk. To cellelinjer med høy CD44 uttrykk (HT29 LM3 CD44 +) og lav CD44 uttrykk (HT29 LM3 CD44-) ble etablert (figur 4D). CD44-ekspresjon i disse cellelinjene ble bekreftet ved Western blot-analyse. Både CD44 + og CD44- cellelinjer hadde høyere aktivering av c-Met i forhold til foreldrenes cellelinje (figur 4E).
For ytterligere å bekrefte at aktivering av c-MET er uavhengig av CD44 uttrykk i HT29 LM3 cellen linje, ble CD44 + og CD44- cellepopulasjoner stimulert med HGF og analysert ved hjelp av Western blot. Som vist på figur 4F, et tilsvarende nivå av c-MET-aktivering i CD44 + og CD44- celler ble observert. Derfor viser vi at nivået av CD44 uttrykk i
i
vivo
trent HT29 LM3 celler ikke korrelerer med c-Met aktiveringsnivå ved sin naturlige ligand, HGF, ytterligere bekrefter at c- MET fungerer uavhengig av CD44 i HT29 LM3 cellelinje.
Aggressiv metastatisk Opptreden av HT29 LM3 er assosiert med en økt evne til å følge endotelceller, men er ikke drevet av CD44 uttrykk
Kreft celle adhesjon til endotelceller er en viktig skritt av metastase og er kjent for å bli regulert av CD44 i mange kreftceller [13]. HT29 LM3 og foreldre HT29 cellelinjer ble merket med Calcein AM og HT29 LM3 bindende evne til endotelceller ble evaluert med
i
vitro
vedheft analysen. Vi demonstrerte at HT29 LM3-celler hadde en økt evne til å feste til endotelceller, sammenlignet med foreldre HT29-celler (Figur 5A). Disse resultatene tyder på at jo mer aggressive metastatisk fenotype av HT29 LM3 celler er kan være et resultat av økt cellulær adhesjon til endotelceller.
(A) Adhesjon av foreldre HT29 og HT29 LM3 celler til HMVEC-L-celler ble vurdert som beskrevet i Materialer og Metoder. Viste data som mener fold endringer i antall foreldre HT29 celler festet til HMVEC-L-celler versus HT29 LM3 celler (* p 0,001). Representative bilder viser adhesjon av foreldrenes HT29 og HT29 LM3 celler til HMVEC-L-celler. (B) Fluorescent GFP avbildning av levermetastaser 4 uker etter intrasplenic injeksjon av HT29 LM3 CD44 + og HT29 LM3 CD44- celler (5 × 10
6, 100 mL PBS). IHC analyse av CD44 uttrykk i CD44 høy og CD44 lav CRC levermetastaser.
i
vitro
analyse av
i
vivo
valgt HT29-cellelinjer identifisert en økning i CD44 ekspresjon og c-Met aktivering. Etter adhesjon til endotelceller er en første avgjørende hastighetsbegrensende trinn i hematogenous CRC levermetastaser etter intrasplenic injeksjonen og CD44-reseptoren er kjent for å regulere kreftceller adhesjon [7], [12], vi neste undersøkt rollen til CD44 på CRC metastase
i
vivo
. HT29 LM3 CD44 + og HT29 LM3 CD44–celler ble injisert inn i milten i atymiske nakne mus. Fire uker etter injeksjon, ble fluorescerende GFP avbildning av CRC levermetastaser utført. Som vist i figur 5B, ble nivået av CD44 ekspresjon ikke har noen vesentlig effekt på CRC levermetastaser. CD44 uttrykk nivå i CD44 + og CD44- levermetastaser ble bekreftet med IHC farging. Sammen er disse funnene tyder på at overekspresjon av CD44 alene er ikke tilstrekkelig til å forbedre CRC levermetastaser og at andre veier sannsynligvis involvert.
Diskusjoner
Det mest ødeleggende aspektet av CRC er fremveksten av leveren metastaser, som er ansvarlig for de fleste av dødsfall fra denne sykdommen. Derfor, for å forstå de molekylære mekanismene for metastasering er en av de viktigste spørsmålene i kreftforskning. I henhold til konseptet med tumorcelle heterogenitet, sterkt metastatiske celler er til stede som et sub-populasjon i en primærtumor [14]. I dag er det ikke mulig å identifisere metastatisk og ikke-metastatiske celler i den primære tumor. I denne studien har vi benyttet en
i
vivo
utvalg modell for å identifisere molekylære markører for prediksjon av metastatisk potensial for CRC celler. Denne modellen for å injisere kreftceller i milten, høsting av levermetastaser, og re-injisering i milt, skaper svært metastatisk cellelinjer som bekreftes av et større antall lymfe og levermetastaser [15]. Tilsvarende vår studie viste at cellene skapes gjennom
i
vivo
utvalg syklus gitt omfattende levermetastaser og at aggressiv atferd av disse cellene er assosiert med endringer i CD44 uttrykk, c-MET aktivitet og økt evne til CRC-celler til å følge endotelceller. Derfor kan den modellen av
i
vivo
utvalg for metastatiske celler være et nyttig verktøy for å studere genetiske endringene som skjer i cellene når de skaffer metastatisk fenotype. Videre utnyttelse av denne modellen gir en bedre forståelse av mekanismene som driver kreft progresjon og kan brukes som et verktøy for å oppdage og utvikle potensielle terapeutiske mål for CRC metastaser.
c-MET og CD44 er co -expressed i en rekke kreftformer, så som kreft i bukspyttkjertelen og CRC [16], [17]. Kreft i bukspyttkjertelen celler med en høy ekspresjon av både c-MET og CD44 ble vist å ha en større karsinogent potensial [17]. Videre er ekspresjon av begge proteinene har blitt korrelert med en kortere overlevelsesperiode i CRC [3], og en nyere studie fra vårt laboratorium har vist at CD44 og c-MET aktivering er forbundet med en økning i CRC metastase [18]. I samsvar med disse funn resultatene av våre denne studien viser at en økning både i ekspresjon av CD44 og aktivering av c-MET samsvarer med en økning i den metastatisk potensial av HT29-cellelinjen LM3. CD44 og c-MET samarbeid, og deres interaksjoner på plasmamembranen, føre til aktivering av nedstrøms signalveier som fremmer kreft progresjon [19] – [21]. På den annen side har flere studier funnet at aktivering av c-MET er uavhengig av CD44 [22], [23]. Våre resultater tyder på at i det HT29 LM3-cellelinjen, CD44 og c-MET opptre uavhengig i nærvær eller fravær av HGF, en c-MET ligand. Avvik mellom studier kan forklares ved forskjeller i de cellelinjene som brukes, og indikerer at graden av interaksjonen mellom CD44 og c-MET kan være celletypespesifikk. Som begge proteiner har vært assosiert med dårlig prognose i en rekke kreftformer, er den videre studier av deres interaksjon med metastatisk cellelinjer kritisk viktig og kan føre til nye terapeutiske mål.
For å bedre forstå rollen av CD44 , benyttet vi to populasjoner av HT29 avledet celler, CD44 + og CD44-. Interessant, tyder våre data på at CD44 er ikke nøkkelen til proteinet som driver HT29-avledede celler til å bli stadig metastatisk, og som mest sannsynlig, c-Met aktivering eller andre reaksjonsveier øke CRC levermetastaser. I vår modell, CD44 og c-MET signal uavhengig av hverandre, noe som indikerer at c-MET signalering ikke er svekket i CD44- celler og fortsetter å kjøre metastaser. I tillegg er det mange isoformer av CD44, på grunn av alternativ spleising, som spiller ulike roller i metastase, noe som kan forklare avviket mellom rollene som CD44 i metastasering. Hver isoform spiller en annen rolle i kreftceller og enkelte kreft bare uttrykke en av isoformene mens andre uttrykker flere isoformer [7]. Derfor bestemme den nøyaktige funksjonen som CD44 spiller i hver kreftcellelinje blir stadig viktigere for utnyttelse av CD44 som et terapeutisk mål.
Konklusjoner
En grundig forståelse av de genetiske mekanismene som setter i gang den metastatisk kaskade og fremme CRC metastase progresjon i leveren er viktig for utvikling av nye anticancer terapi. Pure klonale bestander av isolerte lever-tropisk metastatiske celler tillatt oss å selektivt studere og sammenligne biologiske mekanismer medier CRC metastaser til leveren. Til sammen våre funn tyder på at aggressive metastatisk fenotype av
i
vivo
valgt HT29 cellelinje er forbundet med overekspresjon av CD44 og aktivering av c-MET. Vi viser at c-Met aktivering er CD44 uavhengig på HGF stimulering og bekrefte at CD44 uttrykk i HT29 LM3 cellelinje er ikke ansvarlig for økningen i metastatisk pene i HT29 LM3 cellelinje. Viktigere, viser vi at modellen av
i
vivo
utvalg for CRC metastatiske celler representerer et verdifullt verktøy for å identifisere hvilke mekanismer som bidrar til levermetastaser i CRC og identifisere molekylære stier for en målrettet behandling av CRC levermetastaser.
takk
forfatterne takker Donna Gilbreath og Heather Russell-Simmons for å få hjelp med manuskriptet forberedelser, Jennifer Strange og Greg Bauman for å få hjelp med FACS, og Dana Napier for sitt arbeid med Markey Biospecimen og vev anskaffelser Shared Resource Facility.
