Abstract
Fremveksten av massespektrometri (MS) -baserte signaturer som biomarkører har vakt stor begeistring blant onkologer. Men variasjoner i normale individer eksisterer også, og en bedre forståelse av serum peptid mønstre av friske personer vil være viktig for videre utforsking av sykdomsspesifikke serum peptid mønstre. Etter utviklingen av et serum peptid mønster plattform, analyserte vi 500 serumprøver hentet fra friske individer. Prøvene fra bryst (n = 84), lunge (n = 70), og rektal (n = 30) kreftpasienter ble også undersøkt. Omfattende data analyse viste ubetydelig bidrag alder til serum peptid mønstre unntatt hos friske personer mellom 20-30 og 60+ år. Kjønnsrelaterte variasjoner i serum mønstre av friske individer ble bare observert i 20-30 år gamle individer. Våre resultater viste betydelig variasjon i individuelle peptid profiler, men 65 peptidene ble oppdaget ved en 20% høyere frekvens i den friske befolkningen. Et peptid-profil ble utviklet for hver type kreft, som inneholder 10 diskriminerende peptider ikke utbredt i friske individer. Sekvens identifikasjon av 111 signatur peptider viste at de falt i flere tette klynger og de fleste var eksopeptidase produkter av serum bosatt proteiner. Vi har fått en MS-basert serum peptid profil for friske personer, noe som gir en referanse for å observere forekomst av kreftspesifikke peptider
Citation. Han K, Wen XY, Li AL, Li T, Wang J, Wang HX, et al. (2013) Serum Peptidome Variasjoner i en sunn befolkning: Referanse identifisere kreftspesifikk Peptider. PLoS ONE 8 (5): e63724. doi: 10,1371 /journal.pone.0063724
Redaktør: Philippe Rouet, I2MC INSERM UMR U1048, Frankrike
mottatt: 26 juni 2012; Godkjent: 11 april 2013; Publisert: 8. mai 2013
Copyright: © 2013 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Key Technology R D Program (2009BAK61B04), Innovation of Methodology (2010IM030300), National Natural Science Foundation of China (21007092), og tilskudd fra National Science and Technology Major Project (2008ZX10002-016). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Fremveksten veksten~~POS=HEADCOMP av massespektrometri (MS) -baserte signaturer som biomarkører har vakt stor begeistring blant onkologer og analytisk kjemi [1]. MS teknikker tillate oppløsning av hundrevis av små og mellomstore peptider fra bare mikroliter serum. Villanueva og kolleger vist at kreft kan oppdages og klassifisert basert på serum peptider som genereres som et resultat av tumor proteaseaktivitet [2]. Disse såkalte proteomikk mønstre inngått mainstream proteomikk med utgivelsen av en Lancet studie i 2002, som raskt ble etterfulgt av et betydelig antall undersøkelser og vurderinger. Flere nyere rapporter har fremhevet MS-baserte bestemmelser av spesifikke peptid mønster som indikerer tilstedeværelse av svulster med meget høy sensitivitet og spesifisitet [3] – [16]. Disse studiene har blitt utført på høyoppløselige instrumenter ved hjelp av matrise assistert laser desorpsjon /ionisering (MALDI) ion kilder og time-of-flight (TOF) ion detektorer [2], [10] – [16]. Mer avanserte instrumenter som Fourier Transform (FT) MS /MS tillater identifikasjon av et større antall peptidsekvenser
15. Nylig har affinitet perle basert rensing er utviklet og tatt i bruk av noen etterforskere, siden sfæriske perler har større kombinerte flater og en høyere bindingskapasitet enn liten diameter flekker [14] -. [19]
Mønsteret av serum peptider produsert av forskjellige sykdomstilstander har en stor del av sykdomsspesifikke diagnostisk informasjon. Håpet er at paneler av titalls til hundrevis av peptid markører kan transcendere heterogenitet av serumprøver for å generere en høy grad av diagnostisk spesifisitet. Måling paneler av peptidome markører kan være mer sensitiv og spesifikk enn konvensjonelle biomarkør tilnærminger. Imidlertid har kritikere uttrykt bekymring for flere kilder til skjevhet i serum proteomikk-baserte biomarkører. Blant dem, alder og kjønn er de viktigste kildene til skjevhet som kan påvirke sammensetningen og relative overflod av serum peptider [20]. Derfor vil en bedre forståelse av peptid mønstre i serum fra friske individer være viktig for videre utforsking av sykdomsspesifikke serum peptid profiler.
I denne studien har vi adressere om parameterne for kjønn og alder påvirker serum peptid mønstre i friske individer. Studien inkluderte 500 serumprøver fra friske menn og kvinner mellom 20 og 80 år. Prøver fra bryst, lunge, og rektale kreftpasienter ble undersøkt i tillegg. Omfattende data analyse viste ubetydelig bidrag alder til serum peptid mønstre unntatt hos friske personer mellom 20-30 og 60+ år. og at kjønnsrelatert variasjon i serummønstre hos friske individer forekom bare mellom 20-30 år. Våre resultater viser at peptid profiler varierte individuelt, men at 65 peptidene ble oppdaget ved en 20% høyere frekvens i den friske befolkningen. Et peptid-profil ble utviklet for hver type kreft, som inneholder 10 diskriminerende peptider ikke utbredt i friske individer. Sekvens identifikasjon av 111 signatur peptider viste at de falt i flere tette klynger og de fleste var eksopeptidase produkter av serum bosatt proteiner
Materialer og metoder
Reagens
Rensing kit kobber-chelated magnetiske kuler ble fremstilt fra vårt laboratorium [21]. Kalibreringsstandarder som inneholder ni peptider ble brukt som kunstige markører (Bruker Daltonik) og besto av følgende molekyler med molekylmasser som er gitt i parentes: angiotensin II (1046,54180), angiotensin I (1296,68480), substans P (1347.73540), bombesin (1619,82230) , ACTH clip1-17 (2093,08620), ACTH clip18-39 (2465,19830), somatostatin (3147,47100), Ins Bov (5734,55700), ubiquitin (8565,88500).
Den etikk uttalelse
Etter at vi innhentet godkjenning fra etisk komité av 301 General Hospital og etikk komité av den første kliniske sykehus i Jilin-universitetet, hadde alle givere signert samtykkeerklæringer.
Serumprøver prøver~~POS=HEADCOMP
Blodprøver prøver~~POS=HEADCOMP fra friske frivillige og ble samlet inn fra 301 General Hospital og utsatt for fysisk undersøkelse og definert som klinisk frisk. Pasienter diagnostisert med lungekreft, brystkreft og endetarmskreft ble samlet inn fra første kliniske sykehuset i Jilin universitet (tabell S1, Tabell S2 og Tabell S3). Alle prøver ble samlet opp følgende standard kliniske protokoll. De ikke-antikoagulert blodprøver ble innsamlet i morgen før giverne hadde frokost og lov til å koagulere ved romtemperatur i to timer, og sentrifugert ved 1500-2000 rpm i 15 min. Sera ble overført til fire cryovials, og lagret frosset ved -80 ° C inntil videre anvendelse. For reproduserbarhet forsøk ble serum fra blodprøver av 10 friske frivillige oppsamlet som kvalitetskontroll sera. Når serum kom massespektrometri (MS) laboratoriet, ble hver kryoampulle av prøven tint på is og brukes til å generere ti små alikvoter (20 ul hver) i mikro-Eppendorf-rør og oppbevares ved -80 ° C inntil videre anvendelse. Hver serumprøve hadde derfor vært frosset og tint to ganger før den ble utsatt for peptid utvinning og MS-analyse.
Kobber-chelated magnetiske kuler peptid utvinning og MALDI-TOF-MS (massespektrometri)
kobber-chelaterte magnetiske kuler fremstilt i vårt laboratorium ble anvendt for ekstraksjon av peptider med serum. En 5-pl alikvot av en homogen magnetiske kuler Løsningen ble overført til et 0,2 mL tynnvegget PCR-rør, og 50 ul bindings oppløsning ble tilsatt og blandet grundig. Rørene ble plassert i et magnetisk separator vulst (MBS) for å feste de magnetiske kuler, og supernatanten ble sugd. Etter bindingstrinnet, ble 20 ul bindingsløsning tilsatt og mikset i PCR-rør. Deretter ble 5 ul serumprøve tilsatt, blandet og deretter anbrakt i den MBS enheten. Supernatanten ble aspirert, og 100 ul av vaskeoppløsning ble tilsatt og blandet med de magnetiske kuler. Etter siste vasketrinn, ble bundet peptider eluert ved inkubering av 20 pl eluering løsning i 10 minutter før oppsamling elueringsoppløsningen ved hjelp av MBS-enheten. 1 mL av elueringsmiddel ble blandet med 1 pl av matriksen (HCCA) løsning. 1 mL ble oppdaget på en 600 mikrometer diameter spot størrelse 384 MTP sikteplate (Bruker Daltonik) og tørkes. Peptidet og proteinet kalibreringsstandard (1 ul) i den samme matriks ble anvendt for å målrette flekker i nærhet til serumprøvene for utvendig kalibrering av instrumentet. De behandlede prøvene ble analysert ved hjelp av en foring MALDI-TOF /TOF massespektrometer (Ultraflex; Bruker Daltonics) er utstyrt med en pulset kilde ione-ekstraksjon. Den MALDI-TOF-MS system ble kontrollert av flex kontroll programvare v.2.0 (Bruker Daltonics). Ionisering ble oppnådd ved bestråling med en laser nitrogen (337 nm) som opererer ved 4 Hz. Ioner ble akselerert ved 20 kV med 250 ns av pulset ion utvinning forsinkelse. Hvert spektrum ble påvist i lineær positiv modus og er eksternt kalibrert ved bruk av en blanding av peptid /proteinstandarder mellom 1000 og 10 000 Da.
Peptidsekvensering
FT-ICR tandem massespektrometer (Bruker Daltonics) er utstyrt med en 9,4 T superledende magnet og nano HPLC system. Vi brukte nanoESI kilde utstyrt med en vinklet off-axis sprøytesystem i positiv ionemodus. Den spenning som påtrykkes det metall-belagte kapillar inngangen til den elektrospray kilde var satt mellom-1200 V og -1600 V. De ekstraherte peptider ble avsaltet og sekvensert ved autoMSn modus med MS /MS støtfunksjonen. Q FTMS ble satt opp for å gjøre MS /MS skanne. Den valgte ion ble fragmentert av kollisjon indusert dissosiasjon (CID). Alle massespektra ble kjøpt i bredbåndsmodus i masseområdet fra m /z 300-3000 med 512 k datapunkter. Spektrene ble kalibrert eksternt med Agilent ES tuning mix (katalognummer G2421A, Palo Alto, California) med fire-punkts kalibrering. Instrumentet ble kontrollert ved hjelp av programvare Apex 1.0 og dataene ble analysert ved dataanalyse 3.4. (Bruker Daltonics). Alle MS /MS-data i et løp ble deconvoluted og deretter overført til en fil (.mgf), og var innspill til søkemotor Mascot (www.matrixscience.com). Peptide masse toleranse ble satt til 10 ppm, fragment ion masse toleranse ble satt til 0,01, og massen type forelder peptid og peptid fragment ble satt til monoisotopic.
Signalbehandling
Spectra ble konvertert inn i excel-format inkludert m /z verdi og signalintensitet ved hjelp av FlexAnalysis 2.0-programvare. Hver eneste spektrum ble glattet kurve, baseline subtraksjon og peak merking. Alle Spectra kvalifiserte masse topper (signal-til-støy-forhold 5) med masse-til-charge forhold (m /z) mellom 1000 og 10 000 Dalton ble utarbeidet merket. Alle toppintensitetene ble normalisert til den totale ionestrøm fra m /z og alle spektra ble deretter tatt for justering. Vi normalisert og justert topper fra forskjellige spektra ved hjelp av vår MatchPeaks programvare. Innretting starter med den første toppen [hvis masse til-charge-forhold (m /z) er angitt med X] som et «anker». Hvis en annen topp har m /z = Y, definerer vi den relative masse feil å være | X _ Y | /X. Programvaren identifiserer to topper hvis den relative massen feilen er 0,3%. Etter normalisering og justering, ble topplistene så binned ved hjelp av oppløsning på toppene og et regneark ble opprettet for videre statistisk analyse.
Klassifisering
Simca P + ™ programvare, utviklet i Umetrics, var også brukt for visualisering og statistisk analyse ulike aldersgrupper av 500 friske personer. Etter signalbehandling, et grafisk seer for spektra i excel-format. Den Simca P + programvare begynne å analysere data ved hjelp av statistisk algoritme, Principle Component Analysis (PCA), Partial Least Square (PLS) og Orthoganal Signal Correction (OSC) og deretter eksportere Mass Spectra Viewer, et visuelt grensesnitt for behandlede spektrale data, plott. Til slutt i denne artikkelen, analyserte vi alle data ved hjelp av en enkel kjemometrisk tilnærming kalt Partial Least firkanter diskriminant analyse (PLS-DA)
Resultater
Serum peptid profilering
serum profilen av kobber-chelaterte magnetiske kule-bindende peptider ble påvist ved hjelp av MALDI-TOF-MS (figur 1A) og vises i henhold til masse: charge-forhold (m /z) (figur 1B). Prøvetaking etter samlingen var jevn, med 2 fryse-tine sykluser for å lagre og alikvote prøver for peptid utvinning og MS analyse. Peptidene ble ekstrahert med kobber-chelaterte magnetiske kuler, og ble vasket, eluert, blandes med matrise, og avsatt på MALDI skyteskiven, etterfulgt av MALDI-TOF-MS-analyse. Systemet reproduserbarhet ble først bestemt med hensyn på relative toppintensiteter (figur 1B). Prøver fra 500 friske personer i ulike aldre ble tilfeldig fordelt under bearbeiding og analyse. Etter at de behandlede spektra ble justert, ble dataene for hver prøve analyseres statistisk. Peptid profiler for alle prøvene ble analysert ved hjelp av Partial Least-Squares (PLS) algoritme (figur 1A) som inneholdes i SIMCA P + programvarepakken. Koeffisienten av varians (CV) for toppintensitet ble beregnet ved hjelp av 10 tilfeldig valgte topper med et signal: støyforhold 5 og m /z 1-10 kDa som representerer lav-, mellom-, og høymolekylære peptider. Maksimum masse skift over området 1-10 kDa var 0,012% for peptid kalibrering blandingen og 0,018% for den samlede serumprøve. Disse resultatene korrelerer med en variant av 1DA i den absolutte mengden skift for signalene 3000 Da. Innen-dag (figur 1B, tabell S4) og mellom-dag (tabell S4) CV for direkte MS analyse av peptidene var begge. 15%
(A) Study oversikt. Diagrammet viser utformingen av sunn serum peptidome demografiske studier, og den statistiske analysen tilnærmingen som brukes for kjønn og ulike aldersgrupper. (B) Eksempel på under kjøring reproduserbarheten av massespektra. Serum fra en samlet sunn prøve (10 personer) ble utarbeidet med kobber-chelated magnetiske kuler utvinning. Seks i en dag tilfeldig valgt spektra oppnådd ved MALDI-TOF MS og pseudo gel spektra benyttet i analysen. Analysen m /z er fra 1 til 10 KD KD. (C) Aldersfordeling av 500 friske personer. De fargede feltene viser de fem aldersgruppene som er brukt i denne studien. De svarte horisontale linjene representerer medianverdier for hver kohort. (D) Fordeling av 65 peptider med deres molekylvekt varierer.
Serum peptidome variabilitet
For å evaluere serum peptidome mangfold og mulige effekter av store demografiske parametere som kjønn og alder på serum peptid profilering, samlet vi blod fra 500 friske frivillige og forberedt prøvene ved hjelp av en standard klinisk protokoll. Frivillige ble valgt for studien å gi fem aldersgrupper: 20-30 år (61 kvinner og 22 menn), 30-40 år (68 kvinner og 52 menn), 40-50 år (78 kvinner og 92 menn) , 50-60 år (48 kvinner og 56 menn), og over 60 år (13 kvinner og 10 menn) (figur 1C). Serum peptid profiler med liknende chela motivene var affinitet-hentes samtidig. De samlede peptid profiler av alle prøvene ble analysert. Selv om peptid profilene varieres individuelt, ble 65 peptider detektert i en frekvens på mer enn 20% i den friske befolkningen, og deres m /z og hyppigheten av forekomst er oppført i figur 2. De fleste av de valgte topper tilsvarte peptider med molekyl masse mindre enn 5000 Da (figur 1D)
m /z (masse: charge-forhold). indikerer protonert gjennomsnittlig molekyl vekt (m + H) i lineær MALDI-TOF-MS. Red: null frekvens i kreft; Grønn: 20% frekvens; Blå: 20-50% frekvens; Grey: 50%
For å undersøke om de 65 peptidene representert serum peptid mønster av en sunn befolkning, vi også analysert hyppigheten av de 65 peptidene i sera av bryst (n = 84. ), lunge (n = 70), og rektal (n = 30) kreftpasienter. Våre resultater viste at de fleste av de 65 peptidene ble påvist i kreftpasienter med en frekvens som var signifikant forskjellig fra den friske befolkningen (figur 2). Det tyder på at de 65 peptidene kan utvikles til en signatur for friske individer og gi en referanse for å definere kreftspesifikke peptid mønstre. På den annen side, oppdaget vi 3 sett med 10 karakteristiske peptider med en høy frekvens i de tre forskjellige kreftformer henholdsvis (figur 3), og fant at de ikke hadde blitt observert i den friske befolkningen (figur 2).
Røde stjerne: forekomst i tre kreftformer med 20% frekvens; Blå stjerne. Forekomst i to av de tre kreft med 20% frekvens
Kjønns-forbundet serum peptid variasjonen var ubetydelig i de 500 prøvene (figur 4A), unntatt i gruppen av 20 -30-åringer. I aldersgruppen 20-30 år, de første fem PLS komponenter hadde en R
2 verdi av 0,82. Med økende alder, kjønn ble variabilitet lavere, og de første fem PLS komponenter hadde R «sup> 2 verdier mindre enn 0,5. Vår studie viste også ubetydelig aldersrelatert variasjon i sammenligninger mellom de fleste grupper. Figur 4B inneholder 3D-spredningsplott av de første tre PLS komponenter av hvert par av aldersgrupper. En vesentlig forskjell dukket opp bare i sammenkoblingen mellom 20-30 og 60-80 år gamle grupper, der de første fem PLS komponenter hatt en R
2 verdi på 0,64. Totalt sett er nærmere to aldersgruppene var, jo mindre variasjon (Figur 4B).
(A) 3D spredningsplott av PLS analyse på serum peptid profiler avledet fra mannlige (blå) og kvinnelige (rød) givere med ulike aldersgrupper. (B) 3D spredningsplott av PLS analyse på aldersrelatert variant av serum peptid profiler.
Serum peptid identifikasjon
For å få høyere selvtillit peptid identifikasjoner, ansatt vi en hybrid FT ICR MS /MS med en 9,4 T superledende magnet og nano-HPLC-system for å skaffe nøyaktige massemålinger (innenfor 2 ppm). Av peptidene fra friske individer og de tre grupper av kreftpasienter, ble 111 positivt identifisert ved databasesøk ved hjelp MASCOT (tabell 1). Legg merke til at m /z-verdier som er oppført i tabell 1 er monoisotopic og gjennomsnittlige isotopiske verdier + H [M + H] (i overensstemmelse med resultatene oppnådd med MALDI). Figur 5 viser et typisk eksempel på de data som oppnås for peptidet SSSYSKQFTSSTSYNRGDSTFESKSY (Fibrinogen α), som ble identifisert som en trippel-ladet ion med masse nøyaktighet på 0,3 ppm. De 111 peptidene ble avledet fra 20 naturlig forekommende serum-proteiner, inkludert fibrinpeptid α (FPA), ITIH4 og C3f. Interessant, bortsett fra i visse peptidsekvenser gruppert i sett med overlappende fragmenter innrettede innenfor hver gruppe på enten C eller N-terminale ende og med stigelignende trunkeringer ved de motsatte ender. Sekvens oppdrag enten hadde over terskel score eller var utvetydig tildelt som forløperen ion masse, og valgt fragment ion masser (y eller b) matchet et bestemt trinn i stigen.
(A) Base peak ion kromatogram av serum peptider. Pilen angir topp inkludert trippel-ladet peptid ved m /z 977,7690 (B) Massespektrum av ionekromatografi toppen angitt i (A), diamant angir forløper ion ved m /z 977,7690. Innsatsen er et forstørret bilde av den forløperion viser en trippel-ladet ion med høy masse nøyaktighet (0,3 ppm). (C) Tandem massespektrum av den trippel-ladet peptid ved m /z 977,7690 med aminosyresekvensen utledet fra y-ion-serien. Merk at y-ioner kommer på C endestasjonen og sekvensen leser derfor bakover.
Diskusjoner
Serum peptidome mangfold inneholder et rikt utvalg av sykdomsspesifikke diagnostiske informasjon. Sammensetningen av serum peptidome er en sann speilbilde av pågående cellulært og organsystem funksjon. Selv om dette betyr at undergrupper av serum peptidome kan potensielt reflektere subtile sykdoms hendelser i små vev volumer, betyr det også at peptidome er stadig varierende respons på løpende daglige fysiologiske hendelser [1], [22]. Onkologer og kliniske kjemikere frykter at nivået av enkelte peptider kan bli sterkt påvirket av en rekke ikke-sykdomsrelaterte epidemiologiske faktorer og normale fysiologiske forhold. Variasjoner i normale individer også eksistere og sannsynligvis bidrar til å vanskeligheten med å identifisere sykdomsspesifikke signaler i serum peptid profiler. Således, som med en hvilken som helst biomarkører, er stor forsiktighet for å redusere skjevhet. Ved å gjøre dette, må et stort antall friske individer måles for å definere en frisk serum peptid profil. Vi har utviklet en unik plattform for å studere en stor kohort av identisk samlet inn og behandlet prøver fra 500 friske menn og kvinner i alderen 20 til 80 år. Omfattende analyse av MALDI-TOF MS data har foreslått en ubetydelig kjønn bidrag til serum peptid mønstre i alle, men de 20-30 år gamle. Våre resultater viste videre at det var en betydelig forskjell i peptid sammensetning bare i parings mellom 20-30 og 60-80 år gamle aldersgrupper. Videre redusert variabilitet som grupper ble nærmere i alder.
Alder og kjønn er de viktigste potensielle kilder til skjevhet som kan påvirke den molekylære mønstre som vurderes for diagnostisk og prognostisk verktøy. Serum peptid profiler blir påvirket av variasjoner i genekspresjon og post-transkripsjon hendelser. Nylig Villanueva rapporterte ubetydelige forskjeller i serummønstre blant ulike aldersgrupper, men delt sine data inn i aldersgrupper av 20-35, 35-50 og 50-80 år (20). I våre forsøk, ble aldersgruppene delt inn i 10-års kohorter unntatt over 60 år, og sammenligninger produsert konsistente resultater for alle grupper unntatt de mellom 20-30 og over 60 år. I samsvar med rapporten fra Villanueva, ble kjønnsrelaterte variasjoner av serum profiler i friske individer observert bare i de 20-30 år gamle. Siden lunge, bryst og endetarmskreftpasienter i vår studie var hovedsakelig 40 år eller eldre, alder og kjønn er usannsynlig å skjevhet de kreft serum profiler. Imidlertid bør alder og kjønnsrelaterte forskjeller vurderes når studiene involverer kreftpasienter som er yngre enn 30 år gammel.
Andre potensielle skjevhet kilder inkludert prøvetaking, behandling og lagring, MS deteksjon, og data analysemetoder. Disse kildene har blitt undersøkt i tidligere studier og avhjelpes i våre eksperimenter. Kritisk viktige kilder til variasjon inkluderer blod samling rør, clotting tider og temperatur, og antall fryse-tine sykluser. Andre kilder er batch til batch-inkonsistens av de magnetiske kuler, MALDI prøve krystallisering, og nivået av laserbestråling [17], [23], [24]. I tillegg nøye kvalitetskontroll prosedyrene sikret konstant peptid utvinning og MS deteksjon forhold. Den magnetiske kuler reagent tilberedt på vår lab vises ubetydelig variasjon mellom partier. Den høye følsomhet og reproduserbarhet av magnetisk-perle-basert plattform for serum profilering, som ble fremmet av en fersk studie fra Villanueva et al, ble også oppnådd i vår studie [14] -. [16], [18]
peptider som er kjent for å variere naturlig med en høy insidens (som de 65 peptidene ble observert i mer enn 20% av den friske kullet i figur 2) kan enten være eliminert som diagnostiske markører eller mer grundig gransket for spesielle varianter som er spesifikke for sykdom. I motsetning til dette, peptider ble funnet til å variere på en lav frekvens er av større interesse for å biomarkører innsats. Vi har observert 3 sett med signaturer, hver inneholdende 10 kresne peptider. Hvert sett med 10 peptider var sterkt assosiert med en bestemt cancer, og var ikke til stede i serumet profilen mønster av friske befolkningen. Vi tror at tilnærming og funn er beskrevet i denne rapporten vil legge til forståelsen av serum peptid mangfold og har senere søknader i kliniske proteomikk.
Identiteten til både normale serum peptidomes og peptider som omfatter de diskriminerende ioner kan potensielt føre til innsikt om sine kilder og relasjoner til den underliggende fysiologi og patologi. Selv om fremskritt i MS nå gjøre det mulig å identifisere små og mellomstore peptider i serum med kun mikroliter-volum prøver, forblir denne teknologien en betydelig barriere for søknad til kliniske proteomikk. Den direkte identifikasjon av peptider i tryptisk-spaltet serum fremdeles vanskelig på grunn av kompleksiteten av prøver. En direkte MS /MS identifikasjon av peptider ved hjelp av MALDI TOF /TOF er ikke mulig på grunn av tilstedeværelsen av flere peptider, selv i små masse vinduer. Selv om aktiv nanoLC-MALDI kunne løse dette problem, tror vi at den beste metoden for å identifisere peptider i komplekse blandinger er Fourier-transformasjonen MS (FT-MS), i hvilken den nøyaktige massen av peptidet av interesse blir oppnådd [25] – [27 ]. Ved hjelp av FT-MS og berikelse strategier for å karakterisere lav molekylvekt av proteomet, har vi identifisert 111 peptider, inkludert 20 peptider med 20% frekvens i sunn sera (Figur 2, Figur 3 og Tabell 1), 6 diskriminerende ioner for lungekreft, 4 for endetarmskreft, og 8 for brystkreft (figur 3 og tabell 1).
Villanueva et al. rapporterte at sekvensen identifikasjon av 61 signatur peptider viste at de faller inn under flere tette klynger, og de fleste er generert av eksopeptidase aktiviteter der det gis kreft typespesifikke forskjeller [2]. Serum peptider ansatt som kreft signaturer er ikke klassiske markører, men de kan tjene som en endogen substrat basseng for de virkelige biomarkører, dvs. proteaser. Fordi de ikke er utgitt av kreft, er de sannsynligvis representere en ikke-spesifikk epiphenomenon assosiert med tilstedeværelse av kreft [1], [2], [23]. Vi har vist at de fleste av peptidene identifisert i både friske individer og kreftpasienter som var gruppert i sett av overlappende fragmenter i flukt med stigelignende trunkeringer; de fleste er eksopeptidase produkter av serum bosatt proteiner. Hvor peptidet profilering kan bidra mekanistisk til både kreftspesifikke og kreft typespesifikke klassifikasjoner er uforklart og kan kreve en stor del av fremtidige studier for å forstå. Likevel, forskjellene er statistisk signifikante, holder viktig informasjon som kan ha direkte klinisk nytte som surrogat biomarkører i form av proteomet metabolomic produkter. Vi tror at proteolytiske degraderende mønstre i serum peptidome av både kreftpasienter og friske kontroller holde informasjon som er viktig for å definere kreftspesifikke peptid profiler som kan ha direkte klinisk nytte som surrogat biomarkører.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1 . .
Brystkreftpasient demografi
doi: 10,1371 /journal.pone.0063724.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
endetarmskreft pasientdemografi
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063724.s002 plakater (DOC)
tabell S3.
Ikke-småcellet lungekreft pasientdemografi
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063724.s003 plakater (DOC)
Tabell S4.
reproduserbarhet av massespektra profilert av kobber-chelaterte perler og MALDI-TOF analyse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0063724.s004 plakater (DOC)
