Abstract
Stadig flere kreftformer har vist seg å være initiert og drevet av små subpopulasjoner av kreft stamceller (CSC). Men om tumor aggressivitet er drevet av CSC og ved hvilken grad denne egenskapen kan være relevant innenfor tumormassen er fortsatt uavklart. For å løse dette problemet, isolert vi en sjelden svulst celle befolkning på grunnlag av sin CD44
+ CD24
– fenotype fra menneske androgen-uavhengig prostata karsinom cellelinje DU145 og etablerte sine CSC egenskaper. Oppførselen til valgte CSC ble undersøkt med hensyn til bulk DU145 cellene. Injeksjon av CSC i nakne mus som genereres svært vaskulariserte tumorer infiltrerende de tilstøtende vev, som viser høy tetthet av neuroendokrine celler, og som uttrykker lave nivåer av E-cadherin og β-catenin, så vel som høye nivåer av vimentin. Tvert imot, når et tilsvarende antall av usorterte DU145-celler ble injisert de resulterende tumorene var mindre aggressive. For å undersøke de forskjellige funksjonene i svulster
in vivo
, ble påvirket av differensierte kreftceller på CSC undersøkt
in vitro
av økende CSC i fravær eller nærvær av kondisjonert medium fra DU145 cellene. CSC dyrket i givende forhold differensiert i celle populasjoner med funksjoner som ligner på de av celler holdt i aggressive svulster generert fra CSC injeksjon. En annen måte, for å kondisjonert medium indusert CSC differensiere til en celle fenotype kan sammenlignes med celler av knapt aggressive tumorer stammer fra masse DU145 celleinjeksjon. Disse resultatene viser for første gang at CSC er i stand til å generere differensierte celler som uttrykker enten høyt eller knapt aggressiv fenotype, og dermed påvirke prostatakreft progresjon. Skjebnen til CSC ble bestemt av signaler som frigjøres fra tumor miljø. Videre bruker microarray analyse vi valgt ut noen molekyler som kan være involvert i denne celle-til-celle signalisering, hypoteser deres potensielle verdi for prognostiske eller terapeutiske anvendelser
Citation. Salvatori L, Caporuscio F, Verdina A, Starace G, Crispi S, Nicotra MR, et al. (2012) Cell-til-Cell Signaling Påvirker Fate of Prostate Cancer Stem Cells og deres potensial til å generere mer aggressive kreftsvulster. PLoS ONE 7 (2): e31467. doi: 10,1371 /journal.pone.0031467
Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR), Italia
mottatt: 8 juni 2011; Akseptert: 9. januar 2012; Publisert: 06.02.2012
Copyright: © 2012 Salva et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av det italienske helsedepartementet (PRIN 2006062242). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostata adenokarsinom (PCA) er en ledende. dødsårsaken blant menn i USA og Vest-Europa [1]. På grunn av sin androgen-avhengige vekst, hormonbehandlede fortsatt den viktigste behandling av metastatisk sykdom. Selv om utgangspunktet effektiv, er denne behandlingen følges i noen få år etter tumorresidiv [2] hvori en androgen-uavhengig nevroendokrine (NE) subpopulasjon av celler som er antatt å spille en viktig rolle [3], [4]. NE celler er hvilende, terminalt differensierte celler kjennetegnet ved dendrite-lignende prosesser som strekker seg mellom tilstøtende celler og ved ekspresjon av neuronal-lignende proteiner så som CD56 og chromogranin A (CGA) som finnes i tette cytoplasmiske granuler [5]. Gjennom sekresjon av neuropeptider NE-celler modulerer aktiviteten til normal prostata epitel, men er også i stand til å påvirke tilstøtende transformerte epitelceller via parakrine signaler, og dermed stimulere tumorvekst og metastatisk kapasitet [5] – [7]. Faktisk er en øket NE cellepopulasjon i PCa antas å være forbundet med en mer aggressiv sykdom, mens et lavt antall NE celler i tumorvevet ikke har noen spesifikk prognostisk betydning [6], [8], [9]. Det er interessant både NE og sekretorisk epitelial slektslinje er avledet fra en felles pluripotent stamcelle prostata [10].
En ytterligere grunnleggende mekanismen som er involvert i utviklingen av PCa er redusert ekspresjon av E-cadherin, hovedtransmembran adhesjonsmolekylet ansvarlig for celle-til-celle-interaksjoner og vev organisasjon i epitel-celler [11], [12]. Gjennom den cytoplasmatiske domene, binder det β-catenin, noe som påvirker cytoskeletal ordning [13]. Som en konsekvens, er tap av E-cadherin funksjon eller uttrykk ansett som en viktig hendelse i avbrudd av celle-celle adhesjon og cytoskeletal arkitektur og i kjøp av en invasiv fenotype i tumorceller [14]. Spesielt i PCa ble lavere ekspresjon av E-cadherin assosiert med mer avansert stadium tumor og klasse [15], [16]. Dårlig differensiert prostata svulster viste også høyere uttrykk av vimentin, en cytoskeletal komponent ansvarlig for å opprettholde celle integritet og høye nivåer av vimentin korrelert med invasiv kapasitet på prostata kreft cellelinjer, inkludert DU145 [17].
Tradisjonelt svulster er blitt ansett for å være sammensatt av heterogene celler med sammenlignbare ubegrenset proliferativ og karsinogent potensial. Imidlertid har det nylig vært en teori om at det bare sjelden celler i tumoren, kalt cancer stamceller (CSC), er i stand til å formere seg i stor utstrekning og er tumorigen, mens de fleste av cellene i tumormassen viser en varierende grad av differensiering og gjennomgår en begrenset antall divisjoner. Deres bidrag til tumorvekst og metastatization er ansett for å være ganske begrenset. Viktigere, innebærer denne modellen behovet for en ny terapeutisk tilnærming spesielt rettet mot CSC i forsøket på å definitivt utrydde tumor [18]. Men om tumor aggressivitet er drevet av CSC og ved hvilken grad denne egenskapen kan være biologisk relevant innenfor naturlig forekommende tumormassen er fortsatt uavklart.
Som tilstedeværelse av CSC ved PCA [19] og prostata kreft cellelinjer [20] ble nylig demonstrert på basis av overflateantigene profilen CD44
+ /α
2β
1
hi /CD133
+ og CD44
+ CD24
– henholdsvis, i den foreliggende studie forsøkte vi å evaluere bidraget av CSC til tumorprogresjon. Vi isolerte CD44
+ CD24
– stem-lignende kreftceller fra androgen-uavhengig prostatakreft cellelinje DU145 avledet fra en hjernemetastasering av menneskelig PCA viste sine CSC egenskaper, og undersøkt deres fenotype og atferd i forhold til bulk DU145 cellene. Viktigere i denne modellen av prostatakreft observerte vi at CSC var i stand til å generere svært aggressive tumorer i NOD /SCID-mus, og at dette potensial var begrenset ved tilstedeværelsen av differensierte DU145-celler med påfølgende vekst av mindre aggressive tumorer. Konsekvent, ved å dyrke CSC i kondisjonert medium fra DU145-celler
in vitro
, vi avslørt at diffusible faktorer frigjort fra differensierte tumorceller var i stand til å beherske CSC fra å differensiere til cellepopulasjoner som viser en aggressiv fenotype og med egenskaper som ligner på dem av celler som holdes i tumorer generert i mus mot den injeksjon av CSC. Til slutt, funksjonell analyse av gener som finnes forskjellig uttrykt i CSC og DU145-celler ved mikromatriseanalyse bekreftet den avgjørende rolle i celle-til-celle-signalmolekyler for å bestemme oppførselen til CSC. Videre undersøkelser utført også i andre modeller av prostatakreft kan tildele prognostisk eller terapeutisk verdi til denne signaturen.
Resultater
Isolering og karakterisering av CSC fra DU145 prostatakreftceller
DU145 -celler ble anriket ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) for befolkningen som uttrykker CD44
+ CD24
– [20], som utgjorde omtrent 10% av bulk DU145-celler (Figur 1a). Vi testet stammen-lignende egenskaper av utvalgte celler til udiskutabelt beskrive dem som prostata CSC. En svært liten andel av CD44
+ CD24
– isolerte celler var i stand til å generere ikke-heft sfæriske klynger, betegnes kuler eller prostaspheres, i serumfritt medium tilsatt EGF, bFGF og insulin (Serum Replacement Medium, SRM ). Sfæroidene ble meget sakte, og nådde en størrelse på omtrent 300 um i løpet av 6-8 uker (figur 1B). Som forventet, ble sfæroider anriket for CD44
+ CD24
– celler, som bestemt ved både immunofluorescens (IF) farving (data ikke vist) og kvantitativ real-time PCR (Q-PCR-analyse), med sammenlignbare resultater. Faktisk, i sfæroider CD44 mRNA ble uttrykt på nivåer som ligner på DU145 celler, mens ekspresjonen av CD24 var signifikant lavere (figur 1C).
(A) FACS-analyse av CD44 og CD24 ekspresjon i DU145-celler. (B) Kultur for isolerte CD44
+ CD24
– celler som vokser i SRM som ikke-festede prostaspheres (5 × objektiv). (C) Q-PCR av CD44 og CD24 uttrykk i sfæroide og DU145 cellene. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra 3 eksperimenter. *,
p
0,05
vs
DU145 cellene. (D) selvfornyelse kapasitet på kulene. Serum tilskudd og tilbaketrekkingen av vekstfaktorer induserer veksten av sfæroide celler som adherente celler med morfologi (E), proliferasjon frekvens (F) og ekspresjon av vimentin (G) sammenlignes med DU145-celler. Fotografier av sfæroide celler ble tatt under et fasekontrastmikroskop etter 10 og 20 dagers vekst i FBS-inneholdende medium (20 x). De representative Western blot viser ekspresjonen av vimentin og β-aktin i sfæroide celler dyrket i FBS-supplert medium med hensyn til å kontrollere kuler og DU145-celler. Histogrammet viser densitometrisk kvantifisering av vimentin normalisert p-aktin nivåer. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. (H) Tumor forekomsten og ventetid etter injeksjon av en celleklump, 5000 eller 3 × 10
6 DU145 cellene i NOD /SCID-mus.
Spheroids inneholdt langsiktige selv fornye celler, som demonstrert ved evnen av en fraksjon av celler fra dissosierte kuler for å generere nye prostaspheres varte i over 5 passasjer (figur 1D).
Vi observerte at sfæroide celler viste differensiering kapasitet. Faktisk, når den tas ut av vekstfaktorer og utsatt for 10% FBS-inneholdende medium, en betydelig andel av sfæroide celler ble adherent, vokste som et flatt monolag og viste en heterogen morfologi svært lik DU145-celler etter 20 dager (figur 1E). I de tidlige dagene av vekst i disse givende forhold, sfæroide celler viste en dobling på ca 50 h som gradvis redusert til spredning rate av DU145 cellene, nemlig 30 timer, med start fra 15 dager kultur (figur 1F). Dessuten, for å bekrefte forekomsten av fenotypen av DU145 differensiert kreftceller vi analyserte ekspresjon av det mellomliggende filamentprotein vimentin. Faktisk har vimentin uttrykk blitt rapportert å være modulert i løpet av cellemodning i henhold til cellen avstamning [21] og ble funnet sterkt uttrykt i DU145 cellelinje [17]. Faktisk, etter 20 dager i FBS-supplert medium, vimentin-negative celler avledet fra sfæroider uttrykt vimentin på nivåer sammenlignbare med DU145 celler (figur 1G).
Til slutt bestemmes vi tumorfremkallende evne av sfæroide celler med hensyn til usorterte DU145 cellene inn immunsvikt mus. Injeksjon av en kuleformet på 300 pm i diameter, som inneholdt ca. 5000 celler, resulterte i tumorer i 80% av musene, mens injeksjon av 5.000 bulk DU145-celler generert tumorer hos 40% av dyrene (figur 1 H). Videre svulsten ventetid var også kortere i de sfæroide-injiserte mus enn i mus injisert med usorterte celler (37 og 54 dager, henholdsvis). Injeksjon av 3 x 10
6 DU145-celler, som ble brukt som kontroller, genereres tumorer med minst mulig venting på alle musene. I samsvar med en tidligere rapport [20], alle sammen tyder våre resultater på at CD44
+ CD24
– sfæroide celler til stede viktige biologiske egenskaper CSC siden de viste evne til selvfornyelse, var i stand til å differensiere i foreldre DU145 cellene og var mer tumorigen enn bulk DU145-celler når det samme antall celler ble injisert i mus.
heterogen sammensetning av sfæroider
spheroids opp til 300-400 pm i diameter viste en kompakt-arkitektur (figur 2A) på grunn av tilstedeværelsen av meget tette celle-til-celle-kontakter, som sett på transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Høyt strømforbruk forstørrelse viste flere junctional komplekser dannet av desmosomes og heft veikryss (figur 2B). Spheroid celler også presenteres atom pore komplekser organisert i Ring lameller (figur 2C), som anses forløpere i monteringen av den kjernefysiske konvolutten. De er vanligvis til stede i embryonale og umodne celler og forsvinner i løpet av differensiering [22]. Imidlertid sfæroider holder også differensierte celler som, i disse dyrkningsbetingelser selektive for stamceller, viste flere nivåer av celle degradering. Spesielt karakteristisk cytoplasmatiske blebs ble påvist (figur 2D), noe som indikerer at nedbrytningsfasen nærmet cellenekrose (figur 2F), mens kjerner først stort sett intakte (figur 2E). Disse skadene tyder på terminalen skjebne differensierte celler.
(A) Phase kontrast evaluering av spheroid struktur (10 ×). (B) TEM-analyse som viser desmosomer og adherente kryss (henholdsvis topp og bunn,) samt den Ring lameller (C) i sfæroide celler. (D) Fasekontrast (20 x) av et fragment av sfæroide omgitt av celler kjennetegnet ved utstående blebs av tom cytoplasma, noe som innebærer intakte atomkjerner som vist med DAPI farging (40 x, E). (F) farging med trypanblått viser tilstedeværelsen av døde celler i kuler (10 x). Immunfluorescens farging av en del av sfæroider og DU145-celler (opprinnelig forstørrelse x 200) som viser ekspresjon av E-cadherin (G), β-catenin (H) og vimentin (I).
Spheroids og DU145-celler ble også evaluert for ekspresjon av markører for spindelen (E-cadherin og β-catenin [23] – [25]), og differensierte celler (vimentin). Immunfluorescens farging identifisert E-cadherin og β-catenin ekspresjon i begge cellepopulasjoner, men på et høyere nivå i sfæroider (figurene 2G og 2H, henholdsvis). Spesielt, i sfæroide cellene E-cadherin og β-catenin farging ble lokalisert på plasmamembranen, mens det i DU145-celler var det hovedsakelig cytoplasmiske, noe som indikerer at differensierte tumorceller var ganske uavhengig av celle-til-celle-interaksjoner. Den modne fenotype av DU145-celler ble ledsaget av en høy ekspresjon av vimentin, som tvert imot, ble uttrykt bare av sjeldne celler i kulene (figur 2i). Derfor kan vi konkludere med at kulene er beriket for CSC, men også hatt noen skadede differensierte celler forutbestemt til nekrose.
Analyse av tumorer dyrket i mus
Sammenligning av svulster som genereres i NOD /SCID mus etter injeksjon av en sfæroide (inneholdende ca. 5000 totale celler, vurderer både CSC og skadede differensierte celler) eller 5.000 usorterte DU145-celler (som hovedsakelig består av differensierte celler og en meget liten prosentandel av CSC), flere makroskopiske forskjellene var tydelig ved tidspunktet for tumor eksisjon. Svulster fra kuler vokste dypt på injeksjonsstedet, invaderte tilstøtende vev og viste markert vaskularisering. Annerledes, svulster som stammer fra DU145 celleinjeksjon vokste overfladisk og virket godt avgrenset og mobil i forhold til omkringliggende vev. Synlige fartøyer var sjeldne eller fraværende (data ikke vist).
Disse forskjellene ble bekreftet ved histologisk analyse. Spheroid-deriverte svulster var sammensatt av monomorfe celler med en høy kjerne /cytoplasma ratio og presenterte en markert infiltrerende vekst preget av band invadere omkringliggende muskel-og fettvev (figur 3A, venstre panel). Tvert imot, ble svulster generert fra usorterte DU145-celler sammensatt av morfologisk heterogene subpopulasjoner av celler og viste en ekspansiv vekst, sammenpressing i stedet for å infiltrere de tilstøtende vertsvev (figur 3A, høyre panel). Interessant, svært invasive svulster viste lavere uttrykk for E-cadherin og β-catenin og høyere uttrykk av vimentin sammenlignet med knapt invasive svulster (Figur 3B). Spesielt, i hver tumor mønsteret av ekspresjon av disse 3 markørene var motsatt den til de celler som stammer fra selve svulsten, nemlig CSC eller DU145-celler (figurene 2G-2H).
(A) histologisk farging med H E av svulster vokst etter injeksjon av en celleklump eller 5000 DU145 cellene viser meget inngripende (venstre panel) og scantly invasiv (høyre) fenotype (5 ×). Stjernene viser grensene mellom svulster og omkringliggende vev. (B) Representative vestlige blotter som viser uttrykket av E-cadherin, β-catenin og vimentin i svulster. (C) IHC-farging med anti-muse-CD31-antistoff fremheve høyere fartøyet tetthet i sfæroide-avledede tumorer (merket med en stjerne, venstre panel) sammenlignet med svulster fra DU145-celler (høyre). (D) Q-PCR viser mus CD31 uttrykk i svulster. Mus B2M ble anvendt som endogene kontroll. Verdier er gjennomsnitt ± SEM fra 3 eksperimenter. *,
p
0,05 i forhold til svulster generert fra spheroid. (E) IHC med anti-CD56-antistoff som viser høyere tetthet av NE-celler i tumorer som er generert fra sfæroide enn fra DU145-celler (20 x). (F) Q-PCR som viser CGA mRNA-nivå i tumorer. Resultatene er uttrykt som forhold mellom mål-genet og den endogene kontroll GAPDH og representerer middelverdi ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. *,
p
0,05 med hensyn til svulster generert fra spheroid. (G) Et representativt FACS-analyse viser tilstedeværelse av CD44
+ CD24
– celler i tumorer som genereres fra injeksjon av en sfæroide i mus. Svulster som stammer fra injeksjons 5000 DU145-celler viste en sammenlignbar CD44
+ CD24
– cellepopulasjon (data ikke vist)
svulster som genereres fra sfæroider viste også en signifikant høyere antall. blodkar (
p
0,0001), som overvåket ved farging med endotel-cellemarkør CD31 (figur 3C, til venstre), sammenlignet med tumorer stammer fra DU145-celler (figur 3C, til høyre). Disse resultatene ble bekreftet ved analyse av CD31 mRNA-ekspresjon nivå (figur 3D) og indikerer aktiv neoangiogenesis i tumorer generert fra sfæroider. I tillegg har immunohistokjemisk (IHC) analyse viste et høyere antall celler positive for CD56, en markør for NE-celler, i mer invasive tumorer enn i mindre invasive tumorer (figur 3E). Denne observasjonen ble bekreftet ved sanntids-PCR-analyse av CGA, en ytterligere markør for NE-celler (figur 3F). Videre, FACS-analyse av tumorer skåret ut og fordøyd viste at begge typer av neoplasia inneholdt et tilsvarende CD44
+ CD24
– cellepopulasjon (figur 3G). Disse funnene gir bevis for at CSC var i stand til å generere svært invasive svulster i nakne mus. Men injeksjon av CSC med DU145 differensiert tumorceller (dvs. injeksjon av usorterte DU145 cellene) resulterte i veksten av svulster i lav grad av aggressivitet.
Effekt av kondisjonert medium fra DU145 cellene på differensiering av CSC
i lys av ovennevnte funn, undersøkte vi påvirkning av DU145 differensierte celler på utvalgte CD44
+ CD24
– prostata CSC
in vitro
. Dissekert sfæroider ble dyrket i DMEM supplert med FBS (for å simulere injeksjon av kuler i mus) eller i DMEM supplert med FBS hvori DU145-celler ble på forhånd er dyrket i 3 dager (kondisjonert medium (CM), for å simulere injeksjon av bulk DU145 cellene i mus). I begge dyrkningsbetingelser, CSC som inneholdes i kulene vokste i monolag, men deres proliferasjon ble signifikant redusert når de ble dyrket i 20 dager i CM (-47%; Figur 4A). Inhiberingen av sfæroide proliferasjon ble ytterligere forbedret ved å øke konsentrasjonen av CM (data ikke vist). Dessuten virket det helt tydelig at celler dyrket i FBS-inneholdende medium ble helt uavhengig av celle-til-celle-interaksjoner som de vokste hovedsakelig enkeltvis eller i små grupper med uregelmessig form, og deres morfologi og vekstmønsteret var lik dem fra DU145 celler (figur 4B, venstre panel). Tvert imot, celler i CM var tette hverandre og vokste hovedsakelig som roundish øyer (figur 4B, høyre panel). Interessant, etter 20 dager, og bare i plater inneholdende FBS-supplert medium, observerte vi utseendet av celler som oppviser den dendritt-lignende morfologi som er typisk for NE-celler (figur 4B, venstre panel og figur 4C). Identiteten til disse cellene ble bekreftet ved evaluering av CD56-ekspresjon i de cytoplasmiske granuler av NE-celler (figur 4C, høyre panel). Analyse av ekspresjonen av markører for stilk og differensierte celler fremhevet at etter 20 dager i FBS-inneholdende medium, celler viste nivåer av E-cadherin, β-catenin og vimentin kan sammenlignes med de som er vist ved DU145-celler (Figur 4D). Tvert imot, celler dyrket i 20 dager i CM oppviste nivåer av ekspresjon mellomliggende mellom de som er vist ved hjelp av styre CSC og DU145 celler, men nærmere til nivåene av CSC. Spesielt er en reduksjon i ekspresjon av E-cadherin og β-catenin og en svak økning i nivået av vimentin med hensyn til å styre kulene var tydelig (figur 4D). Det er av interesse å merke seg at både den høye uttrykk for adhesjonsmolekyler og den lave uttrykk for vimentin indikert sterke celle-til-celle interaksjoner og redusert cellemotilitet, henholdsvis som avtalt godt med den særegne cellevekst som øyer. Disse resultatene indikerer at CSC dyrket i permissive betingelser var i stand til å generere terminalt differensierte celler, nemlig DU145 og NE-celler. Men diffusible faktorer frigjøres fra DU145 cellene forhindret differensiering av CSC.
(A) Spredning av CSC inngår i kulene dyrket i FBS holdig medium eller i CM fra DU145 cellene ble evaluert på ulike tider av kultur. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM fra 3 eksperimenter. Stjernene indikerer en signifikant inhiberende virkning av CM med hensyn på FBS-medium (*,
p
0,05). (B) Fasekontrast (10 x) av celler etter 20 dager i FBS-inneholdende medium eller i CM viser forskjellig mønster av cellevekst. I venstre panel, understreker rektangel tilstedeværelsen av NE celler. (C) Fase kontrast (venstre, 20 ×) og IF flekker (til høyre, 40 ×) av forgrenede NE celler generert fra CSC dyrket i FBS-medium. Spesielt viser høyre panel uttrykket av CD56 i cytoplasma og i de lange celleprosesser. (D) Representative Western blot som viser endringer i ekspresjon av E-cadherin, β-catenin, og vimentin i sfæroid CSC dyrket på de forskjellige dyrkingsbetingelsene med hensyn til å kontrollere kuler og DU145-celler. Uttrykket nivåer av de 3 proteinene ble bestemt ved densitometrisk analyse av de respektive bånd og normaliserte p-actin nivåer. Verdier rapportert i histogrammet er gjennomsnitt ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter.
Gene uttrykk profilen til CSC og DU145 cellene
For å undersøke cellulære responsen involvert i tumordannelse både på nivå med genekspresjon og i pre-mRNA spleising nivå, utførte vi en hel genom, spleising-sensitive microarray analyse av DU145 celler og deres valgt CSC. RNA prøver fremstilt fra hver cellepopulasjonen ble hybridisert til human Exon 1,0 ST Arrays, som tillater definisjonen av begge transkripsjonsmønstre (gen-nivå analyse) og alternative pre-mRNA modnings hendelser (exon-nivå analyse). Gene-nivå uttrykk profilering ble oppdaget av lineære modell statistikk ved hjelp av en empirisk Bayes metode for å moderere standardfeil. For å evaluere transkripsjons modifikasjoner, analyserte vi genuttrykk endringer i spheroid CSC
vs
DU145 cellene. For å identifisere differensielt uttrykte gener, søkte vi en absolutt log
2 ganger endring ≥ +/- 1 og en P-value≤0.05 som tidsavgrensninger. Kompleksiteten av datasettet ble redusert ved å fjerne de ikke-signifikante sondesett (de som ikke uttrykkes, og de som ikke endrer). På denne måte mer enn 400 gener hvis nivåene var signifikant forskjellige i CSC og DU145-celler ble utvalgt. En fullstendig liste over de differensielt uttrykte gener er funnet i tabell S1.
Analyse av utvalgte gener
De differensielt uttrykte gener ble analysert for deres molekylære og cellulære funksjoner og tilhørende veier ved hjelp av oppfinnsomhet Pathways Analysis programvare (IPA 7.0, Oppfinnsomhet Systems). IPA analysen identifisert mer enn 70 funksjonelle klasser, og blant dem, har vi valgt de 8 mest konsekvente klasser funnet beriket innenfor det sett av differensielt uttrykte gener (dvs. kreft, cellebevegelse, cellevekst og spredning, celle morfologi, celledød, mobilnettet utvikling, cellesyklus, celle-til-celle-signalisering og interaksjon, figur 5A) som var egnet til å karakterisere CSC og DU145-celler. Vi kombinerte genene fra de 8 utvalgte funksjonelle klasser, oppdager 22 vanlige gener fortsatt viser funksjonelle linker. Disse ble deretter separert i henhold til deres cellulær lokalisering. Interessant, videre analyse av de sub-valgte gener viste at 17 av 22 genprodukter ble lokalisert på plasmamembranen, eller ble utskilt i det ekstracellulære rom (figur 5B), styrke våre ovennevnte funn som viser viktigheten av interaksjoner mellom CSC og mikromiljøet. Selv om utvalgte gener kodet proteiner med en lang rekke funksjoner, kan 4 hovedgrupper identifiseres: 1) Pro-angiogene faktorer Angiopoietin 2 (ANGPT2), vaskulær endotelial vekstfaktor C (VEGFC) og cystein-rike angiogen induser 61 (CYR61) ble funnet nedregulert i CSC med hensyn til DU145-celler; 2) Gener som koder for adhesjonsmolekyler E-cadherin (CDH1), integrin beta 6 (ITGB6) og krysset plakoglobin (JUP) ble uttrykt mer i CSC etter avtale med parallell nedregulering av caveolae protein (CAV1); 3) tumorsuppressorgener lipokalin 2 (LCN2), dipeptidylpeptidase-4 (DPP4), insulinlignende vekstfaktorbindende protein 3 (IGFBP3), tioredoksin samspill protein (TXNIP) og Kruppel-lignende faktor 4 (KLF4) ble oppregulert i CSC; 4) diffusjonsevne faktorer som er relevante i opprettholdelsen av stamcelle nisje så som epidermal vekstfaktor (EGF), benmorfogent protein 4 (BMP4) og transformerende vekstfaktor beta 2 (TGFB2) var også forskjellig uttrykt i CSC og DU145-celler. Bemerkelsesverdig, 19 av 22 gener som vi identifiserte var ikke tidligere beskrevet å være unormalt uttrykt i prostata CSC. Disse data bekrefter at interaksjoner med mikromiljøet har en avgjørende rolle i kontrollen av fenotypen til CSC og foreslår at et begrenset antall av gener som har relevans i CSC-signalering vil måtte undersøkes. Videre har de fleste av de 22 utvalgte gener kunne være nye markører for prostata CSC.
(A) Valgte 8 beste biologiske funksjoner som finnes anriket innenfor settet av transkripter modulert i CSC med hensyn til total DU145-celler ved mikromatriseanalyse. (B) De 22 deregulerte gener, som bestemmes av IPA, er plassert i subcellulære oppsett, og relasjoner er merket med piler: fylte og stiplede linjer piler markere direkte og indirekte vekselsvis. Gener i rødt viste økt uttrykk i CSC, mens genene i grønt ble nedregulert. (C) Forskjeller i genekspresjon bestemt ved mikromatriseanalyse ble bekreftet ved Q-PCR, å velge 7 representative gener blant utvalgte 22. Resultatene er uttrykt som forholdet mellom hvert mål-genet og den endogene kontroll GAPDH. Ekspresjon i CSC ble sammenlignet med det som ble observert i DU145-celler til hvilken en verdi lik 1 ble vilkårlig tildelt. Verdier er gjennomsnitt ± SEM fra 3 eksperimenter. *,
p
0,05 i forhold til DU145 cellene
Validering av genuttrykk
For å bekrefte forskjeller i genuttrykk funnet av microarray analyse, Q. PCR ble utført for 7 differensielt uttrykte gener (CDH1, CYR61, DPP4, IGFBP3, ITGB6, LCN2, TGFB2). I alle tilfeller, ble forskjellene i mRNA nivåer bekreftet (figur 5C).
rolle sti E-cadherin i differensiering av CSC
Q-PCR-analyse viste at mRNA uttrykk av lipokalin 2 og E-cadherin fulgte et tilsvarende trend i CSC, DU145-celler og i CSC dyrket i 20 dager i FBS-inneholdende medium eller i CM. Spesielt mRNA-nivåer av begge genene var meget høy i CSC som inneholdes i kulene, ble redusert i CSC dyrket i CM og var betydelig lavere, og kan sammenlignes i CSC dyrket i FBS-medium og i DU145-celler (figur 6). Denne trenden var i samsvar med modulering av β-catenin uttrykk tidligere observert i de samme dyrkningsforhold (Figur 4D). Til sammen indikerer disse resultatene at sti av E-cadherin er modulert under CSC differensiering.
Q-PCR viser endringer i mRNA-nivåer for lipokalin-2 og E-cadherin i DU145-celler, CSC som finnes i kontroll-sfæroider og CSC dyrket i 20 dager i FBS-medium eller CM fra DU145 cellene. Data representerer gjennomsnitt ± SEM fra 3 individuelle eksperimenter. Stjernene viser en signifikant forskjell (*,
p
0,05).
Diskusjoner
tumorigenitet av prostata CSC
CD44
+ CD24
– celler isolert fra DU145 prostata carcinoma cellelinje ved bruk av celleoverflatemarkører var i stand til å vokse som ikke-adherente sfæroider i serumfritt medium supplert med spesifikke vekstfaktorer. Som et resultat av asymmetriske stilk celledeling sfæroider ble anriket med hensyn til kreft stamceller (CSC), men også holdt en prosentandel av differensierte celler nærmer nekrose. Det bør bemerkes at CSC var i stand til å gjennomgå asymmetrisk fordeling også
in vivo
fordi etter injeksjon i mus, begge produsert differensierte celler som utgjorde hoveddelen av tumoren og selv-fornyes seg som demonstrert ved nærvær av CD44
+ CD24
– celler i alle skåret svulster
Et slående forskjell i tumorigent kapasitet ble vist av de ulike forekomsten og ventetid av svulster som stammer fra spheroid CSC eller DU145 cellene injeksjon, med den tidligere. cellepopulasjon blir mer tumorigent. Vi foreslår at forsinkelsen i tumordannelse etter injeksjon av 5.000 DU145-celler kunne tilskrives den ubetydelig antall CSC holdt i DU145 celler injisert i forhold til den anrikede mengde CSC som inneholdes i hver sfæroide. Disse funnene og dette forslaget ble ytterligere bekreftet ved injeksjon av 3 × 10
6 DU145 celler, som holdt en større mengde av CSC enn en celleklump og genererte svulster på bare en uke.
Viktigere, videre
