Abstract
Bakgrunn
Mesenchymale stromale celler kan representere en ideell kandidat til å levere anti-kreft narkotika. I en tidligere studie, viste vi at eksponering av mus benmarg avledet stromale celler til Doxorubicin ledet dem til å tilegne seg anti-proliferativ potensial til co-kultivert hematopoietiske stamceller (HSCs). Vi så en hypotese om nylig isolerte humane benmargs stamceller (hMSCs) og Eldre murine stromale celler (SR4987 linje) primet
in vitro
med anti-kreft narkotika og deretter lokalisert nær kreftceller, kan hemme spredning.
Metoder og hovedfunnene
Paclitaxel (PTX) ble brukt til å prime kultur hMSCs og SR4987. Innlemmelse av PTX inn hMSCs ble studert ved hjelp FICT merkede-PTX og analysert ved FACS og konfokalmikroskopi. Frigjøring av PTX i kulturmedium ved PTX primet hMSCs (hMSCsPTX) ble undersøkt ved HPLC. Kultur av endotelceller (ECS) og aorta ring-analyse ble anvendt for å teste den anti-angiogene aktivitet av hMSCsPTX og PTX primet SR4987 (SR4987PTX), mens anti-tumor aktivitet ble testet
in vitro
på proliferasjonen av forskjellige tumorcellelinjer og in vivo ved co-transplanterer hMSCsPTX og SR4987PTX med kreftceller i mus. Ikke desto mindre, til tross for et tap av celler på grunn av kjemoterapi-indusert apoptose, både hMSCs og SR4987 var i stand til raskt å innlemme PTX og kan langsomt slipper PTX i kulturmediet i en tidsavhengig måte. PTX primet celler kjøpt en potent anti-tumor og anti-angiogen aktivitet
in vitro Hotell som var doseavhengig, og påviselig ved hjelp av deres kondisjonert medium eller ved co-kultur analysen. Endelig hMSCsPTX og SR4987PTX co-injisert med humane kreftceller (DU145 og U87MG) og mus melanomceller (B16) i immunodeficient og i syngene mus betydelig forsinket svulst tar og redusert tumorvekst.
Konklusjoner
Disse data viser for første gang, at uten noen genetisk manipulasjon, kan mesenchymale stromaceller opptak og deretter langsomt slipper PTX. Dette kan føre til potensielle nye verktøy for å øke effekten av kreftbehandling
Citation. Pessina A, Bonomi A, Coccè V, Invernici G, Navone S, Cavicchini L, et al. (2011) Mesenchymale stromale celler primet med Paclitaxel Gi en ny tilnærming for Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (12): e28321. doi: 10,1371 /journal.pone.0028321
Redaktør: Marc Tjwa, Universitetet i Frankfurt – universitetssykehus Frankfurt, Tyskland
mottatt: 15 april 2011; Godkjent: 05.11.2011; Publisert: 20.12.2011
Copyright: © 2011 Pessina et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble delvis støttet av AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) Prosjekt AIRC IG-9062, National italiensk Grant PUR 2008 og Fondazione Banca del Monte di Lombardia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hoved~~POS=TRUNC i kreft kjemoterapi er å lokalisere stoffet effekt i svulsten mikromiljøet for å drepe så mange kreftceller som mulig mens produsere den laveste sivile toksisitet. For å gjøre dette, et betydelig antall tekniske tilnærminger, fra bruk av giftige immunkonjugater for målretting tumorspesifikke antigener [1] til avansert bruk av nanopartikler [2] eller manipulerte stamceller [3] for levering narkotika, har blitt undersøkt og publisert i løpet av de siste 20 årene. Siden stamceller (MSC) lett tilpasse seg kultur nødvendige betingelser for
in vitro
manipulasjon og hjem til patologisk vev når injiseres
in vivo
, disse cellene ser ut til å representere det beste valget for å levere anti -tumor midler [4], [5]. Transgene fremgangsmåter har vært brukt for å indusere MSC for å utskille terapeutiske cytokiner eller vekstfaktorer og hemmende [6], [7]. Nyere data har vist at konstruerte MSC produsere anti-tumor faktorer som har kapasitet til å drepe kreftceller både
in vitro Hotell og
in vivo product: [3], [8] – [12]. Selv om det er lovende resultater på dyr, den genetisk manipulering av MSC i klinisk anvendelse i mennesker har noen risiko [13].
I en tidligere studie, viste vi at mus beinmarg (BM) avledet stromal celle (SR4987 cellelinje) dyrket i nærvær av doksorubicin (DXR), en potent anti-kreft-forbindelse, var i stand til opptak betydelige mengder av medikamentet uten å vise betydelige tegn på toksisitet. I motsetning til dette, hematopoetiske stamceller (HSCs) fra BM var meget følsomt overfor DXR. Interessant, observerte vi en signifikant hemming av HSCs-induserte kolonidannelse enheter (CFU) om co-dyrket med SR4987 først grunnes med DXR. Vi konkluderte med at murine stromale celler kan virke som et reservoar for det DXR, senere, kan avgi noen DXR metabolitter eller til og med DXR i sin opprinnelige form, hvilket leder til HSCs-indusert CFU-inhibering [14]. Følgelig hypotese vi at også
in vivo
, BM stromale celler kan spille en dobbelt rolle i å kontrollere legemiddeltoksisitet, avhengig av deres evne til opptak og frigjøre kjemoterapeutiske medikamenter [14]. Vurderer disse egenskapene, vi her undersøke om menneske MSC (hMSCs) nylagde fra BM og mus SR4987, etter priming med kreft og antiangiogene narkotika paclitaxel (PTX), kan erverve evnen til å drepe kreftceller (TCS) i deres nærhet .
Paclitaxel er en svært lipofilt stoff (avledet fra
stillehavsbarlind
), svært aktiv på mange solide svulster og også i stand til å hemme endotelceller spredning. Paclitaxel påvirker cytoskjelettet ved å fremme microtubule polymerisasjon som induserer mitotisk arrest av cellen [15], [16].
Vi viser for første gang, at i en tid avhengig kinetikk, hMSCs og mus SR4987 primet med PTX (MSCsPTX, SR4987PTX) slipper stoffet i en mengde nok til å påvirke tumor spredning, for å drepe endotelceller (ECS)
in vitro Hotell og, viktigst av alt, for å redusere tumorvekst
in vivo
. Våre resultater er den første demonstrasjonen som, gjennom en enkel
in vitro
prosedyre, kan hMSCs og mus stromale celler være lastet med anti-kreft narkotika og brukes
in vivo
å slippe dem inn i en svulst mikromiljøet.
Resultater
Karakterisering av MSC, P-glykoprotein (P-gp) uttrykk og følsomhet for PTX
cellene som brukes i denne studien var tre forskjellige friske preparater av hMSCs og musa stromal-cellelinjen SR4987 [17]. Helstøpt hMSCs ble analysert for å bekrefte uttrykk for MSC markører samt deres multipotential differensiering kapasitet. De var positive for CD44 +, CD73 +, CD90 +, CD105 +, og HLA-I og negative for CD14-, CD31-, CD34-, CD45-, CD80- og HLA-II. Når dyrket under differensierende forhold, kjøpte de osteo-adipo og kondroblaster markører (Fig. S1). Vi vurderte neste følsomheten av hMSCs og SR4987 til PTX, i en 24 timers test cytotoksisitet og i en anti-proliferasjonsanalyse på 7 dager (Fig. 1A, B). SR4987 og hMSCs var følsomme for den anti-proliferative aktivitet av PTX, i henhold til en doseavhengig kinetikk med en IC
50 verdi på 25,6 ± 11,08 ng /ml og 4,07 ± 1,75 ng /ml henholdsvis. I motsetning til både SR4987 og hMSCs var sterkt resistente mot PTX direkte cytotoksisitet, med meget lite celledød, selv ved konsentrasjoner høyere enn 10.000 ng /ml (Fig. 1A, B). Inhiberingen av hMSCs og SR4987 proliferasjon av PTX ble bekreftet ved å utføre cellesyklusanalyse, og viser signifikant akkumulering av celler i S, og i en mindre grad, G2 /M-fasen. Levedyktigheten av både hMSCs og SR4987-celler ble ikke påvirket i betydelig grad og cellene løsnet, vasket og dyrket i fravær av medikament ga en celle monosjikt med en cellelevedyktighet i området fra kontroller og en cellesyklus mønster gjenopprettet etter 72 timer (fig. S2 ). Disse dataene har blitt bekreftet av prosenter av apoptotiske /nekrotiske celler telles i de ulike forsøksbetingelser ved Annexin analysen (tabell S1). Behandlingen ikke produserer noe tap av celler på grunn av kjemoterapi-indusert apoptose, selv om den bare signifikant økning i apoptose (P 0,05) ble påvist i SR4987-celler (ved 24 timers behandling med PTX), som utvinnes etter medikament erstatning (24 + 24 h). Disse dataene er i overensstemmelse med rapporter om andre forfattere om følsomheten av stromale celler til Paclitaxel [18], [19].
Ulike konsentrasjoner av PTX (0,1 til 10,000 ng /ml) ble tilsatt til kultur av hMSCs (fig. 1A) og mus SR4987 (fig. 1B). Den cytotoksiske aktivitet ble bedømt ved 24 timer av behandlingen; effekten på spredning på 7 dag med kultur av en MTT analyse. Optisk tetthet målt i kulturer av MSC som ikke mottar PTX ble ansett som 100% spredning. Legg merke til at konsentrasjonen av PTX opp til 10.000 ng /ml ikke påvirker verken hMSCs eller SR4987 celle levedyktighet. De små bord setter i A og B indikerer IC
50 og IC
90 indusert av PTX på hMSCs og SR4987 hhv. Både betinget media (CM) fra PTX primet celler (hMSCsPTX-CM og SR4987PTX-CM) ga en doseavhengig vekst hemming av MOLT-4 rapportert (Fig. 1C) som prosent av det som produseres av CM fra ubehandlede celler (hMSCs-CM og SR4987-CM). Legg merke til at ved 1:16 fortynning av både hMSCsPTX-CM og SR4987PTX-CM produsert 100% veksthemming er lik de som ble oppnådd med 3,13 ng /ml PTX. Dette biologisk analyse ble anvendt for å beregne PEC utgitt av enkelt PTX behandlet HMSC og dets akkumulering i kulturmediet i løpet av tiden (D). Histogrammet viser PEC utgitt av hMSCPTX på ulike tider av kultur. Kurven viser PEC opphopning i hMSCsPTX-CM. Merk at hver hMSCPTX utgivelser rundt 1 pg av PEC i 24 timer, og nådde en maksimal oppsamling av rundt 1,7 pg etter 144 timer. Verdi er gjennomsnitt ± standard avvik (SD) av fem uavhengige eksperimenter.
Både hMSCs og SR4987 celler uttrykte P-gp ble ned-modulert ved behandling med PTX og med verapamil (VP). Tilstedeværelsen av VP økt SR4987 følsomhet for anti-spredning aktivitet av PTX, mens det ikke var effektive på hMSCs (Fig. S3).
PTX-opptak og frigjøring av hMSCs
Basert på tidligere studier [14], under-sammenflytende kultur (3 x 10
5) av adherente hMSCs ble eksponert i 24 timer til 2,000 ng /ml PTX (nok til å fullstendig blokkere celleformering, men ikke i stand til å påvirke cellenes levedyktighet). Etter flere vaskinger og trypsinering, hMSCsPTX ble ytterligere dyrket i 24 timer, og deres kondisjonert medium (CM) ble testet på Molt-4, er en leukemicellelinje svært følsomme for PTX (IC
50 til 1,48 ± 1,06 ng /ml) [ ,,,0],20]. CM fra begge kulturer av hMSCPTX (hMSCsPTX-CM) ga en sterk doseavhengig anti-proliferativ effekt på MOLT-4, tilsvarende de som oppnås med ren PTX i doser fra 0,39 til 50 ng /ml (Fig. 1C). I motsetning til dette CM fra kontrollceller (hMSCs-CM) ikke var effektive. Sammenligning av den inhibitoriske aktivitet av ren PTX og CM på Molt-4, beregnet vi PTX tilsvarende konsentrasjon (PEC) i CM benyttes til å estimere PEF frigjøres av en enkelt celle (PEC pg /celle). Den totale PEC internalisert av hMSCsPTX i 24 timer, evaluert ved å teste hMSCsPTX cellelysatene, ble 2,67 ± 0,8 pg /celle, noe som tyder på at hMSCs i 24 timer kunne innlemme ca 8% av den innledningsvis PTX tilgjengelig (33,3 pg /celle). Resultater på lysater av hMSCs løst i formalin før PTX priming indikerte noe uspesifikk binding av PTX, svarende til 0,11 ± 0,01 av PEC pg /celle (omtrent 4% av den totale PEF til stede i lysatet av levende celler).
deretter beregnet vi tidsavhengige utgivelsen av PEC av hMSCsPTX ved å erstatte og samle sine CM på ulike tidsintervaller. Påvisbar aktivitet av PEF var til stede etter 2 timers inkubering av hMSCsPTX å nå en PEF av 1 pg /celle i løpet av første 24 timer av kulturen, og en maksimal konsentrasjon på omtrent 1,7 til 2,0 pg /celle ved 144 h (Fig. 1D). Siden disse verdiene ikke økte med lengre inkubasjonstid, beregnet vi at omkring 25-30% av den totale PEF befinner seg i cellelysat ble tilbakeholdt av cellene og aldri frigjort. Internalisering av PTX inn hMSCs ble undersøkt ved konfokalmikroskopi hjelp Fluorescent PTX (PTX-F) (Fig. 2A). PTX-F lokalisering til hMSCs ble analysert over tid. Etter en time av priming, internalisering av PTX-F av hMSCs var merkbar. Fargingen var intens og anrikede vesikler inne i enden av fylle (24 timer). Etter 24 timer ble det observert at fordelingen av PTX-F forble begrenset til vesikler, hvorav mange var nær til cellemembranen, noe som tyder på en mulig sekret. For å vurdere om PTX-F ble beriket i vesikler som stammer fra Golgi-apparatet, ble utført samlokalisering analyse i hMSCs farget med spesifikk markør Bodipy® TR ceramid. Som det fremgår av de hvite flekker i figur 2A maske, ble det observert en høy grad av colocalization mellom PTX-F og Bodipy® TR ceramid, noe som betyr at PTX-F ble internalisert inne i Golgi-avledede vesikler. Dermed PTX-F akkumuleres i vesikler i stedet for å akkumulere i mikrotubuli [15] som mange andre xenobiotics gjøre [21], og dens synker i hMSCs følgende kinetikk vist ved FACS-analyse (Fig. 2A og S4 fig.).
internalisering av PTX-F ble analysert ved konfokal mikroskopi (A) i levende hMSCs primet 1 (1) eller 24 (24) h med PTX-F (grønn) og lastet med Golgi spesifikk markør BOPIPY®TR ceramid (rød). Celler ble også observert 24 timer etter vasketrinnet (24 + 24). PTX-F akkumuleres i cellene og co-lokaliserer med Golgi-apparatet eller Golgi-avledet vesikler. Mask panel streker samlokalisering mellom PTX-F og BODIPY®TR ceramider viser hvite flekker, som indikerer disse piksler hvor både fluorescerende signalene er påvisbare .. Hvite linjer representerer cellegrensen og pilene indikerer vesikler nær cellemembranen. Skala: 20 mikrometer. Frigivelsen av PTX i hMSCsPTX-CM i 24 timer ble analysert ved HPLC. Elueringsprofilen (B) ble sammenlignet med ren PTX på 1.000 ng /ml (C). Figuren rapporterer et kromatogram profilen til en typisk eksperiment der hMSCsPTX-CM bevis en topp som tydelig identifisert PTX og som ble kvantifisert på en PTX standardkurve som 68,1 ng /ml. Figur 2D rapporterer profilen på hMSCs-CM dyrket i fravær av PTX. Det merket som I.S. topp er den interne standard Cephalomannine lagt til alle prøvene for korrekt kvantifisering av PTX.
Tilstedeværelsen av PTX i hMSCsPTX-CM ble bekreftet ved HPLC-analyse. HPLC-kromatogrammer oppnådd fra hMSCsPTX-CM og fra en standardprøve av PTX i PBS (1,000 ng /ml) (fig. 2B, C) viser at en topp på identisk retensjonstid på PTX ble eluert fra hMSCsPTX-CM. HPLC-analyse viste nærvær av andre ikke-spesifikke topper (2,5-4 minutter) sannsynligvis på grunn av forbindelser produsert av celler og ikke korreleres med nærværet av PTX, fordi også til stede i kromatogrammet av kontrollmediet hMSCs-CM (fig. 2D). Tilstedeværelsen av hoved PTX metabolitt, 6a-hydroksy-paclitaxel, normalt eluert ved 5,5 minutter, og av andre PTX metabolitter kan utelukkes [22].
En lignende PTX priming teknikken ble brukt til mus SR4987 som viste en lignende kinetikk for innlemmelse og frigjøring av PTX med en høyere trend av narkotika utgivelse i løpet av de første 24 timer inkubasjon (data ikke vist).
HMSCsPTX og SR4987PTX hemme spredning av ulike typer TCS
in vitro
for å evaluere
in vitro
anti-tumor potensialet i hMSCsPTX og mus SR4987PTX, vi deretter undersøkt effekten av hMSCsPTX-CM på to humane cellelinjer (DU145, T98G ) og av SR4987PTX-CM på mus B16 melanom-cellelinje. Som vist på fig. 3, tilsetning av hMSCsPTX-CM på 1:04 til 1:08 fortynning induserte opptil 80% av veksthemning på alle tumorcellelinjer (Fig. 3A). Ved 1:02 fortynning, tilsvarende tilsetning av ca. 25 ng /ml ren PTX, ble 100% av tumorvekst inhibering oppnådd (fig. 3B). Ved å kombinere disse dataene med de fra kinetikk utgivelsen (Fig. 1 D), kan vi anslå at det i 24 timer, 3 × 10
5 hMSCsPTX kan frigi rundt 50-60 ng /ml PEC som er konsentrasjonene 3-5 ganger IC
90 verdier av PTX for kreftceller undersøkt. Tilsetningen av styre hMSCs-CM påvirket ikke TC-proliferasjon (data ikke vist). Kapasiteten på hMSCsPTX å hemme annerledes TCS spredning ble bekreftet av co-kultur analyse hvor hMSCsPTX og TCS ble blandet i forskjellige forhold (fra 01:01 til 1:100). Tilstedeværelsen av hMSCsPTX inhiberte proliferasjon av alle tumorcellelinjer som ble testet, i henhold til deres proporsjonal tilstedeværelse (fig. 3C, D, E). Dette tillot oss å beregne en vilkårlig verdi uttrykt som forholdet mellom hMSCsPTX og TCS som produserte IC
50. IC
50 verdiene var 01:47 for MOLT-4, 01:05 for T98G og DU145 og bare 1:2-3 for B16 tumorceller. Tilsetningen av kontroll hMSCs ikke vesentlig påvirke TC-spredning, selv om en lav signifikant vekstinhibering (p 0,02) ble observert på 01:01 forholdet for alle tumorcellelinjer som ble testet
i (A) er vist. Kinetikken for veksthemming indusert av seriefortynninger av hMSCsPTX-CM på T98G, DU145 og av SR4987PTX-CM på B16 som ble sammenlignet med aktiviteten av forskjellige konsentrasjoner av PTX på samme TC (B). CM tillegg ga en sterk anti-proliferativ effekt på alle TC testet på en doseavhengig måte: 1:16 og 1:4 fortynninger IC
50 og IC
90 veksthemming på alle TC linjene henholdsvis svarende til PTX konsentrasjoner nødvendig for å oppnå IC
50 og IC
90 på de forskjellige tumorceller som rapportert i liten bordinnsatsen i (B). Inhibering av TC-proliferasjon ble også oppnådd ved en direkte ko-kultur-analyse. Grunnet hMSCsPTX blandet, ved forskjellige forhold (1:100-1:10-1:1 MSC /TCS), med MOLT-4 (C), T98G (D), DU145 (E) viste doseavhengig kapasitet til å blokkere TCS proliferasjon evaluert i en MTT test på 7 dager uttrykt som prosent av OD målt for TCS dyrket i kontroll medium alene (CTR) eller i nærvær av ikke primet hMSCs. SR4987PTX oppførte seg som hMSCsPTX. Men selv ikke primet SR4987 per se viste noen anti-proliferativ kapasitet på B16-melanom hos 01:01 forhold (F). Histogrammene rapportere gjennomsnitt ± SD av tre eksperimenter med statistisk signifikans som følger:
* (p 0,05)
,
** (p 0,01) vs
tumorcellevekst (CTRL) .
mus SR4987PTX jobbet som hMSCsPTX i opptak og frigjøring av stoffet som testes ved MTT-analyse på CM (fig. 1a). Men i co-kultur analysen, SR4987 celler «per se» produsert en hemming av B16 melanomceller (p 0,05). Som ikke avviker fra det som produseres av SR4987PTX (Fig. 3F)
hMSCSPTX og muse SR4987PTX vise potent
in vitro
antiangiogen aktivitet
Fordi PTX regnes som hemmer angiogenese [16], [23], og dermed undersøkte vi om hMSCsPTX og SR4987PTX kan påvirke angiogenese
in vitro plakater (fig. 4). Den anti-angiogene aktivitet av ren PTX ble først testet på HUVECs og på mikrovaskulær ECS (HMECs) proliferasjon. PTX ved doser opp til 10 ng /ml var ekstremt cytotoksisk for både HUVECs og HMECs. PTX produsert rundt 50% av egenkapitalbevis veksthemming (IC
50) på 4,6 ng /ml (fig. 4A). Effekten av hMSCsPTX-CM på HUVECs og HMECs var svært cytotoksisk ved 1:2 og 1:4 fortynninger (fig. 4B, C). Ved 01:08 hMSCsPTX-CM inhiberte både HUVECs og HMECs proliferasjon, men mindre enn 5 ng /ml ren PTX. Lignende resultater ble oppnådd ved ko-kultur-analysen (fig. 4D, E, F). Ratio 01:01 og 01:05 på hMSCsPTX /egenkapitalbevis produsert en sterk cytotoksisk effekt på både HUVECs og HMECs, mens forholdet 1:10, ble ingen cytotoksisitet men betydelig egenkapitalbevis veksthemming observert (fig. 4D, E). Interessant, i forholdet 1:05, hMSCsPTX initiert drepe HMECs i løpet av første 24 timer av co-kultur; etter 72 timers inkubering svært få HMECs levde (Fig. 4F). Kontroll hMSCs-CM ikke påvirke egenkapitalbevis spredning.
PTX hemmer egenkapitalbevis spredning (A). HUVECs og HMECs (2 x 10
5) ble dyrket i 72 timer i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av PTX. IC
50 var rundt 4,69 ng /ml PTX og 10 ng /ml PTX betydelig sperret begge HUVECs og HMECs spredning, som ved høyere doser var cytotoksiske. Tilsvarende tilsetning av hMSCsPTX-CM sterkt hemme HUVECs (B) og HMECs (C) proliferasjon. På 1:02 fortynning, hMSCsPTX-CM var cytotoksisk, mens ved høyere 1:4 og 1:8 fortynninger hemme egenkapitalbevis spredning. Inhibering av proliferasjon ECS ble oppnådd ved ko-kultur-analyse. HMSCsPTX co-dyrket på 1:01 og 1:05 ratio (MSC /ECS) var cytotoksisk for både HUVECs (D) og HMECs (E). På 1:10 ratio fortsatte hMSCsPTX å hemme egenkapitalbevis spredning. Ubehandlede kontroll hMSCs ikke påvirke egenkapitalbevis. I (F) bilder av kulturen i hMSCsPTX blandet 01:05 med HMECs. Celler fiksert og farget ved forskjellige tidsintervaller vist. hMSCsPTX drepe HMECs så tidlig som 24 timer etter seeding. Hvite piler indikerer øyene HMECs fremdeles er tilstede i kulturen. Merk at etter 72 timer de fleste av HMECs seeded ble drept og bare hMSCsPTX forbli i kultur (20 × forstørrelse). Barer i tallene er gjennomsnitt ± SD av tre separate eksperimenter utført i tre eksemplarer.
* p 0,05
,
** p 0,01 vs
ubehandlede hMSCs
Den antiangiogene potensialet i hMSCsPTX ble også undersøkt ved hjelp av rotte aorta. ring analyse [24]. Som vist på fig. 5A, tillegg av 1:02 og 1:04 fortynning av hMSCsPTX-CM sterkt redusert enten spontan eller VEGFa-indusert spirende av neocapillaries fra aorta ringer. Fortynning 01:08 av hMSCsPTX-CM som hemmer egenkapitalbevis spredning påvirket ikke aorta ringkapillærer dannelse (Fig. 5A). HMSCsPTX-CM var også i stand til å indusere kapillær regresjon hvis det legges til aorta ringer etter 7 dager med kultur. Under mikroskopisk undersøkelse, ble flere soner av fartøy nekrose observert (fig. 5B). Tilsetningen av hMSCs-CM ikke vesentlig påvirke kapillar dannelse (Fig. 5A). Lignende resultater med SR4987PTX ble oppnådd (fig. S5).
i (A) og (B) rotteaorta ring analyse ble anvendt for å teste hMSCsPTX-CM microvessel veksthemming. I (A) hMSCsPTX-CM ved forskjellige fortynninger tilsatt til rotte-aorta-ringer i nærvær eller i fravær av VEGFa indusert en stor reduksjon av kapillær utvekst i forhold til CTRL medium og til hMSCs-CM. VEGFa 20 ng /ml ble brukt som positive kontroller (
** p 0,01 vs
hMSCs-CM). I (B) Bildene viser hMSCsPTX-CM (ved 1:02 fortynning), som induserte kapillær regresjon som demonstrert ved tilstedeværelsen av fartøy ruptur og nekrotiske soner (piler) (forstørrelser 20 ×). I (C), (D) og (E) virkningene av hMSCsPTX
in vivo
på tumor tar (C), på DU145 (D) og B16 (E) vekst er vist. Rundt 0,4 × 10
6 hMSCsPTX og styrer ubehandlede hMSCs ble blandet (i forholdet 01:05 hMSCs /TC /) med 2 × 10
6 DU145 eller B16 og deretter injisert subkutant (subkutant) i mus. Tumorvolumene ble beregnet ved å måle tumordiameter som tas hver annen dag med en kaliber. Den ko-injeksjon av hMSCsPTX med DU145 eller B16, produserte en signifikant forsinkelse av tumor utseende (C), så vel som en stor reduksjon av DU145 (D) og B16 (E) tumorvolum, mens det ko-injeksjon med ubehandlede hMSCs ikke gjorde innvirkning DU145 eller B16 volumer, heller ikke injeksjon av TCS blandet 5 minutter før injeksjon med 2.000 ng /ml PTX (se tabell 1). Innsatsen i (D) og (E) er bildet av svulster i kontroll, hMSCsPTX og hMSCs behandlede mus på tidspunktet for offer.
* p 0,05 og ** p. 0,01 vs
TCS alene eller
vs
hMSCs behandlede mus
hMSCsPTX og mus SR4987PTX hemme tumorvekst
in vivo
in vitro
data viste at både hMSCsPTX og SR4987PTX var sterkt hemmende for TC og selv cytotoksiske for egenkapitalbevis. For å se om de kan påvirke tumorvekst
in vivo
, hMSCsPTX og kontroll hMSCs ble co-injisert i forholdet 1:05 enten med menneske DU145 eller mus B16 melanom kreft celler i immunsvikt mus. Kontrollgrupper ble også injisert med TCS alene eller TC blandet, 1-2 minutter før injeksjon, med 2.000 ng /ml gratis PTX. I tabell 1 og i figur 5 er resultatene sammenfattet. HMSCsPTX blandet enten med DU145 eller B16 melanoma en signifikant forsinkelse i tumor foregår (fig. 5C) og redusert begge DU145 (fig. 5D) og B16 tumorvekst (fig. 5E). Den anti-tumor virkning på DU145 fremkalt ved hMSCsPTX var mer potent enn det på B16. Men tumor vekter av DU145 og B16 ble betydelig redusert ved hMSCsPTX behandling; 25% av mus behandlet med DU145 og hMSCsPTX ble også tumorfrie (tabell 1). Interessant, ko-injeksjon av DU145 og B16-celler med en høy konsentrasjon av fri PTX ikke forsinke tumor tar eller påvirke vekst (tabell 1), som antyder at tidsavhengig frigivelse av PTX ved hMSCsPTX er nødvendig for å påvirke kreftceller proliferasjon. Dette kan også skje
in vivo
.
Lignende resultater ble oppnådd ved å bruke musen SR4987 på B16 melanom (tabell 1). SR4987PTX ko-injisert med B16 (i forholdet 01:05) i C57B16-mus, som er syngeniske for SR4987 [14], betydelig forsinket tumor tar og redusert B16 vekst, selv om de ko-injeksjon med kontroll SR4987 «per se» produsert noen hemmende aktivitet på B16 vekst (fig. S6).
Effekter av mus SR4987PTX på subkutane xenografter av glioblastom U87MG celler
Eksperimenter ved hjelp RFP + U87MG glioblastom celler og GFP + SR4987 ble utformet for å spore de to cellefraksjoner og å undersøke deres interaksjoner
in vivo
. Kontroll mus, podet enten med U87MG celler eller med U87MG celler og SR4987, viste at uttrykket av RFP og GFP ikke endre tumorigenicity og overlevelse av disse cellene i
in vivo
tilstand. Totalt sett er SR4987PTX cellene hadde en hemmende effekt på veksten av glioblastom xenotransplantater (fig. S7A-B). På 2, 4 og 6-ukers tidspunkter, RFP + U87MG /GFP + SR4987PTX xenografter var betydelig mindre enn de RFP + U87MG xenografter (
p
0,01,
p
0,05 og
p
0,001, henholdsvis Student
t
-test). Samtidig poeng, RFP + U87MG /GFP + SR4987-PTX xenografter var betydelig mindre enn RFP + U87MG /GFP + SR4987 xenografter også (
p
0,02,
p
0,05, og
p
0,001, henholdsvis Student
t
-test). Fluorescens mikroskopi viste at, i sammenheng med svulsten, GFP + SR4987PTX celler arrangert seg i strenger og kolonner for å danne garn som innesperrede RFP + U87MG-celler (fig. S7C). Motsatt ble GFP + SR4987 som ikke hadde blitt primet med PTX blandet med U87MG celler uten noen tilbøyelighet til å organisere i sekundære strukturer (Fig. S7C). Histologisk undersøkelse viste at xenografter inneholder SR4987 celler, uavhengig av deres PTX priming, ikke utvikle foci av nekrose, som vanligvis sett i U87MG xenografter på 4 og 6 ukers overlevelsestid (Fig. S7D). Både størrelsen og histologisk utseende U87MG og U87MG /SR4987 xenografter var ikke signifikant forskjellig fra de xenografter generert ved injeksjon av viruset omformet RFP + U87MG celler og RFP + U87MG /GFP + SR4987, henholdsvis (data ikke vist).
diskusjon
musen stromal cellelinje SR4987 grunnes først
in vitro
med DXR og deretter co-dyrket med HSCs resulterer i en sterk hemming av CFU formasjoner [14]. Merker seg denne egenskapen, vi lurte på om hMSCs og SR4987 primet med en anti-kreft stoffet kan skaffe anti-tumor aktivitet og dermed brukes til kreftbehandling.
For å validere denne hypotesen, både mus SR4987 og hMSCs ble primet med PTX, fordi det demonstrert både sterk anti-tumor [15], [25] og anti-angiogene aktiviteter [16], [23]. Når utgitt av primet celler, kan PTX påvirke både svulsten og egenkapitalbevis spredning
Innledende forsøk viste at PTX var i stand til å hemme hMSCs og SR4987 spredning, men ble ikke cytotoksisk.; opp til 10.000 ng /ml ikke påvirke cellenes levedyktighet. Dette PTX-konsentrasjonen var omtrent 500 ganger høyere enn det som er nødvendig for å fremstille en IC
50 på MOLT-4, en human leukemicellelinje svært sensitive til PTX-aktivitet [20] som vi brukte for å overvåke hMSCsPTX-CM og SR4987PTX-CM aktivitet. Basert på en tidligere studie [14], og dermed har vi etablert en standard protokoll for å prime hMSCs og SR4987 med PTX, bestående av behandling 3 × 10
5 heftende celler med 2.000 ng /ml PTX for 24 timer i kultur. I sammendraget, fant vi at: a) hMSCs var i stand til raskt å innlemme PTX som bekreftes ved hjelp av PTX-F; b) hMSCsPTX kan langsomt slipper PTX, i det minste delvis, i dyrkningsmediet på en tidsavhengig måte, som bekreftet ved HPLC-analyse; c) formalin fiksert hMSCs og var ikke effektive til opptak PTX; d) både hMSCsPTX og SR4987PTX kjøpt en potent anti-tumor og anti-angiogen aktivitet
in vitro Hotell som var doseavhengig, og påviselig ved å bruke CM eller ved co-kultur analysen; e) hMSCsPTX co-injisert i immunodeficient mus med menneskelig DU145 og SR4987PTX co-injisert med U87MG eller mus B16 melanom, betydelig forsinket svulst tar og redusert tumorvekst. I B16 melanom-modell observerte vi at mus stromal SR4987-celler er i stand til «per se» for å hemme tumorcelle-proliferasjon på et nivå tilsvarende SR4987PTX. Dette funnet ser ut til å være i overensstemmelse med de motstridende data som rapporteres fra litteraturen som tyder både kapasiteten mesenchymale celler og stromale celler for å favorisere eller å hemme tumorprogresjon [26]. Spesielt representerer B16-tumormodell en tilstand der murine stromaceller antitumoraktivitet er blitt demonstrert [27]. I denne tilstanden kan det være at PTX lastet SR4987 celler øke basal antitumor effekt uten en betydelig målbar effekt.
Uavhengig av dette funnet, kan vi konkludere med at våre resultater, tatt sammen, sterkt støtte vår første hypotese foreslår selv hMSCs som en bærer for cellegifter i menneskelig. Etter vår mening er våre resultater avsløre viktige ny innsikt i funksjonelle egenskaper pattedyr MSC. Fra et toksikologisk utsiktspunkt, våre resultater støtter ideen om at pattedyr, i hvert fall innenfor BM stroma rommet, inneholder celler som kan spille en dobbel rolle i å kontrollere narkotika toksisitet. Disse cellene kan redusere eller forbedre legemiddeltoksisitet, avhengig av deres kapasitet «til å adsorbere», og deretter å frigjøre et legemiddel til og med, som vist her for PTX, i sin opprinnelige form. Denne forekomsten
in vivo
fortsatt ikke avklart. Men data fra kreftpasienter som får svært høye doser av kjemoterapi synes å støtte denne hypotesen [28].
