Abstract
Bakgrunn
Strålebehandling er en av de store terapeutiske strategier i kreftbehandling. Den telomer-bindende protein TPP1 er en viktig komponent i shelterin komplekse på pattedyr telomerer. Våre tidligere rapporter viste at TPP1 uttrykk ble forhøyet i radioresistant celler, men de eksakte effekter og mekanismer TPP1 på Radiosensitivity er uklart.
hovedfunnene
I denne studien fant vi at forhøyet TPP1 uttrykk signifikant korrelert med radioresistance og lengre telomerlengde i menneskelige kolorektal kreft cellelinjer. Videre TPP1 overekspresjon viste forlenget telomerlengde og en betydelig reduksjon av radiosensitiviteten for røntgenstråler. TPP1 mediert radioresistance ble korrelert med en redusert apoptose sats etter IR eksponering. Videre TPP1 overekspresjon viste langvarig G2 /M arrest formidlet av ATM /ATR-Chk1 signalveien etter IR eksponering. Videre TPP1 overekspresjon akselerert reparasjonskinetikk total DNA skade og telomer dysfunksjon indusert av ioniserende stråling.
Konklusjoner
Vi viste at forhøyede uttrykk for TPP1 i menneskelige kolorektal kreft celler kan beskytte telomere fra DNA skade og gi radioresistance. Disse resultatene antydet at TPP1 kan være et potensielt mål i strålebehandling av tykktarmskreft
Citation. Yang L, Wang W, Hu L, Yang X, Zhong J, Li Z, et al. (2013) telomere-Binding Protein TPP1 modulerer telomere Homeostase og overfører Radioresistance Human tykktarmskreftceller. PLoS ONE 8 (11): e81034. doi: 10,1371 /journal.pone.0081034
Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA
mottatt: 02.07.2013; Godkjent: 08.10.2013; Publisert: 19.11.2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No.81071825), doktorgrads Fund of Ministry of Education of China (No.20120141130010) og de grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC), med over 1,2 millioner nye tilfeller og 608,700 dødsfall i 2008, er en viktig årsak til kreft-relaterte dødsfall i mange land [1]. Radioterapi er en av de viktigste terapeutiske strategier i kolorektal cancer behandling med effektiv lokal kontroll, beskyttelse av normale vev og mindre systemiske effekter [2,3]. Men mange pasienter fortsatt opplever tilbakefall eller metastaser etter strålebehandling. Den viktigste årsaken til strålebehandling svikt er cellular radioresistance. Så identifisere nye faktorer som forutsier radioresistance er et område med intens forskning og kunne være av stor verdi i behandlingen av kreft.
Telomerer er spesialiserte DNA-proteinkomplekser ved endene av eukaryote kromosomer sammensatt av et variabelt antall tandem repet TTAGGG-sekvenser og assosierte proteiner [4]. Telomerer spille viktige roller i å sikre genomisk stabilitet og integritet [5-8]. Videre har studier avklart at telomer-homeostase fungerer som et potensielt mål i kreftbehandling, spesielt i strålebehandling [9-12]. Våre tidligere undersøkelser viste også at det var en signifikant negativ korrelasjon av telomerlengde og radiosensitiviteten og telomerlengde kan anvendes som et lovende verktøy for å forutsi den Radiosensitivity av humane karsinomer [13].
telomere homeostase påvirkes av flere elementer, og en av de store regulatorer er shelterin. Den shelterin Komplekset består av seks telomere-assosierte proteiner: TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 og POT1 [8]. Forstyrrelse i shelterin ville føre til telomere dysfunksjon og, potensielt, Kromosom ustabilitet [14]. TPP1 (også kjent som TINT1 /PTOP /PIP1) er en kritisk medlem av shelterin og kollegaer med andre telomere bindende proteiner for å danne kjernen shelterin [8]. TPP1 heterodimerizes med POT1 og forbedrer sin tilhørighet med telomerer ssDNA [15,16]. Den POT1-TPP1 komplekset er i stand til å rekruttere og stimulere telomerase aktivitet, og dermed regulerer telomerlengde gjennom TPP1-telomerase interaksjon [17-19]. Tidligere undersøkelser har vist at TPP1 knockdown aktiverer en ATM-avhengig DNA-skade reaksjon markert ved dannelse av telomer-dysfunksjon-induserte foci (TIFs) ved telomerer [20]. Videre observerte vi at TPP1 uttrykket ble forhøyet i radioresistant celler og TPP1 kan innebære i kreft radioresistance [21]. Men de eksakte effekter og mekanisme av TPP1 på Radiosensitivity er uklart.
For ytterligere å klargjøre funksjonene TPP1 undersøkte vi hvilken rolle TPP1 overekspresjon på Radiosensitivity og telomerer homeostase i menneskelige kolorektal kreftceller i denne studien.
Materialer og metoder
Cell Culture and Treatment
Menneskelige kolorektal kreft cellelinjer (HCT116, SW480, LoVo, HT29 og DLD-1) ble kjøpt fra Celle Bank of Chinese Academy of Science, Shanghai, Kina. Alle cellene anvendt i denne studien ble dyrket i 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum. HCT116-celler ble transfektert med pcDNA6-flagg-hTPP1 (en slags gave fra Dr Joachim Lingner) [19] eller pcDNA6 tom vektor (Invitrogen) ved hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen). TPP1 overekspresjon celler ble valgt med 5 ug /ml blasticidin (sigma) i 4 uker. De stabile transfeksjon cellelinjer ble navngitt som HCT116-TPP1 og HCT116-Mock, henholdsvis.
røntgen bestråling ble utført med en røntgen generator (Primus Høy energi Siemens), utslipp til en fast dose på 2 Gy /min, energi av X-stråler brukes til strålebehandling celler er 0 -10 Gy.
klonogene analysen
cellene ble sådd ut i 6-brønners plate kulturflasker. Etter 24 timer ble cellene bestrålt med graderte doser (0, 2, 4, 6, 8, 10 Gy) ved bruk av røntgenstråle-generator (Primus høy-energi Siemens) ved en dose på 2 Gy /min. Cellene ble deretter dyrket i en inkubator inneholdende 5% CO2 ved 37 ° C i 14 dager. De etterfølgende trinn og beregning av overlevende fraksjonen ble utført som tidligere beskrevet [13] .Alle eksperimenter ble utført minst tre ganger.
Flow Cytometry Analyse av Cell Cycle
I korthet ble cellene eksponert for 6 Gy IR og deretter inkubert i de angitte tidsrom (0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, og 42 h), deretter cellesyklus-analyser ble utført som tidligere beskrevet [21]. DNA-histogrammer ble analysert ved hjelp av Modifit programvare. Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
flowcytometrisystemer Analyse av apoptose
Apoptose Analysen ble utført ved hjelp av en annexinV-FITC apoptose deteksjon kit (Beyotime, Kina) i henhold til produsentens anvisninger. Fluorescens ble målt ved hjelp av et flowcytometer (Beckman Coulter, Brea, California) og dataene ble analysert med Cell quest software. Alle prøvene ble analysert in triplo.
Antistoffer og Western blot-analyse
Western blot ble utført som tidligere rapportert [21]. Følgende antistoffer er brukt i denne studien: TPP1 (Abcam), ATR, fosfor-Ser345-Chk1 /Chk1 og ATM (Cell Signaling Technology). En β-aktin-antistoff (Santa Cruz) ble anvendt for å normalisere lastende forskjeller mellom prøvene.
Telomerase aktivitetsanalyse
Måling av telomerase aktivitet ble utført ved hjelp av FELLE PCR ELISA kit (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Den detaljerte fremgangsmåten ble utført som tidligere beskrevet [22] .Sample absorbansen ble målt med en mikroplateleser (Bio-Rad) ved bølgelengde på 450/690 nm.
Måling av telomerlengde ved Southern Blotting
Terminal restriksjonsfragment bestemmelse ble utført ved hjelp av TeloTAGGG telomerlengde Assay kit (Roche) i henhold til fremstilling instruksjon. Gjennomsnittlig telomer-lengden (gjennomsnittlig terminal restriksjonsfragmenter lengde, TRF) ble bestemt ved hjelp av bildeanalyse programvare (Bio-Rad).
Immunofluorescence
Etter den angitte behandling ble cellene fiksert med 4% formaldehyd i 15 minutter og permeabilisert med 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Etter blokkert med blokkeringsløsning, ble celler inkubert med det primære antistoff over natten ved 4 ° C og deretter vasket og inkubert med det sekundære antistoff. Kjerner ble farget med DAPI (Sigma) i 5 minutter ved romtemperatur. Fluorescens signalene ble tatt med et konfokal mikroskop (Carl Zeiss LSM710).
telomere ChIP analysen og Dot Blot analyse
telomere ChIP analysen og Dot Blot analyse ble utført som tidligere rapportert [19]. Etter utfelling med TRF2 antistoff, ble DNA renset fra immunopresipitert kromatin og blottet på en Hybond-N membran (Amersham), og telomere gjenta sekvenser ble oppdaget med en TeloTAGGG telomerlengde analysen kit (Roche Diagnostics). En ikke-spesifikk probe (Alu) ble anvendt som kontroll. Signalene ble målt ved hjelp av programvare for bildeanalyse (Bio-Rad).
Statistical Analysis
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Student t-test ble anvendt for å teste statistisk signifikans. P 0,05 ble ansett å være betydelig. GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, California) programvare ble brukt som et statistisk analyseverktøy.
Resultater
sammenheng mellom TPP1 Protein Expression, telomerlengde og egen Radiosensitivity
For det første vi undersøkt TPP1 protein expression og telomere lengder i fem kolorektal kreft celler (figur 1A og B). Som vist i figur 1D, ble TPP1 protein ekspresjon signifikant korrelert med telomerlengde (R = 0,9783, P 0,05). Deretter celle overlevelse ble målt ved en analyse klonogene og SF2 ble anvendt som en indeks for indre radiosensitiviteten (figur 1C). TPP1 uttrykket er negativt korrelert med indre Radiosensitivity (R = 0,9792, P 0,05, figur 1E). Oppsummert radioresistant cellene har lengre telomerer og høyere produksjon av TPP1 enn i radiosensitive celler. Dette resultat indikerte at det var en signifikant sammenheng mellom TPP1 uttrykk, telomerlengde og celle iboende Radiosensitivity.
(A) TPP1 produksjonen ble oppdaget av western blotting ..
(B) telomerlengde var undersøkt ved Southern blot analyse.
(C) Relativ TPP1 produksjon, Radiosensitivity (SF2) og telomer-lengden (TRF) i humane kolorektal kreft cellelinjer.
(D) Sammenheng mellom TPP1 produksjon og Radiosensitivity (SF2) i kolorektal kreftceller ble undersøkt.
(E) Sammenheng mellom TPP1 produksjon og TRF lengde i kolorektal kreft celler ble undersøkt.
TPP1 Overuttrykte Reduserer Sensitivitet av HCT116-celler til Stråling
for å undersøke påvirkning av TPP1 overekspresjon på mobil Radiosensitivity, HCT116-TPP1 og HCT116-Mock cellene ble etablert (Figur 2A) og celleoverlevelse ble målt med en klonogene analysen. HCT116-TPP1 celler viste signifikant radioresistance sammenlignet med HCT116-Mock celler etter IR eksponering (figur 2B).
(A) Verifikasjon av TPP1 overekspresjon av western blotting.
(B) HCT116-Mock og-TPP1 cellene ble bestrålt med røntgen og deretter celle overlevelse ble bestemt ved bruk klonogene analysen.
(C) HCT116-Mock og-TPP1 cellene ble bestrålt med 6 Gy X-ray og gjenvunnet for angitte tidspunkter. Cellesyklus ble analysert ved FACS.
(D) bestanden av celler i G2 /M faser over tid i HCT116- Mock og -TPP1 celler.
TPP1 Overuttrykte i HCT116 Cancer Cells Årsaker Langvarig G2 /M arrest etter IR eksponering
Som vist i figur 2C, TPP1 overekspresjon hadde ingen signifikant effekt på cellesyklus distribusjoner i fravær av DNA-skade. Etter stråling, observerte vi at G2 /M arrest nådd en topp på 18 timer etter IR eksponering i både HCT116-Mock og -TPP1 celler. Enda viktigere, kinetikken til responsen av cellelinjene var forskjellig. I HCT116-Mock celler, G2 /M peak gradvis redusert fra 18t etter ioniserende stråling og tilbake til normale nivåer på ca 42 timer. Men den G2 /M topp i HCT116-celler TPP1 ikke avta, men fortsatt opprettholdes på et høyt nivå før 30-36 timer etter IR. Disse resultatene tyder på at TPP1 overekspresjon i HCT116 cellene forlenget G2 /M arrest etter IR eksponering.
TPP1-indusert G2 /M arrest Forlengelse medieres via minibank /ATR-Chk1 Pathway
For å identifisere molekylære mekanismer for langvarig G2 /M arrest etter IR eksponering i TPP1-overekspresjon celler, målte vi produksjonen av ATM, ATR og Chk1. Vi fant at uttrykk for ATM og ATR ble begge forhøyet i HCT116-TPP1 celler (figur 3A). Deretter undersøkte vi de aktiveringer av Chk1, et viktig substrat av ATR og minibank. Vi fant at fosforylering nivåer av Chk1 på Ser345 var høyere før 36 timer etter IR eksponering i HCT116-TPP1 celler. I kontrast, hadde nivåene i HCT116-Mock cellene tilbake til normale nivåer på ca 30 timer etter at IR eksponering (figur 3B). Disse resultatene indikerer at langvarig G2 /M arrest etter TPP1 overekspresjon skyldes sannsynligvis ATM /ATR-Chk1 signalveien.
(A) Western blot analyse viste at TPP1 overekspresjon økt uttrykk for ATM og ATR.
(B) HCT116-Mock og-TPP1 cellene ble bestrålt med 6 Gy X-ray og inkubert i angitte tider. Western blot ble framført for å påvise uttrykk for Chk1 og p-Ser
345-Chk1.
TPP1 Overuttrykte hemmer apoptose indusert av ioniserende stråling
Vi har evaluert effekten av TPP1 på stråling apoptose ved hjelp av flowcytometrisk analyse. Som vist i figur 4, fant vi ut at det var ingen signifikant forskjell mellom HCT116-Mock og HCT116-TPP1 celler (5,72 ± 0,15% til 5,55 ± 0,12%, p 0,05), men TPP1 overekspresjon kunne dempe strålingen (5Gy) indusert apoptose nivåer, fra 26,89% ± 0,75 i kontrollcellene til 17,47 ± 0,45% i HCT116-celler TPP1 (p 0,05). Disse data indikerte at den økte radioresistance av TPP1 overekspresjon kan skyldes en nedgang i stråleindusert apoptose.
HCT116-Mock og-TPP1 cellene ble bestrålt med 5 Gy X-ray og inkubert i 24 timer. Prosentandelen av apoptotiske celler ble målt ved strømningscytometri.
(A) Representative resultater av diffrerent grupper er vist.
(B) De viste data er middel ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter.
*, P 0,05.
TPP1 Overuttrykte Øker telomerlengde i HCT116 Cells
For ytterligere å undersøke hvilken rolle TPP1 i telomerlengde kontroll, HCT116-TPP1 og -Mock celler ble dyrket i 20 PD og telomerlengde ble målt ved hjelp av southern blotting. Vi har vist at den gjennomsnittlige telomerlengde av HCT116-celler TPP1 ble gradvis forlenget enn i kontrollcellene (figur 5A). Disse resultatene antyder at TPP1 overekspresjon kan øke telomerlengde i HCT116-celler.
(A) Gjennomsnittlig TRF lengder på forskjellige PD ble påvist ved Southern blot. PD, befolkning dobling. Posisjonen til mWs (kb) er angitt til venstre.
(B) TRAP PCR ELISA-analysen ble anvendt i analysen av telomerase-aktivitet ved forskjellige personlighetsforstyrrelser.
(C) Western blot-analyse avslørte at TPP1 overekspresjon hadde ingen betydelig innflytelse på uttrykk for hTERT.
(D) telomere-chip analysene ble utført ved hjelp av en TRF2 antistoff for å undersøke telomeric DNA bundet til ved TRF2. Input, supernatant før immunoprecipitation; ppt, protein-DNA immunpresipitatet kompleks. Spesifikk (telomeric) og uspesifikke (Alu) prober ble brukt.
Telomeric DNA i ChIP (%) = Telomeric DNA-signaler av PPT /Telomeric DNA-signaler av inngang * 100%.
TPP1 Overuttrykte påvirker ikke telomerase aktivitet
for å undersøke om de langstrakte telomerer i HCT116-TPP1 celler var et resultat av økt telomerase aktivitet, ble telomerase aktivitet og hTERT proteinnivåer i HCT116-TPP1 celler sammenlignet med HCT116-Mock celler. Det var ingen påviselig økning i hTERT proteininnhold eller i telomeraseaktivitet i HCT116-TPP1-celler sammenlignet med celler eller mock parentale celler (Figur 5B og C). Dette resultatet indikerer at telomer forlengelse av TPP1 ikke skyldes en generell økning i telomerase aktivitet.
TPP1 Overuttrykte Accelerated reparasjonen Kinetics av DNA Damage indusert av IR
Vi brukte TIF analyse for å fastslå om TPP1 overekspresjon innvirkning reparasjon kinetikk DNA-skader på telomerer. Telomer-chip-analysen viste at TPP1 overekspresjon hadde ingen innvirkning på sammenhengen mellom TRF2 og telomerer (figur 5D), så TIFs ble overvåket av samlokalisering av TRF2 og γ-H2AX i denne studien (figur 6A). Vi har observert betydelig lavere frekvenser av spontane TIFs i HCT116-TPP1 celler sammenlignet med kontrollceller (p 0,05) (figur 6B) .Deretter HCT116-TPP1 og -Mock celler ble eksponert for en Gy IR og farget for å identifisere TIF foci ved 0,5, 6 og 12 timer etter eksponering IR. Vår forskning antydet at TPP1 overekspresjon cellene var i stand til å reparere TIFs mer effektivt enn kontrollcellene. For eksempel, frekvenser av IR-indusert TIFs var tilsvarende i HCT116-TPP1 og HCT116-celler Mock 0,5 timer etter IR, noe som indikerer at TPP1 ikke reduserte antallet TIFs indusert av IR. Deretter TPP1 overekspresjon cellene hadde ca. 0,53 TIFs /celle 12 timer etter IR, mens mock cellene hadde 1,04 TIFs /celle 12 timer etter at IR (figur 6C). Dermed HCT116-TPP1 celler viste økt evne til å reparere skader på telomerer. TIF-analyse identifiserte γ-H2AX foci ved telomerer, så vel som total γ-H2AX foci i kjernen. Deretter kvantifiseres vi dannelsen av total γ-H2AX foci, en markør for DSB sin, for ytterligere å undersøke den underliggende mekanismen for radioresistance. Lignende med resultatene av TIFs assay, ble graden av total DNA dobbel tråd bryte reparasjon akselerert av TPP1 overekspresjon. Disse dataene indikerer at TPP1 overekspresjon kan akselerere hastigheten av DNA-reparasjon etter stråling.
HCT116-Mock og -TPP1 ble eksponert for en Gy IR og inkuberes ved angitte tidspunkter .. Resultatene er basert på tre uavhengige eksperimenter med i gjennomsnitt 100 cellekjerner analysert per eksperiment per poeng. Barer representerer gjennomsnitt ± SEM av 3 uavhengige eksperimenter.
(A) Representative bilder for TIFs vises.
(B) Frekvenser av spontan γ-H2AX positive foci og TIFs i HCT116-Mock og -TPP1 celler.
(C) Reparasjon kinetikk IR indusert TIF i HCT116-Mock og -TPP1 kolorektal celler. Gjennomsnittlig TIFs per celle ved forskjellige tidspunkter etter IR eksponering ble kvantifisert.
(D) Reparasjon kinetikk IR indusert DNA-skader i HCT116-Mock og -TPP1 kolorektal celler. Averageγ-H2AX positive foci per celle ved ulike tidspunkter etter IR eksponering ble kvantifisert.
Diskusjoner
Vi har vist for første gang, så vidt vi vet, at TPP1 overekspresjon er assosiert med radioresistance i kolorektal kreft celler i dette arbeidet.
TPP1 spiller avgjørende roller i telomerlengde regulering og DNA-skade respons. I denne studien viste vi at TPP1 uttrykket ble korrelert med telomerlengde og Radiosensitivity i kolorektal kreftceller. Videre fant vi at ektopisk overekspresjon av TPP1 førte til radioresistance og telomerer forlengelse i HCT116 cellene. Tidligere undersøkelser bekreftet at det var en signifikant negativ korrelasjon mellom telomerlengde og Radiosensitivity [10,11,13]. Vår studie viste at TPP1 involvert i radioresistance gjennom regulering av telomerlengde. Telomerer spille en sentral rolle i opprettholdelsen av kromosom integritet og stabilitet, og forkortet telomerlengde er assosiert med økt risiko for kreft [23]. POT1 proteinnivåer er forbundet med telomerlengde i magekreft [24,25]. TPP1 heterodimerizes med POT1 men det finnes ingen resultater om sammenhengen mellom TPP1 nivåer og telomerlengde i kreftprøver. Vi tror sammenhengen mellom TPP1 nivåer og telomerlengde i kolorektal kreft prøvene er av stor betydning. Egentlig, i vår studie, vi prøvde å gjøre dette arbeidet bruker parafin prøver, men fant at ferske kreft vev er mer egnet for den sørlige blotting eksperimentet. I våre følgende studie, vil vi samle inn mer frisk kreft vevsprøver og bekrefte forholdet mellom TPP1 og telomerlengde ved kolorektalkreft med ferske kreft vev.
Vi fant at TPP1 overekspresjon forlenget stråleindusert G2 /M arrest etter IR eksponering. Celler arrestert i G2 /M fase gi mer tid til å reparere skader og dermed gi radioresistance. Aktivering av kontrollpunkter regulerer arrest av cellesyklusen i respons til DNA-skade. Ataxia telangiectasia (AT) mutert (ATM) og ATM og rad3 relaterte (ATR) proteinkinaser er stor oppstrøms sjekkpunkt kinaser for DNA-skade respons [26]. Vi viste at TPP1 overekspresjon forhøyet uttrykk av både ATM og ATR protein. Tidligere studie viste at økt minibank protein nivåer korrelert med indre radioresistance i GBM svulster [27]. Kim og kolleger fant at ATR overekspresjon førte til langvarig G2 /M arrest og radioresistance i HCT116-celler [28]. Mange studier har også vist at inhibering av aktiviteten av ATM eller ATR kan føre til økt Radiosensitivity [29,30]. Chk1 er et viktig substrat for ATM og ATR. Videre er Chk1 et effektivt mål for bestrålingssensibilisering i humane kreftceller [31,32]. Fosforylering av Chk1 på S345 er å anse som en indikator på Chk1 aktivering. I denne artikkelen har vi funnet at Chk1 fosforylering ble forhøyet og vedvarende inntil senere tidspunkter etter IR eksponering i TPP1-overekspresjon celler sammenlignet med modell celler. Vår studie kan tyde på at langvarig G2 arrest etter TPP1 skyldes sannsynligvis høyere nivåer av ATM /ATR-Chk1 signalveien.
Mange studier har vist at telomer-homeostase fungerer som et potensielt mål i kreftbehandling, spesielt i strålebehandling . Telomerer homeostase kan opprettholdes ved telomerase samt tilhørende proteiner (betegnet som shelterin). Telomerlengde, telomerase-aktivitet og telomer-dysfunksjon er de viktigste markører for telomere homeostase. For det første, telomerlengde analyse viste signifikant telomere forlengelse i HCT116-TPP1-celler sammenlignet med kontrollcellene, hvilket indikerer at TPP1 kan virke som en positiv regulator av telomer-lengde. Det ble imidlertid observert at ekspresjon av TPP1 hadde ingen effekt på telomerlengde i human fibrosarcoma HTC75 celler [16]. Forskjellen mellom disse resultatene kan være grunn til den distinkte valgt i cellelinjer. Interessant nok var det ingen påviselig økning i telomerase aktivitet eller hTERT proteinnivået i HCT116-TPP1 celler sammenlignet med kontrollceller. Dette resultatet indikerer at telomer forlengelse av TPP1 er ikke på grunn av en generell endring i telomerase aktivitet, men kan være på grunn av hTERT atomtrans eller lokalisert aktivering av telomerase på telomere.
samlokalisering av telomerer og aktivert DDR markører (som 53BP1 andγ-H2AX), såkalte telomerer dysfunksjon-indusert foci (TIF), er et typisk tegn på telomerer dysfunksjon. TIFs innebærer DDR av uncapped telomerer [33] .Recent studier viste at TPP1 innebærer i DNA skade respons og undertrykkelse av TPP1 uttrykk i mus embryo fibroblaster (MEFs) eller humane kreftceller kunne initiere telomerer dysfunksjon [19,20]. I denne studien fant vi at TPP1 overekspresjon hemmet spontane TIFs i HCT116 kolorektal celler. Så TPP1 kan beskytte telomerer struktur og opprettholde normal telomere funksjon.
Vi fant at TPP1 overekspresjon akselerert reparasjonskinetikk total DNA dobbel tråd pause indusert av IR eksponering. Enda viktigere, TIF analysen viste at reparasjon frekvensen av DNA-skade på telomerer følgende stråling ble også akselerert av TPP1 overekspresjon. Telomer-homeostase hadde blitt identifisert til å tjene som et potensielt mål i radioterapi. Studier har vist at telomerase hemming kan resultere i telomerer dysfunksjon og dermed økt Radiosensitivity [22,34]. Det ble også bekreftet at avbrudd i shelterin kan resultere i telomerer dysfunksjon [14,20]. David Soler og kolleger viste at dysfunksjonelle telomerer i humane epitelceller var trolig å forstyrre den effektive reparasjon av stråling-indusert DSB sin og deretter ført til økt Radiosensitivity [35]. Vår studie viste at TPP1 kan delta i telomerer homeostase og kunne beskytte telomerer mot stråling i menneskelige kolorektal kreftceller.
I konklusjonen, denne studien viser at forhøyede TPP1 nivåer beskytte telomerer fra DNA skade og gi radioresistance i human kolorektal kreft celler. I tillegg gir vi bevis på sammenhengen mellom TPP1expression, telomerlengde og egenverdi Radiosensitivity. I tillegg har denne studien økt forståelsen av sammenhengen mellom telomere homeostase og bestrålingssensibilisering. Disse resultatene antydet at TPP1 nivåer kan være en nyttig indikator på respons til strålebehandling. Oppsummert vår studie for første gang viser at TPP1 kan være et potensielt mål i strålebehandling av tykktarmskreft. Videre kan TPP1 hemming TPP1 hemning gir en funksjonell adjuvant i strålebehandling, en mulighet vi undersøker.
Takk
Vi takker Dr. Joachim Lingner ((ISREC, Epalinges, Sveits)) for hans type gave pcDNA6-flagg-hTPP1 plasmid.
