Abstract
Innledning
In vitro
aktivering og vekst av primordial sovende follikler å produsere fertilizable oocytter ville gi et nyttig instrument for fruktbarhet bevaring. Ansettelse av fosfatase og TENsin homolog (PTEN) hemmere i kombinasjon med protein kinase B (Akt) stimulerende molekyler, har tidligere vært ansatt for å øke follikulær aktivisering gjennom stimulering av PTEN-Akt veien.
Metoder
Vi tar sikte på å etablere bedre
in vitro
aktivisering også for kreftpasienter med eggstokkvev er allerede fryses ned. Frisk og tidligere kryopreserveres menneskelig eggstokkreft cortex ble utsatt for kortsiktig, lav konsentrasjon og eggstokk-spesifikk behandling med bare en PTEN-hemmer.
Resultater
in vitro
aktivering protokollen forbedrer aktiveringsmekanismer opprinnelige follikler i både fersk og cryopreserved prøver, og forstørrer voksende befolkninger uten å indusere apoptose i enten follikler eller den omkringliggende stroma. Behandling komplementerer østradiol sekresjon og gjenoppretter ekspresjonsnivåene av den tidligere redusert Anti-Mullerian hormon ved hjelp av nedfrysing prosedyrer. Genomisk modulering av den relative uttrykk for
PTEN
pathway gener ble funnet i behandlede prøvene.
Konklusjon
in vitro
aktivering protokollen tilbyr nye alternativer for pasienter med cryokonserverte vev som det øker pool av levedyktige aktiverte follikler tilgjengelig for
in vitro
vekst prosedyrer. Kombinasjonen av eggstokkvev cryopreservation og
in vitro
aktivering av opprinnelige follikler, hoved ovarian reserve komponent, vil være et stort fremskritt i fruktbarhet bevaring
Citation. Novella-Maestre E, Herraiz S , Rodríguez-Iglesias B, Díaz-García C, Pellicer A (2015) Short-Term PTEN Hemming Forbedrer
In vitro
Aktivering av Primordial follicles, Bevarer Follicular levedyktighet, og gjenoppretter AMH nivåer i kryopreserveres eggstokkvev fra kreftpasienter . PLoS ONE 10 (5): e0127786. doi: 10,1371 /journal.pone.0127786
Academic Redaktør: Wei Shen, Qingdao Agricultural University, KINA
mottatt: 12 januar 2015; Godkjent: 19 april 2015; Publisert: 29. mai 2015
Copyright: © 2015 Novella-Maestre et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet av Grants SAF 2011-30031-CO2-01 og FIS PI13 /02 353 fra det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne, ved Dexeus kvinners helse Foundation Grant 2011 og ved PROMETEOII /2014/045 og GV /2014/115 av Regional Valencia Kunnskapsdepartementet. SH deltakelse har vært støttet av et stipend CD11 /00 292 fra det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne og BRI av AP-2010-0675 stipend fra det spanske departementet for utdanning, kultur og idrett. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
overlevelse etter kreft i ungdomsårene og barndommen har forbedret [1]. Dermed en stor bestand av unge kvinner, som ikke har oppfylt sine reproduktive prosjektet, vil lide sekundære effekter av kreftbehandling, slik som gonadotoxicity. Dette forholdet, sammen med det faktum at vårt samfunn forsinker fertil alder [2], betyr at fruktbarheten bevaring (FP) blir stadig bedt om, spesielt hos unge kreftpasienter.
Flere alternativer er for tiden tilgjengelig for kvinnelige FP, slik som nedfrysing av ubefruktede egg [3], embryoer [4], eller eggstokkvev [5-7].
eggstokkreft cortex inneholder hvil opprinnelige follikler som kjennetegnes ved sin motstand mot frysing og tining prosesser. Gitt disse egenskapene, den kryopreservering av ovarial cortex for etterfølgende autolog orthotransplantation er den mest brukte teknikken for å bevare fruktbarheten hos kreftpasienter [8]. Videre er det det eneste alternativet i pediatriske pasienter uten modne oocytter å være cryopreserved, og for tilfeller av hormonavhengige sykdommer [9, 10].
Det totale antallet tilgjengelige opprinnelige follikler er blant annet viktig spørsmål, det viktigste determinant sikre FP suksess. Det kan bli svekket av flere faktorer, som for eksempel eggstokkene cortex størrelse, alder, tidligere kjemoterapi, og andre potensielle effekter av kreft på kvinnelige gonader. Det har allerede blitt publisert som ondartet kreft som brystkreft, kan også påvirke forplantnings utfallet som ovarian reserve er svekket hos unge kvinner med kimcellelinje
BCRA1
mutasjoner [11]. Ovarial respons på kontrollerte stimulerende sykluser avtar hos kreftpasienter, selv før de får noen behandling [12]. Likevel, er risikoen for å gjeninnføre ondartede celler inn transplantert vev er den største bekymringen av eggstokkene nedfrysing. Denne bivirkningen er økt risiko [13-15] hos pasienter med hematologiske kreftformer, som leukemi, den vanligste malignitet av barndommen [16]. Derfor bør nye trygge alternativer bli utviklet for å optimalisere ovarian reserve hos disse pasientene hvor nedfrysing og transplantasjon av eggstokkene cortex er kontraindisert [17], eller hos barn som ikke har noen modne oocytter som skal fryses ned [18].
som et tidligere trinn til vekst, opprinnelige sovende follikler, hoved ovarian reserve komponent [19, 20], må aktiveres for deres utviklings program å starte. Forskjellige veier er involvert i hårsekken aktivering veiledning ved kontroll av egg vekst initiering og vedlikehold, slik som fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10 (PTEN), fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K), gaffelhodeboks O3 (FOXO3), og pattedyr target of rapamycin kompleks 1 (mTORC1) [21-26]. Likevel, de underliggende mekanismene for aktivering fortsatt ukjent.
Det har blitt rapportert at veksten av alle opprinnelige follikler i neonatale og voksne dyr er fremmet av eggcelle spesifikke sletting av
PTEN
genet [21, 24-26]. Dette genet koder for et fosfatase enzym som negativt regulerer PI3K-Protein kinase B (Akt) signalveien.
PTEN
sletting øker Akt fosforylering og kjernefysiske eksport av nedstrøms FOXO3 proteiner [24]. Faktisk
FOXO3
genet sletting aktiverer også alle sovende follikler hos mus. Nylig, Li et al. 2010 [26] utviklet en kortsiktig, eggstokk-spesifikk behandling av gnager og menneskelige eggstokkene med en PTEN inhibitor og /eller et PI3K aktivator. Behandling økt FOXO3 atom ekstrudering i primordial oocytter, noe som førte til deres aktivering.
Basert på disse funnene, ble en klinisk studie utført av Kawamura [27] for å undersøke effekten av PTEN-hemmere og Akt stimulatorer molekyler brukes for
in vitro
aktivering (IVA) prosedyre hos kvinner med tidlig eggstokksvikt. Denne studien viste at de resterende hvilende hårsekker på ovarial reserve kan bli reddet ved å fremkalle aktiveringsmekanismer for å produsere fertilizable oocytter.
Oppløftende av disse resultatene, er målet med denne studien var å oppnå aktivering av menneskelige sovende opprinnelige follikler nedsenket i eggstokkene cortex fra kreftpasienter gjennom inkubasjon med PTEN inhibitor for å unngå eggcelle degradering til, derfor øke «pool» av levedyktige opprinnelige follikler tilgjengelig for
in vitro
vekst prosedyrer.
Material og metoder
Kjemi
Alle kjemikalier, kulturmedier og reagenser som brukes i denne studien ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), med mindre annet er angitt.
studie~~POS=TRUNC
Etikk uttalelse og samling vev.
Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board of Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia, Spania (2011/0018) og gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke, 18 menneskelige eggstokkene cortex biopsier fra kvinner som blir ansatt i vår fruktbarhet Bevaring Program ble oppnådd. Eggstokk cortex biopsier ble bare tatt med dersom gjenværende vev var tilgjengelig etter eggstokk cortex kolleksjon for fruktbarhet bevaring formål. Pasientene ble påvirket av brystkreft (n = 8), rhabdomyoma (n = 1), akutt lymfoblastisk leukemi (n = 1), Hodgkins lymfom (n = 4), anti-syntetase-syndrom (n = 1), Ewing’s sarkom (n = 1), medulloblastom (n = 1) og ikke-Hodgkins lymfom (n = 1). Gjennomsnittlig pasientens alder var 27,8 (spredning 14-37) år. Ingen pasienter hadde gjennomgått kjemoterapi /strålebehandling før ovarial cortex utvinning. Eggstokk biopsier (en omtrentlig tykkelse på 10x10x1 mm) ble umiddelbart vasket med serumfritt M199-medium ved 37 ° C, dissekert ved å fjerne medulla og kuttet i to deler: en for å teste IVA protokollen i friskt vev, og den andre for å teste den i cryokonserverte /tint vev. På grunn av den begrensede størrelsen på utvalget, ble bare 14 av de 18 som oppnås biopsier inkludert i cryokonservert gruppen
Eksperimentelle grupper
Fresh eggstokkene stykker (n = 18) ble delt i strimler..; en ble umiddelbart løst til å fungere som en startbetingelse frisk kontroll vev og ble tildelt i Gruppe 1 (S1 figur); den andre ble allokert til gruppe 2 og var
in vitro
aktivert og dyrket i 25 timer med PTEN-hemmer.
For å kunne vurdere om det var noen skadelige effekter på grunn av dyrkningsforhold, tilleggs friske eggstokkene strimler (n = 9) ble allokert til gruppe 3 og ble inkubert under de samme vilkår som de aktiverte seg, men uten PTEN inhibitor til å fungere som et friskt kultivert kontroll.
kryopreserveres /tint eggstokkene stykker ( n = 14) ble også oppdelt i strimler; en ble løst umiddelbart etter tining til å fungere som en startbetingelse cryokonserverte kontroll vev og ble kåret som gruppe 4; en annen ble allokert til konsernets fem til inkuberes og dyrket med PTEN inhibitor i 25 timer; en tredje ble dyrket i 25 timer uten PTEN-inhibitor og ble betraktet som den cryokonservert dyrket kontroll, kalt Gruppe 6.
Prøvene fra de friske og cryopreserved dyrkede kontrollgrupper (gruppe 3 og 6) ble anvendt for TUNEL analyse og hormonproduksjonen kvantifisering av ELISA, som beskrevet nedenfor.
eggstokkvev Kryopreservering og tining.
En langsom frysing teknikken ble brukt til å fryse ned eggstokkene strimler. M199 kulturmedium, inneholdende 5% humant serumalbumin (HSA) og 10% dimetylsulfoksid (DMSO), ble anvendt som en kryobeskyttende løsning. DMSO ble sekvensielt tilsatt i en to-trinns fremgangsmåten, og fragmentene ble fordelt i eddik vinylacetatposer (Cryocyte, Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA). Forseglede poser ble plassert i fryserommet av en kontrollert hastighet fryseanordning (Planer). En langsom-fryseprotokoll ble påført ved å følge samme fremgangsmåte for tiden anvendt for kliniske formål i vår fruktbarhet bevaring program. Posene ble lagret i flytende nitrogen (-196 ° C), som tidligere beskrevet [28, 29]. Tining fant sted etter 24 timer. Posene ble tint og cryoprotectant ble eluert med en 3-trinns protokoll, som beskrevet andre steder [28, 29].
IVA protokollen
Kortsiktige inkubasjon med Dipotassium Bisperoxo (picolinato) oxovanadate V, PTP Inhibitor XV (BPV (bilde)), ble utført som en IVA protokoll. I korthet aktiverte prøver ble først inkubert i 1 time med 100 pM av BPV (bilde) (Calbiochem, Merck KGaA, Tyskland) i α-MEM medium supplert med 10% HSA og 1% Antibiotikum-Anti-fungal Solution (ATB). Da prøvene ble inkubert i 24 timer med samme media (100 mikrometer BPV (bilde) + 10% HSA, en% ATB- α-MEM) supplert med 0,3 I.U. av FSH. Alle inkuberingene ble utført under standard dyrkningsbetingelser ved 37 ° C, 5% CO
2.
I de dyrkede kontrollgruppene (G3 og G6), ble prøvene inkubert under de samme betingelser, men BPV ( pic) ble ikke lagt til kulturmediet. Etter IVA fremgangsmåte og dyrking ble prøver fiksert i nøytral bufret formalin, og kulturmediet ble umiddelbart lagret ved -80 ° C for hormon kvantifisering.
Histologisk evaluering og follikulære tellinger
formalinfiksert prøvene ble parafininnstøpte (FFPE) og kutt i 4-mikrometer tykke seksjoner. Hver 10
th delen ble farget med hematoksylin-eosin (H E) for å utføre histologisk analyse og follikulære teller. De gjenværende seksjoner ble anvendt for analyse immunhistokjemi
I H Primære stadium: eggcelle var omgitt av et fullstendig lag av cuboidal GC; Sekundære trinn: eggcelle var omgitt av to lag, eller flere, av cuboidal GC [19]. Folliklene ble talt bare når eggcelle kjernen var til stede for å unngå dobbelttelling. Bare friske follikler [30] ble tellet for å fastslå de tettheter og prosentandeler av den hvilende (opprinnelige) og voksende follikler (primær, sekundær). Alle H E-fargede seksjoner ble undersøkt av to forskjellige observatører (ENM, SH)
Immunohistochemistry
For å etablere follikulær aktivering, proliferativ status og vekst gjennom videregående trinn, farging med FoxO3a,. Ki-67 og Anti-Mullerian hormon (AMH) ble gjort. Et kanin anti-humant monoklonalt FoxO3a antistoff (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA), ved 1: 150 fortynning, ble inkubert i 60 minutter ved romtemperatur (RT) for å detektere hårsekken aktivering. Et monoklonalt mus anti-human Ki-67-antistoff (MIB-1, Dako Denmark A /S, Glostrup, Danmark), i 1: 100-fortynning, ble inkubert ved RT i 60 min, og ble anvendt for spesifikt å påvise follikulære prolifererende celler . Et geit polyklonalt anti-human-MIS-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg, Tyskland), ved 1: 200 fortynning, ble benyttet for å detektere AMH (60 min og RT). For alle antistoffene, ble en biotin /streptavidin reaksjon som brukes for det sekundære antistoff inkubasjon (LSAB metode Dako Denmark A /S, Glostrup, Danmark), etterfulgt av deteksjon med 3,30-diaminobenzidin (DAB). For negative kontroller ble det primære antistoff utelatt; for de positive kontrollene ytterligere sklie, som inneholder lunge, proliferativ endometrium og testis, ble inkludert.
Follicles ble vurdert aktiveres når FoxO3 atom ekstrudering på eggcelle ble oppdaget. Ki-67 og AMH var positive når oppdages i GC og i oocytten kjerner /GC, henholdsvis.
AMH og østradiol (E2) produksjons
For AMH besluttsomhet, media prøver kultur ble analysert ved AMH-Gen-II ELISA (Beckman Coulter, Immunotech, Texas, USA) etter produsentens protokoll. Kort beskrevet ble prøver og kontroller dispensert inn i mikro-titrert brønner belagt med anti-AMH antistoff. Etter inkubasjon og vasking ble biotin-merket anti-AMH deteksjon-antistoff tilsatt. Etter vasking, ble streptavidin-pepperrot peroksydase tilsatt til brønnene og utviklet. Deretter absorbansen ble målt i en automatisk ELISA-avleser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Deteksjonsgrensen (LOD) av AMH analysen var 0,08 ng /ml; denne analysen oppdager ikke inhibin A, activin A, FSH og LH. Intra- og inter-assay variasjonene var 3,7% og 4,4%, respektivt.
E2 ble målt med Østradiol EIA-sett (Cayman Chemical Company, Michigan, USA). Analysen ble utført ved å følge produsentens protokoll i ufortynnede prøver. Absorbans ble målt ved 405-420 nm. LOD av E2 analysen var 20 pg /ml, og interferens med andre steroidhormoner var 0,01%. For 102,4 pg /ml, intra- og inter-assay variasjoner var 13,0% og 8,2%, respektivt.
I begge analysene, absorbansen var omvendt proporsjonal med konsentrasjonen av AMH og E2 i prøvene, som var beregnet ut fra kalibreringskurven. Prøvene ble kjørt i triplikat. Resultatene ble uttrykt i ng /ml og pg /ml, henholdsvis, og også i henhold til den etablerte standardkurven.
Apoptose kvantifisering ved TUNEL
DNA-fragmentering ble gjenkjent av TdT (terminal deoxyribonucleotidyl transferase) -mediert dUTP nick-ende merking (TUNEL) analyse ved hjelp av TMR rød
in situ
celledød deteksjon kit (Roche Diagnostics, Tyskland). Tre parafininnstøpte snitt per prøve ble klarert med xylen og rehydrert (etanol, destillert vann) før de blir analysert. Etter vasking med PBS, antigen gjenfinning med 10 mM citratbuffer ble utført i en mikrobølgeovn i 5 minutter. Da snittene ble inkubert i 60 minutter ved 37 ° C i et mørkt fuktet kammer med 50 ul av TUNEL reaksjonsblandingen; denne blandingen ble utelatt i den negative kontroll. Prøvene ble montert med forlenge Gold Antifade Reagens med DAPI (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) og undersøkt under et mikroskop ved konvensjonell fluorescens. Den apoptotiske signal ble registrert som positiv når dUTP farget kjernen rødt.
Cell skade ble kvantifisert i opprinnelige follikler, hoved ovarian reserve komponent, og i eggstokkene stroma. Folliklene ble vurdert skadet når eggcelle kjernen, eller mer enn 50% av GC, var farget rød av dUTP. I ovarian stroma ble celledød undersøkt ved TUNEL uttrykt som prosenten av celledød [(TUNEL + celler /totalt antall celler) * 100]. Den apoptotiske Kursen for IVA grupper (G2 og G5) ble sammenlignet med sine respektive kultur kontroller (G3 og G6). Utvelgelsen av de dyrkede kontrollene tillatt oss å belyse hvis celleskader, da observert kan skyldes PTEN inhibering eller bare for å dyrkningsforholdene. Videre har apoptotisk grad påvist i frisk ovarial cortex eller indusert ved nedfrysing teknikker, er tidligere påvist [28, 31-34].
For å kvantifisere tunel analysen, høyoppløselige bilder ble oppnådd ved lysmikroskopi ( LEICA DM4000B, Leica Microsystems GmbH, Tyskland) med et digitalt kamera festet (LEICADFC450C, Leica Microsystems GmbH, Tyskland). Kvantifisering ble vurdert av bilde ProPlus 6.3-programvaren (Media Cybernetics Inc. Rockville, MD, USA).
Relativ genekspresjon av PTEN veien
mRNA ble innhentet fra 7-9 FFPE- eggstokkene prøver av hver gruppe med Recover All Total Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) etter produsentens protokoll. For hver prøve ble fire 15-um glass anvendes. Deretter cDNA ble syntetisert med MultiScribe revers transkriptase fra High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Byosistems, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Spesifikke TaqMan prober ble analysert ved Real-Time PCR for å kvantifisere den relative uttrykk for følgende gener:
PTEN
,
PI3KCB
,
akt1 Hotell og
FOXO3
. PCR-reaksjonsblandinger ble fremstilt med 100 ng cDNA som templat i den 1xTaqman Gene Expression Master Mix å følge produsentens protokoll. Da prøvene ble forsterket i 7900HT Fast PCR system (Applied Byosistems, Rednings Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). PCR-betingelsene besto i en innledende aktivering av uracyl-
N
-glycosylase ved 50 ° C i 2 min., Etterfulgt av AmpliTaq Gold aktivering ved 95 ° C i 10 min. Da prøvene ble syklet 40 ganger med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, og en gløde forlengelse ved 60 ° C i 1 minutt per syklus. Hver prøve ble analysert i triplikat.
Etter regulering av utvidelseseffektiviteten av målene gener, den relative ekspresjon ble oppnådd ved den komparative Ct-metoden (DDCt) [35]. Den ekspresjon av målgen mRNA ble normalisert med ekspresjonen av 18S reportergen.
Statistisk analyse
Alle dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Den Friedman test, etterfulgt av en Wilconox sammenkoblet
post hoc
test ble utført for å evaluere resultatene mellom gruppene. p 0,05 verdiene ble betraktet som statistisk signifikant. Alle analysene ble utført med SPSS 19.0 (IBM, Somers, NY, USA)
Resultater
Follikulære tettheter og bestander
Blant H . E-farget eggstokkene seksjoner , 597 follikler ble talt opp og undersøkt. Når primordial, grunnskoler og videregående tettheter ble sammenlignet blant de aktiverte prøvene og deres respektive opprinnelige tilstand kontroller (G1 og G4), ble ingen signifikante forskjeller påvist i friske eller cryopreserved prøver (p = ns), og heller ikke når de ble sammenlignet med den kultiverte kontrollgrupper (G3 og G6) (tabell 1).
de eksperimentelle inngrep utført på eggstokkvev prøvene inngår i hver forsøksgruppe med vår studie er oppført i Tabell 1. Follikulære tettheter og prosenter av hver populasjon ble beregnet. Verdiene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Den kryopreservert aktivert (G5) gruppe viste statistisk signifikante forskjeller for prosentandelen av hvilende og voksende follikler forhold til den opprinnelige tilstanden.
Men etter aktivering, prosentandelene av opprinnelige follikler senket i både de friske og cryopreserved IVA-grupper når sammenlignet med de første tilstandskontroll av vev (gruppe 1: 62,3 ± 8,3%, G2: 47,9 ± 8,2%, G4: 55,0 ± 6,1%, G5: 38,2 ± 7,1%), men prosenter av de voksende de økte (G1: 37,7 ± 8,3%, G2: 52,03 ± 8,2%, G4: 46,9 ± 6,1%, G5: 61,9 ± 7,1%) når sammenlignet med kontrollene deres, eller sammenlignet med de dyrkede kontrollene (G3 og G6). Dette fenomenet var statistisk signifikant bare i G5-gruppen (p = 0,02 og p = 0,03, henholdsvis).
For å belyse om det var noen forskjell mellom vår umiddelbart fast kontroll og de dyrkede kontroller, en utforskende studie ble utført (S1 tabell). ble påvist noen forskjeller mellom de friske og cryopreserved første tilstandskontroll vev når primordial, grunnskoler og videregående follikulære tettheter ble sammenlignet med sine respektive kulturkontroll vev, og heller ikke når de hvilende og voksende befolkninger ble sammenlignet.
Follikkelfasen aktivering
FOXO3 atom eksport, en indikator på hårsekken aktivisering, ble overvåket (fig 1A og 1B) og kvantifisert (fig 1C og 1D) i de aktiverte prøver, og også i sine respektive styrer. En 3-gangers økning i andelen av aktiverte opprinnelige follikler ble sett i friske aktiverte prøver (G2: 59.55 ± 9.88%) sammenlignet med sine første kontroll (G1: 23,69 ± 5,71%, p = 0,03). Når primær follicle-aktivering ble analysert, var ikke statistisk signifikant til tross for den 15% økning observert i den aktiverte gruppe (G2: 80,44 ± 4,8%, G1: 66,4 ± 8,9%, p = NS). I cryopreserved aktivert prøver (G5), produsert IVA protokollen en betydelig to ganger økning i primordial og primær hårsekken aktivering (fig 1D) sammenlignet med deres kontroll gruppe (Primordial: G5: 63,7 ± 8,9%, G4: 36,8 ± 7,2 %, p = 0,04 og primær: G5: 93,80 ± 2,4%, G4: 47,5 ± 8,9%, p = 0,03)
(A) og (B),. FOXO3 deteksjon og lokalisering for å overvåke follikulær aktivering. Follikler fra G2 og G5 prøvene er vist, henholdsvis. Legg merke til at de aktiverte follikler fra G2 og G5 gruppene presenterer en FOXO3 atom ekstrudering (pil) og et positivt signal i GC; (C) den prosentandel av opprinnelig follikulær aktiveringen ble undersøkt i friske eggstokkene vev, og en betydelig økning ble observert i G2 i forhold til G1 (* p = 0,03); (D) når aktivert primordial follicular prosent ble sammenlignet i tidligere cryokonservert-tint gruppen ble hårsekken aktivering forbedret i G5 vs G4 (** p = 0,03); (E) fersk aktivert prøve (G2), primordial hårsekken viser Ki-67 flekker i GC og oocytten kjerner; F) Ki-67-positive signal i oocytter av primordial follikler fra cryokonservert-aktivert prøve (G5); (G) kvantifisering av AMH ekspresjon i GC. Det ble observert en økning i AMH uttrykk i GC fra folliklene i både G2 (§ p = 0,006) og G5 (§§ p = 0,008) som en følge av
in vitro
aktiveringsprosedyre med 100 mikrometer av BPV (bilde); (H) estradiol sekresjon til kulturmedier. Som grafen viser,
in vitro
aktivering økt E2 sekresjon i
in vitro
aktivert frisk (G2
vs
. G3 * p = 0,036) og cryopreserved (G5
vs
. G6 ** p = 0,001) prøver i forhold til sine egne kontroller.
spredning og vekst til videregående trinn
Ki-67-positive celler ble detektert i oocytter og GC fra alle de aktiverte prøvene (figur 1E og 1F). Dette funnet viser at BPV (bilde) eksponering, selv etter nedfrysing prosedyrer, påvirker ikke proliferativ evne opprinnelige og primære follikler.
AMH farging viste en signifikant økning, på rundt 23-30%, i AMH positive follikler etter IVA behandling i de aktiverte prøver fra grupper G2 og G5 i forhold til opprinnelig tilstand kontroller av vev (G1: 53,3 ± 8,7%
vs
.G2: 76,3 ± 9,4%, p = 0,006 og G4: 25,7 ± 8,2%
vs
G5: 54,5 ± 10,2%, p = 0,008) (fig 1G)
AMH og Østradiol produksjon
Kvantifisering av AMH.. i kulturmedium viste at IVA protokollen betydelig økt AMH konsentrasjonen i fersk aktiverte prøvene i forhold til den kultiverte kontrollgruppen (G2: 0,34 ± 0,1 ng /ml
vs
G3.: 0,47 ± 0,1 ng /ml ; p = 0,017). Imidlertid, denne økningen ble ikke påvist i de tidligere cryopreserved prøver, hvor AMH nivåene forble under den lave LOD i alle de analyserte prøvene.
En betydelig økning i E2 konsentrasjonen utskilt i kulturmediet ble påvist i både frisk (G3: 84,9 ± 17,7 pg /ml
vs
G2: 98,6 ± 22,9 pg /ml, p = 0,036.) og cryopreserved IVA grupper (G6: 33,6 ± 6,3 pg /ml
vs
G5. 40,8 ± 6,8 pg /ml, p = 0,001) sammenlignet med sine respektive kultur kontroller (fig 1 H)
Apoptose av TUNEL
for å belyse hvorvidt IVA protokollen indusert noen skadelig effekt på eggstokkene stroma eller follikler, ble celleskader undersøkt og kvantifisert ved TUNEL i de aktiverte og kontroll-dyrkede prøver. TUNEL-positive celler ble detektert i alle forsøksgrupper, til og med i begge de dyrkede kontrollgrupper, på grunn av de dyrkningsbetingelser (figur 2A til 2D). Angå follikulær celleskader (Fig 2E), viste studien at det ikke var noen statistisk forskjell i graden av skadede follikler mellom de aktiverte grupper og deres respektive kultur kontrollprøver i frisk (G2: 7,7 ± 4,0%
vs
G3: 13,0 ± 7,6%, p = NS) og cryopreserved vev (G5: 6,25 ± 6,0%
vs
G6. 28 ± 18,4%, p = NS), selv om en bred variasjon mellom prøvene var oppdaget (S2 fig). Når celleskader ble kvantifisert i stroma, var ingen signifikante forskjeller på grunn av aktiveringsprosedyrer funnet (figur 2F).
(A) cellekjerner farget med DAPI (blå) for å utføre Tunel analysen. Prøven fra G3 gruppen. Tunel + signalet ble funnet i stomi celler (røde) fra G3; (B) merk primordial hårsekken i G2 prøven. Tunel + signalet ble funnet i stroma, men merk at det var fraværende i eggcelle og GC fra folliklene i G2 gruppe; (C) den G6 prøven. Opprinnelige follikler omgitt av flate formet GC og stroma kjerner farget med DAPI (blå). TUNEL-positive celler farget i rødt i stroma. Follikler var negative for DNA-skader i G6 prøven; (D) G5 prøven som inneholdt to opprinnelige follikler, cellekjerner farget med DAPI. Ingen TUNEL + signal ble påvist i eggcelle og GC, men var positiv i eggstokkene stroma; (E) celledød indeks. Kvantifisering av follikler med en positiv TUNEL signal i eggceller eller GC. ble oppdaget ingen forskjeller mellom aktiverte og ikke-aktiverte prøver; (F) TUNEL-positive stroma område kvantifisering. Ingen forskjeller ble funnet for follikler når tunel + området ble sammenlignet mellom de aktiverte og ikke-aktiverte grupper. Dette funnet tyder på at celleskader funnet i stroma fra alle gruppene var på grunn av kulturen prosessen.
Relativ genekspresjon av
PTEN
pathway
for å validere effekten av BPV (bilde) inkubasjoner på genuttrykket av
PTEN
vei, den relative uttrykk av de viktigste genene ble kvantifisert.
i friske vev, IVA protokollen indusert flere vesentlige endringer, for eksempel en redusert ganger endring (fc) av
PTEN plakater (fc = -1,21, p = 0,03) og
PI3K plakater (fc = -2.43) gener, og en overekspresjon av
AKT plakater (fc = 7,65, p = 0,015) og
FOXO3 plakater (fc = 6,78, p = 0,01) sammenlignet med kontrollene (figur 3A og 3B). Når Delta Cycle Threshold (ΔCt) ble statistisk sammenliknet mellom aktivert og kontrollprøver (tabell 2), signifikante forskjeller ble også registrert mellom
PTEN
,
PI3K Hotell og
FOXO3
genuttrykk profiler. (p = 0,01; p = 0,03 og p = 0,015, henholdsvis)
(A) fold endring av
PTEN
genet. Signifikante forskjeller ble oppnådd når ΔCt ble analysert og viste PTEN hemming produsert av BPV (bilde) på 100 mikrometer i frisk (G1
vs
. G2 p = 0,01) og i tidligere cryopreserved eggstokkene vev (G4
vs
G5 p = 0,04); (B) fold endring av
FOXO3
genet. En betydelig reduksjon ble påvist kun i den friske vevet som gjennomgikk IVA behandling når ΔCt ble analysert (G1
vs
. G2 p = 0,015).
For cryopreserved prøver, den relative uttrykk eller fold endring av
PTEN
pathway gener ble også modifisert av IVA
(PTEN
fc = -1,29,
PI3K
fc = 0,59,
Akt
fc = 2,27, p = 0,007, og
FOXO3
fc = 1,94, p = 0,008) sammenlignet med kontrollene (fig 3A og 3B). Selv om det samme uttrykket mønster ble observert statistisk signifikante forskjeller ble påvist kun for
PTEN
genet når man sammenligner ΔCt (p = 0,04).
I tillegg er en utforskende studie for genekspresjon ble utført mellom innledende tilstand prøver og deres respektive kultivert kontroll. Som S2 Tabell vist noen statistisk signifikante forskjeller ble funnet mellom kontrollgruppene sammenlignet med en sammenkoblet test.
Diskusjoner
Bruk av en IVA protokoll med en PTEN inhibitor i menneskelig kryopreserveres ovarial cortex fra kreftpasienter økte pool av levedyktige aktiverte opprinnelige follikler uten å indusere skadelige virkninger, som de oppnådde resultatene indikerer. Denne tilnærmingen representerer en stor forbedring i de første trinnene av
in vitro
vekst teknikker. Det vektlegger spesielt: de kreftpasienter som har eggstokkreft cortex er oppbevart som det eneste alternativet for FP, men for hvem direkte vev gjeninnføring er kontra [9, 10, 18];
