Abstract
Livmorkreft er den vanligste diagnosen gynekologisk kreft over hele verden; ennå svulsten mikromiljøet, spesielt fibroblastceller som omgir kreftceller, er dårlig forstått. Vi etablerte fire primærkulturer av fibroblaster fra menneskelige endometriekreft vev (kreft-assosiert fibroblaster, kafeer) ved hjelp av antistoff-konjugert magnetiske kuler isolasjon. Disse relativt homogene fibroblast kulturer uttrykkes fibroblast markører (CD90, vimentin og alpha-glatt muskulatur aktin) og hormonelle (østrogen og progesteron) reseptorer. Betinget media samlet fra kafeer induserte en doseavhengig spredning av både primærkulturer og cellelinjer av livmorkreft
in vitro plakater (175%) sammenlignet med ikke-behandlede celler, i motsetning til de fra normal livmor fibroblast celle linje (51%) (
P
0,0001). Disse effektene ble ikke observert i fibroblast kultur avledet fra benigne endometrial hyperplasi vev, noe som indikerer spesifisiteten av kafeer i å påvirke endometrial cancer celleproliferasjon. For å bestemme mekanismen bak de differensial fibroblast effekter, sammenlignet vi aktivering av PI3K /Akt og MAPK /Erk trasé i endometrial kreft celler etter behandling med normal fibroblasts- og kafeer med klimaanlegg medier. Western blot analyse viste at ekspresjon av begge fosforylerte former av Akt og Erk var signifikant nedregulert i normale fibroblaster-behandlede celler, men var oppregulert /holdt i kafeer-behandlede celler. Behandling med spesifikke hemmere LY294002 og U0126 snudd kafeer-mediert celleproliferasjon (
P
0,0001), noe som tyder på en rolle av disse banene i modulerende livmorkreft celleproliferasjon. Rapamycin, som retter seg mot et nedstrøms molekyl i PI3K veien (mTOR), også undertrykt kafeer-indusert celleproliferasjon ved å indusere apoptose. Cytokin profilering analyse viste at kafeer utskiller høye nivåer av makrofag kjemotiltrekkende protein (MCP) -1, interleukin (IL) -6, IL-8, RANTES og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) enn normale fibroblaster. Våre data tyder på at i motsetning til normale fibroblaster, kan kafeer viser en pro-tumorigen effekt på utviklingen av livmorkreft, og PI3K /Akt og MAPK /Erk signale kan representere kritiske regulatorer i hvordan livmorkreftcellene svare på deres mikromiljøet.
Citation: Subramaniam KS, Tham ST, Mohamed Z, Woo YL, Mat Adenan NA, Chung i (2013) Kreft-assosiert fibroblaster fremme spredning av livmorkreft celler. PLoS ONE 8 (7): e68923. doi: 10,1371 /journal.pone.0068923
Redaktør: John W Glod, Robert Wood Johnson Medical School, USA
mottatt: 08.02.2013; Godkjent: 03.06.2013; Publisert: 26.07.2013
Copyright: © 2013 Subramaniam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er finansiert av Universitetet Malaya stipend~~POS=HEADCOMP RG336 /11HTM (Chung), UM HIR /Mohe /mED-12 (Chung) og HIR-Mohe E-00025-20001 (Mohamed). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Endometriekreft (EF) er den sjette vanligste diagnosen kreft blant kvinner globalt, med ca 288 000 nye tilfeller og 50,327 dødsfall forekommer over hele verden hvert år [1]. Det er den vanligste gynekologiske kreftform i USA med et anslag på 47,100 nye tilfeller diagnostisert i 2012 [2]. Av betydning, har forekomsten og dødeligheten til EU vært stigende i de utviklede og utviklingsland, og er ventet å stige ytterligere med økende aldrende befolkning og forekomsten av fedme [3]. Selv om fem års overlevelse for EC er 85%, en undergruppe av endometrial svulster viser en aggressiv fenotype, preget av høy histologisk grad, regional lymphovascular invasjon og fjernmetastaser. Prognosen for slike svulster er relativt dårlig, med fem års overlevelse varierer 16-66% [4].
Om lag 90% av EU-saker er sporadisk og er klassifisert i type 1 og type 2, i henhold til deres etiologi og kliniske oppførsel [5]. Type 1 EC representerer flertallet av sporadiske tilfeller, sto for 70-80% av nye tilfeller [5]. Type 1 kreft, for det meste endometroid i histologi, er ofte lavgradige svulster med en gunstig prognose. Disse kreft ofte har PTEN, K-
ras
og beta-catenin mutasjoner og økt uttrykk av østrogen reseptor [6]. Det er foreslått at overdreven østrogeneksponering kan føre til atypisk endometrial hyperplasi (EH), en benign tilstand av proliferativ endometrial kjertel [7,8]. Videre har atypisk EH blitt sterkt assosiert med invasiv EC i opp til 62% endometriebiopsi eksemplarer, noe som tyder på at atypisk EH kan være den direkte forløperen til endometroid type 1 EC [9]. Likevel, den primære årsaken til behandlingssvikt i både type 1 og 2 livmorkreft er den fjerne spredning av primære svulster (metastase) [10]. Mekanismen som fører til denne aggressive transformasjon er ennå ikke definert. Men studier på andre krefttyper tyder på at rundt fibroblaster kan ha viktig rolle i tumorprogresjon [11,12].
I den kvinnelige skjede kan fibroblaster fremme epithelial utvikling og differensiering [13,14]. De er ansvarlige for ekstracellulære matrise ombygging og produsere parakrine vekstfaktorer som styrer cellevekst, overlevelse og død [15]. Faktisk har bidraget av kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) i progresjonen av forskjellige kreftformer er studert, for eksempel i prostatakreft [16-18], bukspyttkjertelkreft [12], hode- og nakkekreft [19] og bryst kreft [20]. I disse tumormodeller, kafeer forbedret tumor celleproliferasjon, invasjon og chemoresistance. Videre er kafeer også tenkt å ha store roller i moduler tumor angiogenese, immuncelleinfiltrasjon og metastatisk kolonisering [21-23]. Involvering av fibroblaster i utviklingen av EU, men er relativt under-undersøkt.
Karakterisering av fibroblast faktorer i livmorkreft, mens noen, er hovedsakelig fra patologiske analyser. Hepatocyte vekstfaktor og cMet uttrykk var signifikant korrelert med høyere stadier av EC, selv om det ikke var prognostisk av lavere overlevelse [24]. En annen studie observert at CXCR4 uttrykk var betydelig høyere i tumorer med muskelinfiltrasjon, en indikator på metastase [25]. Det er interessant å bruke primære kulturer fra endometriale vev, Arnold et al viste at utskillelsen fra normale endometrielle fibroblast-celler inhiberte proliferasjonen av Ishikawa-celler, en human EC-cellelinje [26]. Denne observasjonen ble også støttet av Zhao gruppe hvori de foreslått at slike anti-proliferativ effekt kan skyldes inhibering av PI3K signalering [27]. Likevel er det fortsatt ukjent om kafeer i EU vil stille ut en anti-tumor eiendom som med normale endometrial fibroblaster, eller en pro-tumor karakteristikk som med kafeer fra andre krefttyper.
Derfor, i denne studien, vi etablert flere primærkulturer av humane endometrial fibroblast celler fra EC vev, for å undersøke effektene av kafeer på EC celleproliferasjon. Vi viste videre at i motsetning til normale endometrial fibroblaster, kafeer fremmet EC celleproliferasjon, blant annet ved å modulere PI3K /Akt og MAPK /ERK signalveier. Vi testet også bruken av rapamycin, en mTOR inhibitor, som en potensiell terapeutisk middel for inhibering av kafeer-mediert celleformering. Studien gir nye bevis belyse den pro-tumorigent rollen fibroblaster i tumorigenesis av EF.
Materialer og metoder
Kjemi og reagenser
U0126 og LY294002 ble hentet fra Cell signale Technology (MA, USA), og rapamycin (sirolimus) ble kjøpt fra Clear Labs (Mumbai, India).
Etikk uttalelse
studiet ble godkjent av etisk komité Universitetet Malaya Medical Centre (Ref nr 865,19). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
Det menneskelig vev og cellelinjer
Vev fra fire livmorkreft og en hyperplasi vev ble oppnådd fra kvinner som gjennomgår kirurgi for å fjerne svulsten del av endometrium. Omtrent 1 g vev ble transportert til laboratoriet i media bestående av RPMI1640 (Life Technologies, NY, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, NY, USA) og 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies , NY, USA). Vevene ble hakket til størrelsen av 1 mm
3 og deretter spaltet med 2 mg /ml kollagenase II for EC vev og med kollagenase I for hyperplasia vev (Worthington, New Jersey, USA) i en rotator i 1 time ved 37
° C. Post fordøyelse, ble vevene vasket og dyrket i RPMI 1640 media supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin ved 37
° C. Kulturer ble opprettholdt av media endres hver 72. time og sub-dyrket etter å ha nådd konfluens. Humane endometriale kreftcellelinjer, ECC-1 (CRL-2923) og HEC-en-A (HTB 112), og udødeliggjorte normalt humant endometrialt fibroblastcellelinje, T-hESC (CRL-4003) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (Bethesda , MD, USA) og ble dyrket i media i henhold til produsentens protokoll.
isolering av primære epitelceller og stromale celler
Alle dyrkede primære celler hentet fra kirurgiske vev ble utsatt for stromal celle isolasjon ved hjelp av anti -fibroblast magnetiske mikroperler (Miltenyi Biotech, Köln, Tyskland). I korthet, 1×10
6-celler ble sentrifugert ved 300x
g
i 10 minutter. Cellepelletene ble deretter resuspendert i 100 pl buffer inneholdende en sluttkonsentrasjon på 0,5% bovint serumalbumin og 2 mM etylendiamintetraeddiksyre oppløst i pH 7,2, kalsium og magnesium fri fosfatbufret saltvann og inkubert med 20 ul av humant anti-fibroblast-mikroperler antistoffet (Miltenyi Biotec, CA, USA) for en time. Cellene ble deretter separert ved anvendelse av MiniMACS ™ celle-separator (Miltenyi Biotec, CA, USA). Isolerte celler ble deretter fortsatte å dyrkes i media som er nevnt ovenfor. Epitelceller befolkningen ble også høstet ved hjelp av lignende metode, ved hjelp av menneskelig CD326 (EpCAM) magnetiske mikro antistoff (Miltenyi Biotec, CA, USA).
Flowcytometri analyse
dyrkede celler ble trypsinert og 1×10
6 enkeltcelle-suspensjon ble blokkert med 10% normalt geiteserum (BioWest, Nuaille, Frankrike) før farging med AlexaFluor 647 (AF647) -konjugert human epitelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM) og PE-konjugert human CD90-antistoffer (Biolegend, San Diego, USA). Isotype kontroller som ble brukt var AF647 mus IgG2b, κ og PE mus IgG1, κ, henholdsvis. Farging ble deretter analysert ved hjelp av BD FACSCanto II flowcytometer og resultatene ble sett ved hjelp FACS DiVa programvare (BD Biovitenskap, California, USA).
Kvantitativ sanntid polymerase chain reaction (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved hjelp TRIzol (Invitrogen, California, USA) og en mikrogram RNA ble konvertert til cDNA ved hjelp av dynamo cDNA syntese kit (Finnzymes, Vantaa, Finland). Sekvensen for primerne anvendt for å detektere epiteliale cellemarkører (EpCAM, E-cadherin, cytokeratin 8) og fibroblast cellemarkører (alfa-glattmuskel aktin (α-SMA) og vimentin) er angitt i tabell 1. QRT-PCR ble utført ved anvendelse av ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, California, USA) i 35 sykluser ved bruk 5x HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix (Solis biodyne, Tartu, Estland), 10 pmol /ul forover og bakover primer, 10 ng /mL cDNA mal og PCR klasse H
2o. Analyser ble utført i det minste i tre eksemplarer, og de midlere verdier ble anvendt for å beregne relative ekspresjonsnivåer ved hjelp av ΔΔC (t) -metoden. Expression nivåer ble først normalisert til housekeeping GAPDH-genet. Deretter ble genekspresjon testet i epitel-celler i forhold til den tilsvarende mRNA nivået observert i en representativ fibroblast-celler (T-hESC), og på samme måte, ble de gener rapportert uttrykt i fibroblast-celler sammenlignet med deres tilsvarende mRNA-nivå i et representativt epitelceller ( ECC-1).
Gene
Grunning
Kilde
EpCAMForward5′-AATGTGTGTGCGTGGGA-3 «[79] Reverse5′-TTCAAGATTGGTAAAGCCAGT-3’E-cadherinForward5′-TTTGTACAGATGGGGTCTTGC-3» [80] Reverse5 «-CAAGCCCACTTTTCATAGTTCC-3’Cytokeratin 8Forward5′-CTGGTGGAGGACTTCAAGAAC-3′ [81] Reverse5′-GACCTCAGCAATGATGCTGTC-3’αSMAForward5»-GACGAAGCACAGAGCAAAAGAG-3 «[82] Reverse5′-TGGTGATGATGCCATGTTCTATCG-3’VimentinForward5′-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3′ [83 ] Reverse5»-GGTCATCGTGATGCTGAGAA-3’Table 1.
Grunning sekvenser
brukes for QRT-PCR.
CSV ned CSV
Utarbeidelse av fibroblast celler kondisjonerte medie
fibroblast celler var seeded og dyrket i komplett medium i 24 timer, før de blir dyrket i media inneholdende 2% FBS for de følgende 72 timer. Kondisjonert medium ble samlet inn ved hjelp Amicon ultra sentrifugale filtre (Merck Milipore, Massachusetts, USA) ved sentrifugering ved 5000X
g
4
° C i 1 time. Protein i konsentrert media ble kvantifisert ved hjelp av Bradford assay (Biorad, CA, USA).
Methyl tiazolyl tetrazolium (MTT) analyse
spredning av epitelceller ble vurdert av metyl tiazolyl tetrazolium (MTT) test. I korthet ble cellene sådd ut i fullstendig medium ved 1-3 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater. Ved 24 timer etter såing, ble cellene behandlet med enten fullstendige media, media med 2% FBS, fibroblast-kondisjonert medium og /eller inhibitorer for 72 timer. Ved slutten av behandlingen, ble 20 ul av MTT-løsning (5 mg /ml) tilsatt til hver brønn. Etter 4 timers inkubering ved 37
° C, ble 100 pl av 10% natriumdodecylsulfat tilsatt for å oppløse de formazankrystaller etter ytterligere 4 timers inkubasjon ved 37
° C. Absorbans ble målt ved hjelp av spektrometer ved 575 nm med referanse til 650 nm.
Total protein utvinning og western blotting
ECC-1-celler ble sådd ut på 1×10
4 celler /brønn i 6- brønners plater i fullstendig media. Ved 24 timer etter såing, ble cellene behandlet med enten fullstendig media, media med 2% FBS, fibroblaster-kondisjonert medium og /eller inhibitorer i 72 timer. Protein lysater ble samlet ved å skrape cellene i kald lyseringsbuffer inneholdende sluttkonsentrasjon på 0,1% Triton-X, 0,1% SDS, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 x fosfatase og 1x proteasehemmere. Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved bruk av Bradford assay (Biorad, CA, USA). Omtrent 20 ug protein ble løst i 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese før de ble overført til polyvinylidendifluorid-membran. Antistoffer som ble brukt var kanin anti-humant Akt, fosfo-Akt, Erk, fosfo-Erk og β-aktin (Cell Signaling Technology, USA). Blottene ble visualisert ved hjelp av ECL prime western blotting deteksjonsreagensen (Amersham, GE Healthcare Lifesciences, Sverige) ved hjelp av gel dokumentasjonssystem (Biospectrum 410, UVP) og Vision Works LS programvare (CA, USA)
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
De nivåer av fosforylert-Akt og fosforylert-Erk i ECC-1 celler behandlet med 1 ug /ul kondisjonert medium fra T-hESC og kafeer ble kvantifisert ved hjelp av ELISA kits (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). I korthet ble 96-brønners plater belagt med fortynnet fangst-antistoff over natten, før blokkering og inkubasjon med cellelysater i 2 timer hver. Fortynnet deteksjon-antistoff ble inkubert i 1 time før inkubering av sekundært antistoff i ytterligere 30 minutter. TMB-substrat ble deretter tilsatt til hver brønn i 15 minutter for fargeutvikling før avsluttet med STOPP-løsning. Absorbansen ble avlest ved 450 nm bølgelengde ved hjelp spektrometer (Tecan Systems, CA, USA). Dataene som vises var gjennomsnitt av minst tre replikater normalisert med avlesninger fra ECC-1-celler behandlet med medium inneholdende 2% FBS.
identifikasjon og måling av cytokinnivåer
Cytokiner utskilt av normale fibroblaster (T -HESC) og kreft-assosiert fibroblaster (kafeer av EC6, 7 og 11) ble målt ved hjelp av Raybiotech Quantibody Menneskelig cytokin Array (Raybiotech, Georgia, USA) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, ble kondisjonert medium fremstilt fra 72 timers-dyrkede fibroblaster, som beskrevet ovenfor. 100 ug protein fra hver fibroblast-sekresjon ble tilsatt til respektive matrise brønn og inkubert over natten ved 4 ° C. Hver brønn ble vasket, inkubert med rekonstituert antistoff cocktail i 2 timer ved romtemperatur, vasket igjen, før tilsetning av Cy3-konjugert streptavidin. Etter ytterligere omfattende vasking, ble fluorescens signal målt ved hjelp av Agilent High Resolution microarray Scanner (C-modell), og råsignaldata ble hentet fra TIFF-bilde med GenePixPro 6.1 før analysert med Q-Analyzer. Cytokinnivåer fra hver fibroblast-sekresjon ble sammenlignet med media inneholdende 2% FBS (kontroll). Data som er vist for hver prøve var gjennomsnittlig fluorescensintensitet fra fire matrise brønner.
Statistisk analyse
Statistisk analyse som bedømmes forskjellen mellom middel for kontroll og forsøksgruppe ble utført ved anvendelse av Students
t
-test på IBM SPSS statistikk 20. En
P
-verdi. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Isolering av kreft-assosiert fibroblast celler fra menneskelige endometriekreft vev
For å etablere primær fibroblast celler fra endometrial vev, menneskelivmorkreft (EF) vev (EC6, 7, 11 og 14) ble fordøyd med kollagenase, etterfulgt av celleisolasjon ved hjelp av magnetiske kuler konjugert med anti-fibroblast-antistoff. For EC6 og EC14, ble negativt valgte cellene deretter utsettes for anti-CD326 konjugerte magnetiske kuler for anrikning av epitel motstykke. De isolerte epiteliale og fibroblastceller ble betegnet som «Ep» og «Fib «, henholdsvis. Som vist i figur 1, var det en klar forskjell i morfologi mellom epitelceller (EC6-Ep og EC14-EP) og fibroblast celler (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib, EC14-Fib). Epitelceller utstilt rosenblad-formet morfologi og har en tendens til å vokse i kolonier, mens stromale celler vises langstrakte spindel-formet funksjoner
Hematoxylin eosin (H og E) farging av vev og fasekontrastbilder av etablerte primære celler isolert fra livmorkreft: EC6 (A), EC14 (B), EC7 (C) og EC11 (D). Forstørrelse: 100x. Deretter ble disse fordøyd med collagenase og kultivert, før epitelial og fibroblast celle isolasjon hjelp CD326 (EpCAM) og anti-fibroblast merket magnetiske kuler.
For å bestemme renheten av isolerte epiteliale og fibroblast cellekulturer , farget vi cellene med både epitel markør, Alexa Fluor 647-konjugert EpCAM og fibroblast markør, PE-konjugerte CD90 antistoffer. Human endometrial kreft adenocarcinoma cellelinje, ECC-1 viste høy ekspresjon av EpCAM (98%), mens, normalt humant endometrialt fibroblastcellelinje, T-hESC viste høy ekspresjon av CD90 (74%) (Figur 2A, D). Farging med isotype antistoff-kontroller viste minimal binding, noe som indikerer spesifisiteten av de primære antistoffer (data ikke vist). Epiteliale celler isolert fra EC6 og 14 (EC6-Ep og EC14-Ep) viste moderat ekspresjon av EpCAM (55%) uten tegn til CD90 ekspresjon, noe som indikerer at denne epitele kulturen ikke var forurenset med fibroblastceller (figur 2B, C). I motsetning til dette fibroblast celler isolert fra EC vev (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib, og EC14-Fib) var negative for EpCAM ekspresjon men sterkt positive for fibroblast markør CD90 (75-81%), noe som indikerer at de isolerte fibroblast celler var relativt rent og fritt for epitelcelle-forurensning (figur 2E-H). Alle de primære cellene som ble brukt var under passasjen 10 etter kultur, for å opprettholde den nærmeste fenotypen til de primære vev.
Strømningscytometri-analyse av primære epitelceller og fibroblast-celler isolert fra endometrial cancer vev ble utført etter merking av celler med CD326 antistoff konjugert med AlexaFluor647 og CD90 antistoff-konjugert med PE. Epitelisk endometrial cellelinje, ECC-1 (A), primære epitelceller EC6-Ep (B) og EC14-Ep (C), normal endometrial stromal-cellelinje, T-hESC (D) og primær fibroblast celler, EC6-Fib ( E), EC7-Fib (F), EC11-Fib (G) og EC14-Fib (H).
molekylær karakterisering av endometrial primærkulturer
for ytterligere å karakterisere den isolerte epiteliale og fibroblast celler, utførte vi kvantitativ RT-PCR for å bestemme ekspresjon av flere epiteliale og fibroblast-markører. Epitelial EC6-Ep og EC14-Ep-celler viste høy ekspresjon av EpCAM, cytokeratin 8 og E-cadherin, med lav ekspresjon av vimentin og α-SMA (figur 3A, B). Ekspresjonsnivået er vist ble normalisert med nivået av GAPDH. I motsetning til dette, de fire fibroblast celler isolert fra endometrial cancer vev (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib og EC14-Fib) viste økt ekspresjon av vimentin og α-SMA, med lav ekspresjon av EpCAM, E-cadherin og cytokeratin 8 (figur 3A-C). Disse data antydet at vi lyktes i å isolere relativt rene epitelceller med sine fibroblast kolleger fra endometrial kreft vev.
Total RNA ble utsatt for kvantitativ real-time PCR-analyse av epiteliale markører (EpCAM, cytokeratin 8, E -cadherin), fibroblast markører (alfa-glattmuskel aktin (αSMA), vimentin) (A-C), estrogen reseptor 1 og 2 (ER1, 2), progesteronreseptoren (PR), progestagen-assosiert endometrial protein (PAEP) og matriks-metalloproteinase-1 og 9 (MMP1, 9) (D-F). Data gjennomsnitt; feilfelt, standardavvik Viste data er representative for tre uavhengige eksperimenter.
I tillegg har vi også bestemt at både epiteliale og fibroblast celler fra EC vev uttrykte varierende grad av østrogen og progesteron reseptorer (ER1, ER2 og PR) (Figur 3D-F), i overensstemmelse med den observasjon at EC er hormon-responsive tumorer. Vi målte mRNA-ekspresjon av tre vanlige utskilte proteiner av endometriet, progestagen-forbundet endometrial protein (PAEP) og matriks-metalloproteinase-1 og 9 (MMP1, 9) i disse cellene. Som vist i figur 3D-F, ble PAEP hovedsakelig uttrykt av fibroblaster, og større MMP1 ekspresjon ble observert sammenlignet med den for MMP9 i begge epiteliale og fibroblast celler. Til sammen våre data sterkt anbefalt at disse primære epitelceller og fibroblast celler ble opprettholde sine
in vivo
fenotyper.
Differential effektene av livmor fibroblast sekresjon på endometrial kreft celler
Det hadde tidligere blitt vist at sekreter fra normale endometrial fibroblastceller ble veksthemmende på endometrial cancer cellelinje, Ishikawa-celler [26]. Konsekvent, kondisjonert medium fra normal endometrial fibroblast-T-cellelinje hESC hemmet proliferasjonen av ECC-1 og HEC-1A, på en doseavhengig måte (figur 4A, B). Ved 2 ug /ul, ble det observert en signifikant 51% og 69% veksthemming i ECC-1 og HEC-1A, respektivt. Tilsvarende primære endometrial kreft celler, EC6-Ep og EC14-Ep var også vekst hemmet av T-hESC betinget media (EC6-Ep: 60%, EC14-Ep: 67%). (Figur 4C, D)
ECC-1 (A) og HEC-1A (B) cellelinjer og EC6-Ep (C) og EC14-Ep (D) primær endometrial kreft celler ble testet med kondisjonert medium fremstilt fra kreft-assosiert fibroblaster (EC6-Fib , EC7-Fib, EC11-Fib og EC14-Fib) og normal endometrial fibroblast cellelinje (T-hESC) i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble undersøkt ved anvendelse av MTT-analysen og ble normalisert med kontroll (media inneholdende 2% FBS). Kafeer vises er gjennomsnittet av alle de fire kreft-assosiert fibroblaster testet. Data gjennomsnitt; feilfelt, standardavvik *,
P
0,005 ;. **
P
0,0001. Viste data er representative for tre uavhengige eksperimenter.
For å finne og sammenligne effekten av kafeer sekreter på livmorkreftceller, høstet vi kondisjonert medium fra 72 timer-dyrkede fibroblast celler, og deretter behandlet ECC-1 og HEC-1A menneskelige livmorkreft cellelinjer i 72 timer. Interessant, klimaanlegg media fra kreft-assosiert fibroblaster (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib og EC14-Fib) induserte en kontrastvirkning: vekster av både primære endometrial kreft celler (EC6-Ep og EC14-Ep) og de kommersielle endometrial kreft celler (ECC-1 og HEC-1A) ble markant forbedret på en doseavhengig måte (figur 4A-D). Større effekter ble sett med ECC-1 og HEC-1A cellelinjer enn i primærkulturer, EC6-Ep og EC14-Ep. Blant kafeer, EC-11-Fib demonstrerte de mest vekstfremmende effekter, alt 135% til 274% vekst sammenlignet med ubehandlede celler. Når disse individuelle CAF-effektene ble kombinert (merket som kafeer), var det en signifikant forskjell av prosent cellevekst mediert av kafeer og T-hESC ved 2 ug /ul behandling (
P
0,05) (figur 4A -D).
for å utelukke at den kafeer-vekstfremmende effekter skyldtes våre cellekultur prosedyrer, isolert vi fibroblaster fra en atypisk hyperplasi vev, en godartet endometrium tilstanden ved hjelp av lignende tilnærming. De isolerte fibroblaster (EH-Fib) viste lignende fibroblastisk morfologi
in vitro
, og uttrykt høyt nivå av CD90 (65%) (Figur 5A-C). Bruke betinget media fra disse cellene, undersøkte vi deres effekt på celleproliferasjon av både kreft cellelinjer (ECC-1 og HEC-1A) og primære epitelceller (EC6-Ep og EC14-EP). Som vist i figur 5D, gjorde EH-Fib klimaanlegg media ikke påvirke spredning av ECC-1 og HEC-1A celler. Imidlertid, når de ble testet på primære epitelceller EC6-Ep og EC14-Ep, EH-Fib inhibert vekst på en doseavhengig måte, med et gjennomsnitt på 69% ved 2 ug /ul konsentrasjon (figur 5D). Disse dataene tyder på at de vekstfremmende effekter hos kafeer er spesifikk, og ikke på grunn av valget av våre eksperimentelle fremgangsmåte.
Hematoxylin og eosin-farging (A) og fasekontrastrikt bilde (B) av fibroblastceller isolert fra human atypisk hyperplasi vev (EH-Fib); Forstørrelse, 100x. (C) Flowcytometri analyse av EH-Fib farget med epitelial markør CD326-Alexa Fluor 647 og fibroblast markør CD90-PE. (D) Celleviabilitet analysen bestemme effekten av EH-Fib kondisjonerte medier på livmorkreft cellelinjer (ECC-1 og HEC-1A) og primære epitelceller (EC6-Ep og EC14-Ep) etter 72 timers behandling. Data gjennomsnitt; feilfelt, standardavvik *,
P
0,01. Viste data er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Aktivering av PI3K /Akt og MAPK /ERK stier i kreft-assosiert fibroblast-mediert livmorkreft celleproliferasjon
For å belyse mekanismen bak den vekstfremmende effekten av kafeer sekresjon på EC, vi bestemt aktivering av PI3K /Akt og MAPK /Erk, to store overlevelses trasé innblandet i livmorkreft. I samsvar med tidligere studie [27], behandling av normal fibroblast T-hESC-kondisjonert medium markert redusert fosfo-Akt og fosfo-Erk proteinekspresjon i ECC-1-celler, som vist med Western blot og ELISA-analyser (figur 6A, B). I motsetning til dette ble fosfo-Akt proteinnivå moderat forhøyet når ECC-1-cellene ble behandlet med EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib og EC14-Fib (figur 6A, B). I tillegg, kafeer-behandlede ECC-1 celler viste også øket nivå av fosfo-Erk, sammenlignet med de som ble behandlet med kontrollmedia (figur 6A, B).
(A) Western blot-analyse av phosphorylated- Akt (Ser473) og -Erk protein uttrykk i ECC-1 celler etter behandling med enten normalt livmor fibroblast T-hESC celler eller kreftfrem assosiert fibroblast celler (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib og EC14-Fib). Densitometry analyse sammenlignet den relative ekspresjonsnivået av p-Akt og p-Erk til deres totale proteinnivå. (B) Kvantitativ analyse av fosforylert Akt-(Ser473 og Thr308) og fosforylerte-ERK nivået i ECC-1-celler etter behandling med enten T-hESC eller kafeer, sammenlignet med celler behandlet med kontroll (media inneholdende 2% FBS). ECC-1 (C) og EC6-Ep (D) celler ble behandlet med enten PI3K pathway selektiv inhibitor (LY294002) eller Erk pathway selektiv inhibitor (U0126) i nærvær av kreft-assosiert fibroblaster kondisjonert medium (1 ug /ul) for 72 timer. Data som vises er celleviabilitet etter normalisert med kontroll (media inneholder 2% FBS). Data gjennomsnitt; feilfelt, standardavvik *,
P
0,05; **
P
0,0001. Viste data er representative for to uavhengige eksperimenter.
For ytterligere å undersøke den funksjonelle rollen PI3K /Akt og MAPK /ERK stier i kafeer-medierte celleproliferasjon, ved siden behandlet vi ECC-1 og EC6-Ep celler med PI3K selektiv inhibitor (LY294002) og Erk selektiv inhibitor (U0126) i nærvær av EC6-Fib og EC11-Fib betinget media i 72 timer. Både LY294002 og U0126 betydelig redusert kafeer-mediert celle proliferasjon i disse celler (
P
0,0001) (figur 6C, D). Spesielt, forårsaket U0126 et større veksthemmende virkning i EC-celler behandlet med EC11-Fib kondisjonerte medier. Virkningene av LY294002 og U0126 i inhibering av endometrial cancer celleproliferasjon var bare tydelig i nærvær av kafeer sekresjon medier, da disse inhibitorer minimalt påvirket celleproliferasjon i kontrollmedia (figur S1). Disse hemmere også hatt lignende effekter på andre EC-celler, HEC-1A og EC14-EP (Figur S1). Disse dataene antyder at aktiveringsstatusen til PI3K /Akt og /eller MAPK /ERK trasé kan være nøkkelen punktet der fibroblaster fra både normale og kreft forhold regulere livmorkreft celleproliferasjon.
Vi vurderte videre om rapamycin, en kjent PI3K nedstrøms hemmer, kan være klinisk nyttig for å snu kafeer-mediert EC celleproliferasjon. I nærvær av EC11-Fib kondisjonerte medier, behandling av rapamycin i 72 timer effektivt hemmet ECC-1 og EC6-Ep celleproliferasjon (
P
0,0001) (fig. 7A, B). Ved høyeste dose testet (2 mm), rapamycin redusert ECC-1 celler fra 180% (betinget media behandling alene) til 40% (betinget media og rapamycin behandling) (
P
0,0001), mens minimal inhibering ble observert når cellene ble dyrket i kontrollmedium (figur 7a, b). Lignende resultat ble observert med effekten av rapamycin på andre EC-celler, HEC-1A og EC14-Ep (figur S2). Bruke annexin V merking, vi videre fastslått at rapamycin hemmet kafeer-mediert EC celleproliferasjon
via
induksjon av apoptose (figur 7C-E). Behandling av ECC-en med en ug /ul EC11-Fib betinget media i 72 timer ikke påvirke andelen av apoptotiske celler;
