Abstract
observasjon at galectin-7 (gal-7) er spesielt uttrykt i bryst korg (basale) celler bedt oss om å undersøke om dette proteinet er uttrykt i basal celler i andre vev. Gitt at brystkreft og prostatakreft har bemerkelsesverdig underliggende biologiske likheter og gitt de viktige rollene basal celler i prostata kreft, undersøkte vi uttrykket mønstre og rollen som gal-7 i human prostatakreft. Ved hjelp av vev microarray, fant vi at selv om gal-7 er lett uttrykt i basal celler i normal prostata vev, er det nedregulert i prostata kreft (PCA) celler.
De novo
uttrykk for gal-7 i prostatakreftceller øker deres følsomhet for apoptose i respons til etoposid og cisplatin. Vurderingen av en karbohydrat-gjenkjenning domene (CRD) -defective mutant form av gal-7 (R7S) viste at evnen til dette proteinet for å modulere apoptose var uavhengig av dens CRD aktivitet. Denne aktiviteten ble også uavhengig av dens evne til å translocate til mitokondrie og nukleære rom. Men CRD aktivitet var nødvendig for å hemme invasive atferd av prostata kreft celler.
In vivo
, gal-7 overekspresjon i PCA celler førte til en beskjeden, men signifikant reduksjon i tumorstørrelse, mens CRD-defekt mutant skjema betydelig økt tumorvekst sammenlignet med kontroller. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at selv om
de novo
uttrykk for gal-7 kan være en interessant måte å øke tumorigen fenotyper av PCA celler, endringer i CRD aktiviteten av dette proteinet drive en fenotypisk bryter i sin rolle i PCA celler. Dette CRD uavhengig aktivitet representerer et paradigmeskifte i vår forståelse av funksjonene til galectin. Den R74S modellen vil være nyttig å skille CRD-avhengige og CRD-uavhengige funksjoner av gal-7 i kreft progresjon
Citation. Labrie M, Vlădoiu M, Leclerc BG, Grosset AA, Gaboury L, Stagg J, et al. (2015) en mutasjon i Karbohydrat Recognition Domain Kjører en Fenotypisk Switch i rollen Galectin-7 i prostatakreft. PLoS ONE 10 (7): e0131307. doi: 10,1371 /journal.pone.0131307
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 9. januar 2015. Godkjent: 01.06.2015; Publisert: 13.07.2015
Copyright: © 2015 Labrie et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den kanadiske Institutes for Health Research (Grant No. MOP-89697) for å YSP (http: //www.cihr-irsc. gc.ca/). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Vær oppmerksom på at Yves St-Pierre er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Galectin-7 (gal-7) er en p53-indusert gen som er hovedsakelig uttrykt i stratifisert epitel-celler [1, 2]. Dens uttrykk kan også være forårsaket av andre transkripsjonsfaktorer, inkludert mutante former av p53 og CCAAT /enhancer-bindende protein beta (C /EBPβ) [3, 4]. Dens uttrykk er også regulert av epigenetiske mekanismer, inkludert DNA metylering [5, 6]. Dens rolle i UVB-indusert apoptose keratinocytt [7] og i re-epitelialisering av corneale sår [8] støtter ideen om at gal-7 er viktig for å opprettholde homeostase i epitelceller. Unsuprisingly, har en rekke studier vist at feilregulering av gal-7 uttrykk har en sterk effekt på utviklingen av flere typer kreft av epitelial opprinnelse. I mammary vev, for eksempel, gal-7 er spesielt uttrykt i korg (basal) celler, og dets overekspresjon i brystkreft vev korrelerer med resistens mot apoptose og spredning av metastaser til benet og lunge [9]. Overekspresjon av gal-7 er også assosiert med dårlig overlevelse hos pasienter med ovarialcancer [6, 10] og med malignitet hos pasienter med plateepitelkarsinom tungen [11]. Disse assosiasjoner mellom unormalt høye nivåer av gal-7 og dårlig prognose er også til stede i spiserøret og hypopharyngeal plateepitelkarsinom [12, 13]. Imidlertid, som en rekke studier har vist, gal-7, i likhet med andre galectins, spiller en dobbeltrolle i kreft, og kan ha en beskyttende rolle i visse tilfeller, særlig ved å øke følsomheten av kreftceller til pro-apoptotiske stimuli og ved å redusere cellevekst og angiogenese. Disse aktiviteter er relativt godt dokumentert i mage, urothelial og tykktarm kreft, så vel som i livmorhals plateepitel karsinom [6, 14, 15]. Faktisk er observasjoner som genetisk konstruerte cervical, mage og tykktarm kreftceller som overuttrykker gal-7 ikke klarer å indusere gastriske tumorer i xenopodet mus tyder på at epigenetiske narkotika eller gal-7-spesifikk genterapi kan brukes til å undertrykke utviklingen av spesifikke typer av kreft [6, 14, 15]. Gitt den økende popularitet av epigenetiske behandlinger for kreft, er det derfor viktig å bestemme hvorvidt gal-7 har en pro- eller anti-tumor-funksjonen i en hvilken som helst gitt type av kreft, spesielt de av epitelisk opprinnelse.
ulike roller gal-7 i kreft i epitelial opprinnelse er foreløpig uklart, og kan være forbundet med en rekke faktorer. Man må først vurdere betydningen av den subcellulære compartmentalization av gal-7, som har blitt funnet i cytosol, mitokondrie, og atom kamrene [15-17]. Gal-3, for eksempel, er i stand til å indusere resistens overfor apoptose, og denne aktiviteten er avhengig av sitt translokasjon fra cytosol til mitokondriene [18]. Hvorvidt en slik intracellulær compartimentalization er også viktig for gal-7 for å regulere apoptose er ukjent. Alternativt kan den doble rolle gal-7 avhenge av dets bindingspartnere, fordi det er velkjent å binde glykosylerte proteiner via dets karbohydrat-gjenkjenning domene (CRD). Det er økende indikasjoner imidlertid at galectins også samhandle med ikke-glykosylert proteiner i en CRD-uavhengig måte [19]. Denne observasjonen er godt dokumentert for intracellulære galectins. Den viktigste funksjonen av intracellulære galectins kan være deres evne til direkte å binde BCL-2 familiemedlemmer via en CRD-uavhengig interaksjon. Denne aktiviteten har blitt vist i mange galectins, herunder gal-7 [16]. Den galectin /Bcl-2 interaksjon forskyver balansen mellom aktivitet mellom pro- og anti-apoptotiske medlemmer av Bcl-2-familien for å regulere apoptose [16, 20, 21]. Andre CRD-uavhengige funksjoner av galectins inkludere RNA prosessering i kjernen [22] og regulering av cellesyklusutvikling [23]. Alle disse CRD-uavhengig funksjon er avhengig av protein-protein interaksjoner. Faktisk er visse galectins som gal-10, havne markert lave affinitet for galaktosider og antas å virke hovedsakelig gjennom andre faktorer [24]. Disse CRD uavhengige funksjoner representerer et paradigmeskifte i vår forståelse av galectin funksjon og i utviklingen av galectin-spesifikke hemmere.
observasjon at gal-7 er spesielt uttrykt i epitelceller, spesielt i brystkorg (basal ) celler (men ikke i luminal celler), bedt oss om å undersøke om det er uttrykt i basal celler i andre vev. Gitt at brystkreft og prostatakreft har bemerkelsesverdig underliggende biologiske likheter [25] og gitt den viktige rollen basal celler i prostata kreft [26], vi studerte uttrykket mønster og rolle gal-7 i human prostatakreft.
Materiale og metode
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og dyr
PC3 [27] og DU-145 [28] cellelinjer var en generøs gave fra Dr. Benoit Ochietti (McGill University, Montreal, QC) , og LNCaP celler [29] var velvillig gitt av Dr. Thomas Sandersons (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC. Den HaCaT cellelinje [30] ble gitt av Dr. Thierry Magnaldo (Génétique ET Physiopathologie des kreft Épidermiques, Faculté de Médecine, Nice, Frankrike). Alle cellelinjene anvendt i denne studien ble opprinnelig erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). de DU-145 og HaCaT-cellelinjer ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium . De PC3 og LNCaP-cellelinjer ble opprettholdt i en F-12K næringsblanding og RPMI 1640 medium, respektivt. Kulturmedier ble supplert med 10% (v /v] bovint føtalt, 2 mmol /l L-glutamin, 10 mmol /l HEPES-buffer, og 1 mmol /l natrium-pyruvat. Alle cellekulturprodukter ble anskaffet fra Life Technologies (Burlington , ON, Canada). NOD /SCID mus ble hentet fra The Jackson Laboratory. Dyrene ble plassert under sterile forhold med
ad libitum
tilgang til mat og vann. Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komiteen av Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal
Immunohistochemistry
tissue microarrays ble brukt til å analysere 32 vevsprøver av prostata adenokarsinom, 20 hyperplasi, 5 saccular ectasia og tre kreft -adjacent normale prostata vev (US Biomaks, Rockville, MD, USA og Life biovitenskap, Seattle, WA, USA). farging reaksjoner for gal-7 ble utført ved hjelp av en Discovery XT automatisert immunostainer (Ventana Medical Systems). Deparaffinized seksjoner ble inkubert i celle kondisjone oppløsning, pH 8,0 (Ventana Medical Systems), for antigen gjenfinning og deretter farget i 60 minutter med et anti-humant gal-7 polyklonalt antistoff (R R Epitomics, Burlingame, CA, USA), et muse-anti-β-aktin (1: 20000; Sigma-Aldrich), et kanin anti-COX IV (1: 1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), en kanin anti-tubulin (1: 1000, Cell Signaling Technology) eller en mus anti-Lamin A /C (1: 1000, Cell Signaling Technology) antistoff. Sekundære antistoffer inkludert pepperrotperoksidase-konjugert esel anti-kanin (GE Healthcare, Baie-d’Urfe, QC, Canada), esel anti-geit (R imidlertid mRNA ble uttrykt ved en lav, men detekterbart nivå i PC3-celler (figur 1). Samlet utgjør disse resultatene viste at selv om gal-7 er lett uttrykt i basal celler innenfor normal prostata vev, er det helt fraværende i prostatakreftceller.
Immunhistokjemisk (IHC) farging av gal-7 i 3-mikrometer tykke seksjoner av formalinfiksert parafininnstøpte (A) sunt vev og prostata (B) vev i forbindelse med patologiske forstyrrelser av prostata. (C) Semi-kvantitativ RT-PCR og (D) Western blot analyse av gal-7-ekspresjon i DU-145, PC3 og LNCaP human prostatacancercellelinjer. Den HaCaT keratinocytt-cellelinjen ble brukt som en positiv kontroll. GAPDH og β-tubulin ble brukt som laste kontroller. LC: luminal celler, BC: basal celler, og ECM. Ekstracellulære matrise
Produksjon og karakterisering av villtype og CRD-defekt gal-7 protein
For å undersøke funksjonene av gal-7 i prostatakreftceller og for å bestemme betydningen av dens CRD, genererte vi en serie av stabile transfektanter som uttrykker vill-type gal-7 og en mutert form (R74S) av proteinet (figur 2A). Denne mutasjonen er kjent for å hemme evnen til gal-7 til å binde laktose og for å redusere dens translokasjon fra cytosol til mitokondriene og /eller kjernen [17]. Vår forrige analyse ved hjelp av løsningen NMR spektroskopi viste at R74S mutasjon indusert bare begrensede og lokale endringer i gal-7 folding. For å kunne fastslå i hvilken grad det CRD av gal-7 er avbrutt av R74S mutasjon, sammenlignet vi sine bindingsegenskaper til de av vill-type gal-7 ved hjelp av en CFG glykan array (versjon 5.2) [31]. Hele listen over glykaner testet og resultatene av bindingsanalyser kan bli funnet på nettet (https://functionalglycomics.org/). Våre resultater bekrefter at R74S mutasjon trykkes CRD aktivitet uavhengig av sukker motivene vurderes (figur 2B, S1 tabell). Denne undertrykkelse av CRD-aktivitet ble bekreftet ved strømningscytometrisk analyse av bindingen av FITC-merket rekombinant gal-7
wt og gal-7
R74S på overflatene av DU-145 prostatakreftceller (figur 2C og 2D) . Samlet utgjør disse resultatene viser at R74S opphever CRD aktivitet av human gal-7.
(A) 3D-visning av gal-7
wt og gal-7
R74S grafiske avdelinger i nærvær laktose. (B) En glykan matrisen ble anvendt for å bekrefte binding av gal-7
wt og gal-7
R74S til et stort utvalg av sukkere. Grafen viser binding av gal-7
wt og gal-7
R74S til sukker. Bare RFUs større enn 10 000 blir presentert. Sukker navnene er oppført i S1 tabell. Feilstolpene representerer SDS (n = 6). Flowcytometri analyse som viser binding av gal-7
wt og gal-7
R74S til overflatene av DU-145 celler (C) i fravær eller (D) nærvær av 0,1 M β-laktose. Bindingsanalyser ble utført ved bruk av de angitte konsentrasjonene av FITC-merket rekombinant gal-7. MFI: gjennomsnittlig fluorescensintensitet. Resultatene representerer tre uavhengige eksperimenter.
Karakterisering av intracellulær lokalisering av villtype gal-7 og gal-7
R74S
For å undersøke hvilken rolle gal-7 og sin CRD i prostatakreft, DU-145 transfektanter som uttrykker enten gal-7
wt eller gal-7
R74S ble generert. Kontroll transfektanter (generert ved hjelp av tomme ekspresjonsvektorer) uttrykte ikke påvisbare nivåer av gal-7 (fig 3A og 3B). Immunoblotting av mitokondrielle og nukleære beriket fraksjoner viste påvisbare uttrykk for gal-7
vekt i cytosol, mitokondrier og kjerner av DU-145 celler (figur 3C og 3D). I motsetning til dette var det ingen påvisbar ekspresjon av gal-7 i mitokondriene av transfektanter som uttrykker gal-7
R74S. Begge proteiner ble funnet i det ekstracellulære mediet til cellene (figur 3E). Elektronmikroskopi-analyse av DU-145-celler bekreftes ekspresjonen av gal-7
wt i cytosol, kjernen, og mitokondrielle ytre membran, mens ekspresjonen av gal-7
R74S var begrenset til cytosol (S1 Fig ). Interessant, elektronmikroskopi analyse viste tilstedeværelse av gal-7
vekt- og gal-7
R74S rike fremspring på cytoplasmamembranen (S1 figur) i samsvar med tidligere rapporter tyder på at gal-7 forbinder med aktin cytoskjelett for å regulere celle motilitet [10, 32, 33].
(A) Western blot-analyse som viser ekspresjonen av gal-7 i forskjellige stabile DU-145-kloner transfektert med ekspresjonsvektorer som koder for villtype og mutert gal -7. Kontroller er inkludert celler transfektert med tom SRa vektorer. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) Confocal avbildning som viser den intracellulære fordeling av gal-7 i DU-145 transfektanter. (C-D) Western blot analyse viser gal-7 uttrykk i cytosol, kjernekraft og mitokondrielle fraksjoner fremstilt av DU-145 celler. β-tubulin, ble COX IV og Lamin A /C brukes som cytosolic, mitokondrie og kjernefysiske markører, henholdsvis. (E) Western blot analyse som viser sekresjon av gal-7 i den ekstracellulære media av DU-145 celler uttrykker gal-7
wt eller gal-7
R74S. p-tubulin ekspresjon ble overvåket for å utelukke muligheten for cellelysering. Intracellulære proteinekstrakter fra kontroll DU-145 celle og HaCaT-cellesupernatanter ble anvendt som positive kontroller for β-tubulin ekspresjon og gal-7 sekresjon, respektivt. Alle resultater representerer tre uavhengige eksperimenter, inkludert minst to uavhengige DU-145 kloner.
Gal-7 fremmer apoptose i prostatakreftceller
Flere studier har rapportert at ektopisk uttrykk for gal-7 gjengir cervical, mage og tykktarm kreft celler mer følsomme for apoptose indusert av pro-apoptotiske legemidler [15]. For å bestemme hvorvidt dette funn er også til stede i prostatakreftceller, ble DU-145-transfektanter ble behandlet med økende doser av pro-apoptotiske medikamenter og analysert for spaltning av PARP-1, som er et vanlig brukt markør av apoptose [34]. Våre resultater viste at ektopisk ekspresjon av gal-7 øket spaltning av PARP-1 indusert av etoposid i forhold til kontrollcellene (fig 4a). Lignende resultater ble oppnådd når fragmentering av kjerner i apoptotiske celler ble visualisert med DAPI farging (figur 4B). Evnen av gal-7 for å øke følsomheten av DU-145-celler i apoptose ble også observert ved anvendelse av cisplatin som et pro-apoptotiske medikament (figur 4C). Interessant, gal-7
R74S var like effektiv som gal-7
vekt på å øke følsomheten for DU-145 til både pro-apoptotiske legemidler. I begge tilfeller er den intracellulære lokalisering av gal-7 forble uendret i løpet av induksjon av apoptose (S2 Fig). Ved hjelp av en (
3H] -tymidin-inkorporering assay vi også målt spredning av transfektanter i fravær eller nærvær av cisplatin. Vi fant at både gal-7
vekt- og gal-7
R74S-uttrykk DU-145-celler proliferert samme satser sammenlignet med kontrollceller under normale forhold, men proliferert mer langsomt i nærvær av cisplatin (figur 4D), som er i samsvar med muligheten av gal-7 for å fremme medikamentindusert apoptose. Tatt sammen, disse resultatene viser at gal-7 sensitizes DU-145-celler til pro-apoptotiske midler som er uavhengige av dets CRD aktivitet og dens intracellulære oppdeling i seksjoner.
(A) cellene ble inkubert i 16 timer med de angitte konsentrasjoner av etoposid og testet for apoptose ved å måle PARP-1-spaltningssetet ved western blot. (B) Apoptose ble bekreftet ved å telle antall celler med en fragmentert kjerne visualisert med DAPI farging. (C) Analyse av PARP-1-spaltningssetet i DU-145-celler ble behandlet i 16 timer med den angitte konsentrasjon av cisplatin. (D) celle proliferasjon av DU-145-celler behandlet med eller uten 5 uM cisplatin målt ved (
3H] -tymidin-inkorporering. Alle resultater representerer tre uavhengige eksperimenter, inkludert minst to uavhengige DU-145-kloner. * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, og *** P ≤ 0.001.
Gal-7, men ikke R74S reduserer invasive atferd av DU-145 celler
neste undersøkt om gal-7 kan modulere invasive atferd av dU-145 celler ved hjelp av en standard
in vitro
Matrigel invasjonen assay. Vi fant at ektopisk uttrykk for gal-7
WT betydelig redusert de invasive atferd av DU-145 celler sammenlignet med kontrollceller mangler gal-7 (figur 5A). En lignende forskjell ble ikke observert for DU-145 celler som uttrykker gal-7
R74S. Fordi celle invasive atferd kan bli påvirket av cellemotilitet, brukte vi levende celle bildebehandling for å måle celle bevegelser under en ripe sårtilheling analysen (figur 5B). Våre resultater viste at DU-145 celler uttrykker gal-7
WT betydelig redusert celle hastighet sammenlignet med kontrollceller mangler gal-7 eller celler som uttrykker gal-7
R74S (Fig 5C). Disse gal-7
wt-uttrykke celler også hadde lavere akkumulert og Euklidske avstander på migrasjon (figur 5D og 5E). Retningen av DU-145 celler ble ikke påvirket av uttrykk for gal-7
wt eller gal-7
R74S proteiner (Fig 5F). Bruken av en standard skrape sårtilheling analyse bekreftet videre at gal-7
wt redusert cellen motilitet av DU-145-celler. Igjen, en lignende effekt ble ikke observert for gal-7
R74S mutant (S3 Fig).
