Abstract
Bakgrunn
Spontan eggstokkreft i høns ligner menneskelige svulster både histologisk og biokjemisk. Målet var å finne ut om det er forskjeller i lymfocytter innhold mellom normale eggstokker og ovarietumorer i kyllinger som grunnlag for videre studier for å forstå hvilken rolle immunitet i human kreft progresjon eggstokkreft.
Metoder
Høner ble valgt ved hjelp av gråtoner og fargedoppler ultralyd for å finne ut om de hadde normal eller svulst morfologi. Celler ble isolert fra eggstokkene (n = 6 høner) og lymfocytt-tall ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av antistoffer mot aviær CD4 og CD8 T og B (Bu1a) celler. Eggstokk seksjoner fra et annet sett med høner (n = 26) ble vurdert til å kontrollere tumor type og stadium og å telle CD4, CD8 og Bu1a immunostained celler ved morfometrisk analyse.
Resultater
T og B celler var mer tallrike i ovarietumorer enn i normale eggstokker ved flowcytometri og immunhistokjemi. Det var færre CD4 + celler enn CD8 + og Bu1a + celler i normale eggstokkene eller ovarietumorer. CD8 + -celler var den dominerende T-celle-undertypen i både ovarial stroma og i eggstokkfollikler sammenlignet med CD4 + celler. Bu1a + celler ble konsekvent funnet i stroma av normale eggstokker og ovarietumorer men var ikke forbundet med follikler. Antallet av immunceller var høyest i sent stadium serøs svulster i forhold til endometrioid og mucinkjertler svulster.
Konklusjoner
Resultatene tyder på at lik menneskets eggstokkreft det er relativt mer immunceller i kylling eggstokk svulster enn i normale eggstokker, og den høyeste immuncelleinnhold forekommer i serøs svulster. Dermed denne studien etablerer et grunnlag for videre studier av tumorimmunresponser i en spontan modell for eggstokkreft som vil legge til rette for studier av rollen immunitet tidlig eggstokkreft progresjon og bruk av høne i prekliniske vaksineforsøk.
Citation: Bradaric MJ, Penumatsa K, Barua A, Edassery SL, Yu Y, Abramowicz JS, et al. (2013) immunceller i Normal eggstokk og Spontan ovarietumorer i Legging Hen (
Gallus domesticus
) Modell of Human eggstokkreft. PLoS ONE 8 (9): e74147. doi: 10,1371 /journal.pone.0074147
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 22 mars 2013; Akseptert: 26. juli 2013, Publisert: 09.09.2013
Copyright: © 2013 Bradaric et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av NIH R01AI055060 (JL), DOD OC073325 (JL), den Segal Foundation (JL) og forebygge kreft Foundation (AB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Bakgrunn
Flere elementer er involvert i utvikling og progresjon av kreft inkludert genetisk, epigenetisk, miljø og immunologiske faktorer [1], [2]. Selv om det er klart at immuniteten har en viktig rolle i kreft, og at styring av immunresponser mot tumorer har betydelig potensial for kreft forebygging og behandling, blir immunresponsen på tumorer ikke godt forstått. En høyere tumor innhold av CD3 + T-celler [3] eller CD8 + cytotoksiske T-celler [4] i sent stadium tumorer er forbundet med en bedre prognose for ovarian kreftpasienter, mens en høyere relative innhold av T regulatoriske celler er assosiert med en dårligere prognose [5 ], noe som tyder på antall og typer immunceller er viktige for kliniske utfall. Nyere bevis tyder på at CD20 + B-celler er funnet i både tidlig og sent stadium ovarietumorer og at høyere tall kan være relatert til bedre fem år overlevelse [6]. Men det er motstridende data for den rolle immunitet i tumor forebyggelse eller progresjon, og det har blitt foreslått at den funksjonelle rolle av immunitet endringer i løpet av tumorprogresjon [7].
ovarian cancer blir vanligvis diagnostisert i fremskredne stadier og har en høy grad av tilbakefall og dødelighet siden det finnes ingen standard tidlige deteksjonsmetoder. Fordi tidlig stadium eggstokkreft er vanskelig å oppdage, de fleste studier bruk sent stadium prøver og det er dermed forholdsvis lite informasjon om immunitet i initiering og progresjon av tidlig eggstokkreft. De tidlige stadier av eggstokkreft er lettere studert i dyremodeller og disse modellene representerer en alternativ tilnærming for å belyse tumor etiologi og rollen av immunitet i eggstokkreft. Videre utvikling av prekliniske modeller av eggstokkreft er nødvendig for å legge til rette for utvikling og testing av vaksiner for å behandle kreft i eggstokkene.
Det finnes en rekke gnagermodeller på eggstokkreft basert på genmodifiserte eller kjemisk indusert svulster eller på implantasjon av humane tumorer i SCID (alvorlig kombinert immunsvikt) eller RAG (rekombinasjon aktiverer genet) mangelfull mus [8]. Men de fleste gnagermodeller ikke utvikle eggstokkreft spontant og de som ikke gjør ofte produsere bare en histotype [8], [9], [10], [11], [12]. Selv om disse modellene er nyttige for innsikt i genetiske og miljømessige faktorer som bidrar til kreft og til utvikling av chemo-terapeutiske strategier, de er mindre egnet for undersøkelse av tidlige spontan hendelser knyttet til tumorimmunologi, fordi det er ikke klart om de gjennomgår den samme naturlige eller spontane hendelser som fører til ovarietumorer.
legging høne (
Gallus domesticus
) fyller dette gapet siden det spontant utvikler progressive ovarietumorer med senere stadium metastaser og produksjon av ascites [13]. Vi og andre rapporterte at legging høne er en gyldig modell for studiet av human eggstokk-kreft [14], [15], [16], [17], [18]. Spontane ovarietumorer i høne deler mange trekk ved menneskelig eggstokkreft. Den histologi og morfologi av høne og menneske ovarietumorer er like; høne svulster ofte har serøs, endometrioid, klarcellet og mucinous histologi kan sammenlignes med de hyppige epiteliale subtyper av menneskelig eggstokkreft [14]. Vi viste tidligere at ovarietumorer i verpehøner kan også påvises ved transvaginal ultralyd hjelp av type utstyr som vanligvis brukes i klinikker [19], [20]. Når det kombineres med kontrastmidler [21], var vi i stand til å fremme scenen der ovarian tumor angiogenese og små mikroskopiske kreft foci ble oppdaget. Dermed ikke-invasive metoder for å velge høner for studier og for overvåking av tumorprogresjon er tilgjengelige. Videre er naturlig forekommende genetiske mutasjoner som for eksempel p53, RAS og Her2 /neu blir funnet i høne tumorer [22], [23], [24]. Likeledes er det en voksende liste av proteiner uttrykt i kylling ovarietumorer som CA125 [25], mesothelin [26], COX-1 [27], [28], selen Binding Protein 1 [29], E-cadherin [30] og VEGF som er tilsvarende forandret i humane ovarietumorer [17], [20], [31]. Det er også påfallende at aspirin [32] og eksogene progesteron [33] delvis redusere ovarietumorer ligner på mennesker. Eggstokkreft i hønse har mange av de fasetter av menneskelig sykdom, og derfor er en gyldig modell.
legging høne modellen er spesielt egnet for studier av eggstokkreft og immunitet. Høna er kjent for nyskapende bidrag til vår forståelse av immunologi inkludert den første bevis for ulike linjene for T- og B-lymfocytter [34]. I eggstokken, er det en økning i hårsekken forbundet T-celler, makrofager og B-celler i løpet av ovarial modning og deretter en reduksjon med aldring [35], [36], [37], [38]. I tillegg serum hos høner med ovarietumorer inneholder anti-ovarier og anti-tumor-antistoffer [39] lik kvinner [40], [41], [42]. Dermed blir liggende høne modellen representerer en mulig modell for å studere immunitet og tidlig stadium eggstokkreft.
Imidlertid typer og innhold av immunceller i høner med ovarietumorer og endringer i forhold til normale eggstokkene er ukjent. Derfor er målet med denne tverrsnittsstudie var å beskrive og kvantifisere T- og B-celler assosiert med ovarietumorer i legging høne for å etablere et grunnlag for studier av mekanismer for immunitet i menneskelig eggstokkreft.
Materialer og metoder
Animal Care og utvalgs
Hvite Leghorn høner (3 år, stamme W96) ble plassert ved University of Illinois i Urbana-Champaign fjærfe gård i Department of Animal Science . Mat og vann ble gitt
ad libitum Hotell og høner ble opprettholdt på et 17:7 timer (lys: mørke) tidsplan. Ovarian morfologi og angiogenese ble evaluert ved hjelp av transvaginal ultralydundersøkelse som beskrevet tidligere [19] og dataene ble brukt til å velge høner med normale eggstokker eller ovarietumorer. For flowcytometri, ble celler fra hele eggstokken forberedt uten ytterligere histologisk evaluering. For immunhistokjemiske studier ble høner på samme måte valgt. Normal eller tumorhistologi og tumorstadium ble verifisert og tumortype ble bestemt ved hjelp av Hematoxylin og eosin (H E) farget deler av eggstokk som beskrevet tidligere [14]. Denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komiteer ved Rush University Medical Center (nummer 08-011) og University of Illinois (nummer 05147).
flowcytometrisystemer
Flowcytometri var brukes til å fenotype lymfocytter i høne ovarier (n = 6) og milt (n = 2). T-celler ble detektert med CD4-FITC og CD8-PE (Southern Biotech, Birmingham, AL) og B-celler ble detektert med anti-Bu1a (Abcam, Cambridge, MA) konjugert til allofykocyanin (APC) (Zenon merking system, Invitrogen, Carlsbad CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Ovarian lymfocytter ble påvist ved anvendelse av enkelt-trinns flowcytometri [43]. Positive kontroller består av lymfocytter fra milter og negative kontroller inkludert substitusjon av antistoffer av samme isotype for primære antistoffer (data ikke vist). Det totale antall av immunceller ble deretter beregnet fra den flowcytometri data og de totale celletellinger ble oppnådd fra vev-ekstrakt.
Hele eggstokkene ble skåret i 2-3 cm biter, og cellene ble frigitt ved enzymatisk fordøyelse ved hjelp kollagenase (2000 IU /1 g vev, Worthington, Lakewood, NJ), DNase (200 mikrogram, Stemcell Technologies, Vancouver, BC), og DMEM /F12 media (Invitrogen, Carlsbad, California) (40 ° C, 2 timer med risting). Rørene ble sentrifugert (100 x g, 5 minutter). Cellepelleten ble suspendert i kald fosfatbuffret saltoppløsning (PBS) inneholdende 1 mM EDTA (1 ml, 2 minutter), sentrifugert (100 x g, 5 minutter) og pelleten suspendert i 10 ml Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) inneholdende 2 % føtalt bovint serum (FBS). Celler ble tellet med en Coulter-teller innstilt på 5-11 mikron. Celler (6 × 10
6) ble merket og faste i 2% paraformaldehyde og 5 × 10
5 celler /prøven ble analysert ved hjelp av en FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, California). Data ble analysert med Cellquest en programvare (BD Biosciences, San Jose, California).
Tissue Forberedelse til Histologi og Immunohistochemistry
Eggstokkene ble fiksert i 10% PBS-bufret formalin og innstøpt i parafin. H E farget deler av eggstokk ble analysert ved et bord-sertifisert patolog ved Rush University for tumortype og scene basert på likheter til menneskelig morfologi som beskrevet tidligere [14]
En del av hver eggstokk ble også innebygd. i oktober forbindelse (Tissue Tek, Sakura, Torrence, CA), hurtigfrosset på tørris-avkjølt metanol og lagret ved -80 ° C. Tjuefire timer før seksjonering på en Leicha cryostat, ble vev brakt til -20 ° C og levd opp til et metall scenen med oktober embedding sammensatte. Vevene ble seksjonert (10 um), fiksert i kald aceton (4 ° C, 20 min), luft-tørket ved romtemperatur (30 minutter) og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Immunhistokjemi
immunceller ble detektert med antistoffer mot markører for høne CD4 T-celler, CD8 T-celler (Southern Biotech, Birmingham, AL) og B-celler (Bu1a /chB6) (Abcam, Cambridge, MA). Snittene ble immunostained bruker et kit med diaminobenzidine (DAB) som et substrat (Vector Labs, Burlingame, CA). Snittene ble vasket (15 minutter), kontra med Hematoxylin (Fisher Scientific, Rockford, IL), dehydrert, anvendt på lysbilder og tørket (37 ° C, 16 timer). Mikroskopi ble utført på en Nikon Microphot FXA mikroskop.
Morfometrisk Analyse av immunceller
Eggstokk seksjonene ble farget med antistoffer mot CD4, CD8, og Bu1a og ble undersøkt ved hjelp av et lysmikroskop (Olympus BX -41, Olympus America Inc., Center Valley, PA). Immunopositive celler ble telt ved hjelp MicroSuite Fem programvare (Olympus America Inc.). Kort fortalt ble minst tre seksjoner fra hver eggstokk fra tjueseks høner telles per immuncellemarkør (CD4, CD8 og Bu1a) for totalt 243 lysbilder (3 lysbilder × 27 eggstokkene × 3 markører).
Totalt immunceller ble telt i hver seksjon. For hver seksjon, ble 5 til 20 tilfeldige områder telles ved en forstørrelse på 20x (eller 84 000 um
2), avhengig av størrelsen på prøven. Celletall ble midlet for hver seksjon for å normalisere data siden et annet antall felter ble tellet i forskjellige størrelse seksjoner. Tre seksjoner ble i gjennomsnitt for hver høne for hver markør. Verdiene for hver gruppe (normal, tidlige og sene svulster) ble i gjennomsnitt, og deretter uttrykt som gjennomsnittlig antall celler i 8,4 × 10
4 mikrometer
2 av eggstokkvev. Gruppebetegnelser (normal, tidlig og sent stadium av kreft) var basert på histologisk vurdering av H . E fargede seksjoner følgende tidligere definert staging for høne eggstokkreft [14]
I tillegg er antallet celler i follikler de samme delene ble talt og uttrykt som antall av immunceller per 2 x 10
5 um
2 av follikkelstimulerende hormon område. Immunceller i atretic (døende) follikler [44] ble unngått fordi de er kjent for å inneholde en tilstrømning av lymfocytter antagelig svar på apoptose [45], [46].
Statistiske analyser
statistiske tester ble utført ved anvendelse av SPSS (Chicago, IL). Mann Whitney U test ble benyttet for å bestemme om gjennomsnittsdifferanser var signifikante med p 0,5 betraktet som signifikant
Resultater
Hen Utvalg og Ovarian morfologi
Høner ble valgt inn i grupper. med og uten ovarietumorer basert på farge Doppler ultralyd og grov morfologi eggstokken. Som beskrevet tidligere, normale eggstokker inneholde flere u-follikler (figur 1A og 1D) og diskrete blodkar (figur 1A) i stroma som omgir eggstokkfollikler. I tidlig stadium eggstokkreft, inneholder eggstokk færre utviklings follikler, og flere blodårer enn i normale eggstokker (Figur 1B og 1E). I sent stadium eggstokkreft, en fast masse med ascites er tydelig, og det er ingen utvikling av follikler (figur 1C og 1F).
En normal ovarie (A og D) med modning av follikler (F1, F2) og stromal blodkar (piler) med normal brutto morfologi viser modning (F1, F2) follikler. Et eksempel på en unormal eggstokk (B og E) som inneholder flere blodkar (piler) enn i den normale eggstokk, ingen detekterbare store, modne follikler og en liten fast vev masse (sirkel) i eggstokken. Et eksempel på et sent stadium eggstokkreft (C), karakterisert ved en stor, fast masse med økt blodstrøm (piler) og rikelig ascites (*). Brutto morfologi (F) bekreftet tilstedeværelsen av flere faste masser og tumormetastasering til andre organer. Forkortelser: CT = cecal mandel; F1-F2 = store preovulatory follikler; GI = mage-tarmkanalen; OV = eggstokk; S = eggstokkene stroma; SM = solid vev masse i eggstokken; SP = milt; UOD = øvre oviduct; UT = livmor.
Lokalisering av lymfocytter i Normal Eggstokk, Early Stage og Late Stage ovarietumorer
CD4 + T-celler ble observert i løpet av de intraspinal lag av follikler i normale eggstokker (figur 2 ), men ikke i granulosa celle- eller oocytt kamrene follikler. CD4 + T-celler fant sted over hele den normale eggstokk, som forekommer sporadisk i stroma og tilstøtende til follikler, inne atretic follikler (ikke vist) og i nærheten av blodkar. I tumorholdige eggstokker, CD4 + T-celler skjedde i stroma av både tidlig stadium (figur 3) og sent stadium ovarietumorer (figur 4), og var mindre hyppig enn både CD8 + eller Bu1a + -celler. I motsetning til CD8 + T-celler og Bu1a + B-celler, CD4 + T-celler var i nærheten av, men ikke innenfor, tidlige tumorlesjoner (figur 3). CD8 + T-celler ble likeledes lokalisert i normale follikler og i stroma nær follikler (figur 2). CD8 + T-celler ble funnet i tidlige og sene stadium tumorer (figurene 3 og 4). Mens B (Bu1a +) og T-celler ble likeledes fordelt i det ovarian stroma, ble Bu1a + farging sjelden finnes i folliklene (figur 2).
Bu1a +, CD4 + og CD8 + celler (piler) som detekteres av immunhistokjemi i normale eggstokkene hos ovarial stroma (S), ved siden av follikler (f), i intraspinal lag av follikler (dobbel pil) og var rikelig i cellelaget under eggstokkene overflaten epitel (SE). Original forstørrelse, 10x; skala bar = 100 mikrometer. Utvalgte områder (stiplede bokser) er vist i en innsatt ved høyere forstørrelse for Bu1a og CD8 flekker; innfelt skala barer = 10 mikrometer.
Bu1a +, CD4 + og CD8 + celler er vist i lignende områder av seriesnitt som inneholder svulsten foci. Flere CD8 + T-celler og B-celler er til stede i tumoren foci enn CD4 + T-celler. (A) Tidlig stadium tumor viser CD4 + celler i en tumor med dårlig differensiert (PD) struktur, og CD8 + og B-celler i en tilstøtende godt differensiert (WD) område. (B) En liten lesjon (stiplet sirkel) som inneholdt CD8 + T-celler og Bu1a + -celler, men ikke CD4 + celler. (C) Et område med neoplastiske celler som inneholder CD8 + og Bu1a + celler, men ikke CD4 + celler. Original forstørrelse, 10x; skala bar = 100 mikrometer. Farget CD8 + lymfocytter i et valgt område (stiplet boks) er vist i et innsatt ved høyere forstørrelse; skala bar = 10 mikrometer.
Lignende regioner av tre krefttyper er vist i seriesnitt farget for Bu1a, CD4 og CD8.
Øverste linje:
Et eksempel på seksjoner fra en serøs ovarial tumor viser noen CD4 + celler i svulsten i forhold til Bu1a + og CD8 + celler.
Middle Row:
Et eksempel fra en mucinous ovarial tumor viser forekomster av Bu1a +, CD4 + og CD8 + celler mellom kjertler og hele svulsten.
Nederste linje:
Et eksempel på en endometrioid ovarial tumor viser Bu1a +, CD4 + og CD8 + celler. Original forstørrelse, 10x; skala bar = 100 mikrometer. Stained CD8 + og CD4 + lymfocytter i utvalgte områder (stiplede bokser) er vist i innfellinger på høyere forstørrelse; skala bar = 10 mikrometer.
kvantitativ vurdering av antallet immunceller i Normal Eggstokk, Early Stage og Late Stage ovarietumorer
I innledende forsøk, det totale antallet T og B-celler isolert fra hele eggstokk ble bestemt ved flow-cytometri. En representativ flowcytometri spredningsdiagram viser størrelsesfordelingen av celler fra en normal eggstokk uten en svulst (figur 5A) med en port på den lymfocytt region (R1). De tilsvarende representative prikkplotter for hver fluorescerende etiketten er også vist (figur 5B). Selv om det syntes å være færre CD4 + T-celler i ovarietumorer sammenlignet med normale eggstokkene (figur 5C), var det også en signifikant variasjon i CD4 + celleinnhold mellom høner, noe som sannsynligvis skyldes variasjoner i hårsekken innhold og tumorstadium, som vist i celle teller innhentet ved hjelp morfometri. En begrensning ved flowcytometri er at hele eggstokk anvendes for å fremstille lymfocytter og således plasseringen av immunceller i forhold til tumorer eller follikler kan ikke vurderes. Likeledes var det ikke mulig å bestemme tumortype, eggstokk-morfologi eller tumorstadium ved histologi. Det totale antall av T- og B-celler ble bestemt videre ved morfometrisk evaluering av immunfarget deler av normal ovarie og ovarietumorer. Denne tilnærmingen gjorde det også mulig å bestemme ovarial tumor trinnet og for å vurdere mulige forskjeller i lymfocytter plassering
(A):. Representative fremover vs. side spredningsdiagram for celler fra en hel eggstokk som viser luken (R1) benyttes for lymfocytter. (B) Celler ble først gated ved hjelp av porten i (A) og deretter farget med enten Bu1a-APC, CD4-FITC eller CD8-PE. Prosentandelen av merkede celler i porten er vist i den nedre høyre kvadrant for hver enkelt flekk. (C) Det totale antall Bu1a-APC, CD4-FITC og CD8-PE merket celler fra normal og svulst høne eggstokkene (n = 3 /gruppe) vises med medianen indikert av den horisontale linjen.
Innenfor follikler (figur 6), redusert CD8 + T-celler (p = 0,052), mens CD4 + T-celler økt (p = 0,009) fra normal til begynnelsen av tumorer og normalt å sent stadium tumorer. B-celler ble vanligvis ikke forbundet med follikler og ble ikke telles. Antall follikler redusert eller var fraværende i eggstokkene med tumorer sammenlignet med normale eggstokkene (figur 1).
(A) B (Bu1a +) celler ble sjelden funnet i folliklene og derfor ikke ble tellet. Antallet CD4 + T-celler økte svakt (p = 0,052) og antall CD8 + T-celler ble redusert (p = 0,009) i sent stadium ovarietumorer sammenlignet med normale eggstokkene. På hvert trinn var det mer CD8 + i forhold til CD4 + T-celler (normal ovarie, p = 0,003; tidlig stadium tumor, p = 0,008; sent stadium tumor, p = 0,007). Follikler ble definert som vist i (B) og celler i det angitte området, ble tellet og gjennomsnittet bestemt ifølge 2 x 10
5 um
2 område av follikkelstimulerende hormon. Tre seksjoner fra hver eggstokk for hver høne ble tellet ved en forstørrelse på 20x; skala bar = 50 mikrometer. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM.
stromal (dvs. ikke-follikulært) immuncelleinnhold økte samlet med tumorstadium (figur 7) og var preget av et høyere antall CD8 + T-celler enn CD4 + T-celler ved hvert trinn (CD8 CD4-celler sammenlignet med for normale eggstokk, p = 0,003; tidlig stadium tumor, p = 0,008 og sent stadium tumor, p = 0,007). I likhet med flowcytometri, Bu1a + celler og CD8 + T-celler var mer tallrike enn CD4 + -T-celler i normal ovarie og tidlig og sent stadium ovarietumorer (figur 7A, B og C). Antallet CD4 + T-celler var signifikant lavere i tidlig stadium tumorer sammenliknet med normal ovarie (p = 0,03), og det var ingen forskjell mellom Bu1a + og CD8 + celler. CD4 + celler, var signifikant høyere (p = 0,05), mens økningen i gjennomsnittsverdiene for Bu1a + og CD8 + celler ikke nådde signifikans i sent stadium tumorer sammenlignet med normalt. Total, total immunceller øket fra normal til tidlig stadium for å sent stadium tumorer (figur 7D).
Som vist i paneler AC for normal (N), tidlige (E) og sent stadium (L) eggstokk-kreft, Bu1a + celler og CD8 + T-celler var mer tallrike samlet enn CD4 + T-celler, spesielt i sent stadium tumorer. I panel D, ble det B- og T-celler tellinger tilsatt. Det var en generell økning i totale (ikke-follikulære) immunceller fra normale eggstokk til sent stadium svulster. Cellene ble telt i flere felt i tre deler fra hver eggstokk for hver høne på 20x forstørrelse. Det gjennomsnittlige antall B (Bu1a +) celler og CD4 + og CD8 + T-celler ble anslått fra 11 høner med normale eggstokker (antall felter talt var Bu1a = 524, CD4 = 425 og CD8 = 360), 8 høner med tidlig fase kreft i eggstokkene ( antall felt telte var Bu1a = 228, CD4 = 190 og CD8 = 225) og 7 høner med sent stadium eggstokkreft (antall felt telte var Bu1a = 180, CD4 = 190 og CD8 = 200). Siden områdene evalueres variert i størrelse, alle punkter ble normalisert til 8 × 10
4 mikrometer
2.
Antall immunceller varierte på bakgrunn av tumortype (figur 8). Bare de sent stadium (III /IV) svulster ble vurdert siden fastsettelse av tumorhistologi var klarere på disse stadiene. Det var flere B-celler i serøse svulster enn i mucinous (p = 2,6 × 10
–
14) eller endometrioid (p = 7,6 × 10
–
9) svulster. Serøs svulster hadde signifikant færre CD4 + T-celler i forhold til mucinous (p = 3,8 × 10
–
5) eller endometrioid (p = 2,9 × 10
–
9) svulster. Antallet CD8 + T-celler var lik blant krefttyper (p 0,2).
Siden histologisk klassifisering av svulster er tydeligst i sent stadium ovarietumorer ble morfometrisk analyse begrenset til sent stadium svulster. Klare celle svulster forekom i relativt lave tall og ble ikke inkludert i analysen. Antallet Bu1a +, CD4 + og CD8 + celler ble tellet som beskrevet i Metoder for serøs (66 felt i 3 høne ovarier); mucinkjertler (53 felt i 2 høne eggstokkene) og endometrioid (37 felt telles i 2 høne eggstokkene) histologi svulster. Det var betydelig mer B (Bu1a +) celler i serøse svulster enn i mucinous (p = 2,6 × 10
–
14) eller endometrioid (p = 7,6 × 10
–
9) svulster. I kontrast, serøs svulster hadde signifikant færre CD4 + T-celler i forhold til mucinous (p = 3,8 × 10
–
5) eller endometrioid (p = 2,9 × 10
–
9). Antallet CD + 8 T-celler var ikke signifikant forskjellig fra tumorhistologi (p 0,2).
Diskusjoner
Denne studien er den første til å undersøke immunceller i forbindelse med ovarietumorer i egglegging høne modell av spontan eggstokkreft. Den totale immuncelleinnhold i eggstokkene med svulster ble høyere enn hos normale eggstokker. Resultatet var lik ved hjelp av to standardmetoder; flowcytometri og morfometrisk analyse av immunohistochemically merket vevssnitt. Ved strømningscytometri var det forholdsvis store variasjoner i celleantall for hver celletype, særlig for høner med svulster. Disse variasjonene ble funnet ved hjelp av strømningscytometri kan være delvis på grunn av varierende inkludering av celler fra blodårer og den variable innhold av aktive follikler som eggstokk utvikler seg fra en normal eggstokk til eggstokkene med et avansert stadium tumor. Derfor ble lagt større vekt på fastsettelse av immunceller tall ved immunhistokjemisk morfometri siden plasseringen av lymfocytter i forhold til tumor eller follikler kan bli vurdert, og siden svulster kunne klassifiseres med histologi og scene.
funn av immunceller i den normale eggstokk i denne studien er i overensstemmelse med tidligere studier på høner [38], andre dyremodeller [47] og mennesker [45], [48]. I en detaljert studie av den normale rotte eggstokk, lymfocytter var rikelig og også øket forbigående faller sammen med eggløsning [47]. Når rotter ble splenectomized, ble ovarie-lymfocytter redusert, men ikke eliminert noe som tyder på at i den normale eggstokk, er det «bosatt» lymfocytter, eller at ikke all trafikk lymfocytter fra milten. I denne studie av høne, synes det også å være «bosatt» lymfocytter i den normale eggstokk som er tilstøtende til det ytre cellelaget av folliklene, så vel som i den ovarian stroma og flate epitel. Dette reiser et spørsmål om hvorvidt immunceller som finnes i ovarietumorer stammer fra milt eller lymfeknuter eller om bosatt immunceller i eggstokken bidra til ondartet konvertering.
I normal høna eggstokk, B-celler ble funnet med relativt høy frekvens i stroma og medullære regioner, i likhet med CD4 + og CD8 + celler. Imidlertid B-celler ble sjelden observert i folliklene, i motsetning til CD4 + og CD8 + celler. Den relativt høye overflod av T-celler i folliklene antyder at de har en rolle i normal ovarial funksjon. Mens markør Bu1a er spesifikk for høne B-celler, er det også uttrykkes på aviær makrofager og i langt mindre grad på andre ikke-B-celletyper [49]. Således er videre studium nødvendig med sekundære markører for å skille B-celler og ikke-B-celler i høne. Likevel, denne studien viste at B-cellene utgjør en betydelig andel av lymfocytter i ovarietumorer.
Basert på en rekke rapporter fra andre grupper i dyremodeller og mennesker, ble immunceller forventet i ovarietumorer [50], [ ,,,0],51], [52]. Det har vist seg at pasientoverlevelse er korrelert med antallet tumor infiltrerende lymfocytter [5] i kirurgisk materiale som vanligvis blir oppnådd fra sent stadium sykdom. Det er vanskelig å fastslå rollen til disse celler i tidlige stadier siden eggstokkreft er sjelden oppdages tidlig hos mennesker. Likeledes når eggstokkreft blir indusert i dyremodeller er det ikke klart om initiering hendelser er modeller for spontan tumorutvikling. Det finnes ingen studier av immunceller i høne eggstokksvulster og få studier som sammenligner disse cellene i normal eggstokk og ovarietumorer å vurdere potensielle endringer i løpet spontan eggstokkreft tumor utvikling. I denne studien har vi funnet at det totale antallet av immunceller i eggstokken har en tendens til å være høyere i nærvær av spontane tumorer, noe som er i overensstemmelse med akseptert konseptet at immunceller trafikk til og invadere tumorer [5], [53], [ ,,,0],54]. Videre er immuncelleinnholdet i størst sent stadium tumorer, spesielt i sent stadium serøs tumorer. Etter denne trenden er den samme som hos mennesker [50], [52], [55], [56], [57], resultatene understøtter bruken av høne modell for å undersøke immunresponser mot ovarietumorer og for preklinisk vaksineforsøk.
Hos mennesker er lymfocytt innhold bestemmes av immunhistokjemi i ovarietumorer ikke konsekvent i ulike studier, spesielt med hensyn til B-celler [58]. Late-trinns menneskelige ovarian tumor biopsier inneholdt primært CD8 + /CD45RO + T-celler og CD68 + makrofager, mens NK og B-celler skjedde i de laveste tallene [50]. I motsetning til dette, ble CD20 + B-celler funnet i 42% av ovarietumorer i en annen studie [6]. I overlevelses studier ble et høyere antall CD19 + B-celler assosiert med dårligere prognose [59] mens høyere antall CD20 + B-celler var assosiert med økt sykdomsfri overlevelse [6]. Forskjeller i disse studiene kan skyldes bruk av ulike markører, men de kan også reflektere forskjeller i relative innhold av forskjellige tumor Histo-typer i disse studiene [6]. B-celler og CD8 + T-celler ble observert i ovarietumorer av hønse med forholdsvis høy frekvens, mens CD4 + celler ble detektert ved en forholdsvis lavere frekvens.
Immunceller forekom i alle de tre tumor Histo-typer som er undersøkt ( serøs, mucinous, og endometrioid), men det var flere immunceller i sent stadium serøs svulster.
