Abstract
Wnt veien er integrert involvert i regulering av selv fornyelse, spredning, og vedlikehold av kreft stamceller (cscs). Vi har undersøkt effekten av Wnt antagonist, utskilles frizzled-relatert protein 4 (sFRP4), ved modulering av epitelial til mesenchymal overgang (EMT) i cscs fra human glioblastoma cellelinjer, U87 og U373. sFRP4 chemo-sensibilisert CSC-beriket celler til den mest brukte anti-glioblastom narkotika, temozolomid (TMZ), ved reversering av EMT. Cell bevegelse, kolonidannelse, og invasjon
in vitro
ble undertrykt av sFRP4 + TMZ behandling, som korrelert med bryteren uttrykk av markører fra mesenchymale (Twist, Snail, N-cadherin) til epitel (E-cadherin ). sFRP4 behandling fremkalte aktivering av Wnt-Ca
2
+ sti, som motvirker Wnt /ß-catenin veien. Betydelig ble chemo-allergi effekt av sFRP4 korrelert med reduksjon i uttrykket av stoffet resistensmarkører ABCG2, ABCC2, og ABCC4. Effekten av sFRP4 + TMZ behandling ble demonstrert
in vivo
bruker nakne mus, som viste minimum svulst engraftment hjelp cscs forbehandlet med sFRP4 + TMZ. Disse studiene viser at sFRP4 behandling vil bidra til å forbedre responsen på brukte kjemoterapeutika i hjernesvulst ved å modulere EMT via Wnt /ß-catenin veien. Disse funnene kan utnyttes for å utforme bedre målrettede strategier for å forbedre chemo-respons og til slutt eliminere glioblastom cscs
Citation:. GB, Arfuso F, Millward M, Dharmarajan A, Warrier S (2015) Utskilt frizzled-Related Protein 4 hemmer glioma stilk-lignende celler ved å reversere Epitelial til Mesenchymale Transition, indusere apoptose og Avtagende Cancer Stem Cell Properties. PLoS ONE 10 (6): e0127517. doi: 10,1371 /journal.pone.0127517
Academic Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES
mottatt: 13 desember 2014; Godkjent: 15 april 2015; Publisert: 01.06.2015
Copyright: © 2015 G et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Curtin University Kommersialisering Advisory Board og School of Biomedical Sciences strategiske forskningsmidler, India Forskningsinitiativet midler (Prof Arun Dharmarajan), midler fra Institutt for bioteknologi, India (BT /PR8493 /mED /31/226/2013) og midler gitt av professor Michael Millward, University of Western Australia, Perth, Western Australia
Konkurrerende interesser. Dette arbeidet ble støttet av Curtin University Kommersialisering Advisory Board og School of Biomedical Sciences strategiske forskningsmidler, India Forskningsinitiativet fond (Prof Arun Dharmarajan), støtte fra Institutt for bioteknologi, India (BT /PR8493 /mED /31/226/2013) og midler gitt av professor Michael Millward, University of Western Australia, Perth, Western Australia. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
glioblastoma multiforme (GBM) er en World Health Organization Grade IV svulsten og er den vanligste og aggressiv hjernesvulst hos voksne [1] . GBM representerer 15-20% av alle primære intrakraniale svulster og til tross for multimodale behandlingstilbud, er den samlede prognosen dystre med en median overlevelse på ca 14,6 måneder og to-års overlevelse på 30% [2]. De viktigste årsakene til de dårlige resultatene av GBM er høy forekomst av tilbakefall og motstand mot cellegift. Den viktigste grunnen for gjentatte tilbakefall og variert kjemoterapeutisk responsen har blitt funnet å være de kreft stamceller (cscs) innenfor glioma tumor [3]. Glioma cscs (GSCs) ble først identifisert ved tilstedeværelsen av en unik celleoverflateprotein, prominin en eller CD133. Deretter ble mange andre definerer markører identifisert for glioma cscs. Som med cscs fra andre svulster som blod, bryst, prostata og tykktarm, gliom cscs også over-express multiresistens (MDR) markører som ABC transportører, som er en av de viktigste årsakene til økt cellegift-motstand [4] .
Aktivert selvfornyelse, økt cellegift-motstand, og oppregulert epitelial til mesenchymale overgang (EMT), som er de karakteristiske kjennetegnene ved cscs blitt assosiert med avvikende Wnt /β-catenin signale [4 -6]. Flere proto-onkogener fremme GBM vekst og øke CSC befolkningen ved å aktivere Wnt veien komponent, TCF-4 [7]. Utskilt frizzled-relaterte proteiner, DKK1 til 4, og WIF1 forhindre igangsetting av Wnt signalering på celleoverflaten ved å interferere med interaksjonen mellom wnt ligander og den FZD reseptoren og ko-reseptor LRP5-6 [8].
Utskilt frizzled relaterte protein 4 (sFRP4) er en av fem medlemmer av sFRP familien, og har vært innblandet å ha en pro-apoptotisk funksjon i mange vev [9-15]. Over-ekspresjon av sFRP4 har vært forbundet med en redusert hastighet for spredning, redusert forankrings-uavhengig vekst og invasivitet redusert i prostatakreftcellelinje, PC-3 [16]. Stanse av de sFRP gener gjennom hypermethylation til promoter-regionen har blitt oppdaget i kreftformer som hepatokarsinom [17,18] og GBM [19]. I våre tidligere rapporter om glioma og hode- og halskreft stilk-lignende celler, sFRP4 vesentlig redusert CSC befolkning og redusert stemness gener [20,21]. sFRP4, å være en fysiologisk utskilt hemmer i seg selv ikke har vist potent apoptotisk evne i cscs studert. Men rollen som sFRP4 syntes å være chemo-sensibiliserende den cscs til brukte Onco-therapeutics som de cscs er ildfast. I et forsøk på å ta opp noen av de plausible årsaksfaktorer der sFRP4 kan fungere på cscs studerte vi glioma cscs for deres respons på sFRP4. Vi viser at det er en sammenhengen mellom EMT signatur egenskaper, cellegift-motstand induserende faktorer, og sFRP4 mediert chemo-allergi i glioma cscs; og dermed gi en virkningsmåte av denne Wnt antagonist. Denne kombinasjonen tilnærming av sFRP4 og narkotika holder løftet for CSC-rettet terapi for å bedre overlevelse og redusere glioblastom tilbakefall.
Resultater
Kreft stamcelle berikelse og karakterisering av glioma kuler
vi først anriket en CD133 positiv befolkningen i de U87 og U373 gliom cellelinjer ved å dyrke dem i sfæroide kulturer i fravær av serum, supplert med vekstfaktorer LIF, EGF, og B27 i ikke-adherente kulturplater. Spheroid kolonier er en typisk definerende trekk ved cscs, som er i stand til å spre seg, forblir udifferensiert, og beholder sin stemness profil i serumfritt kulturer. Etter innledende celledød, noen av de gjenværende cellene vokste og proliferert raskt og danner neurosfærer kolonier. Etter immunhistokjemi for CD133 ekspresjon, ble det observert en distinkt farging av de sfæroide kolonier. Dyrking av celler i et serum-anriket monolagskultur viste lavt nivå farging for CD133 (figur 1A). Ekspresjon av CD133-mRNA var synlig bare i sfæroide kulturer, som vist ved semi-kvantitativ RT-PCR (S1 figur) og kvantitativ PCR, noe som viste en økning i ekspresjon av CD133 i sfæroider over monolagskultur for begge cellelinjer (fig 1B) . Det ble ikke observert protein ekspresjon av CD133 for å være høyere i sfæroide kulturer enn i monolagskultur for begge cellelinjer undersøkt (S2 Fig). Til slutt, vi karakterisert nærvær av CD133-positive celler ved flow-cytometri og funnet at 94,12% av U87-kuler og 83,91% av U373 kuler var positive for CD133, mens den monolagskultur hadde henholdsvis bare 63,56% for U87 og 67,6% for U373 cellelinjer (fig 1 C).
a) Mikrofotografier av monolayer og sfæroide kolonier (venstre panel, skala bar = 50 pm, n = 3) og CD133 markør flekker (høyre panel, skala bar = 100 pm) som vist ved immunocytochemistry i monolags og sfæroide kolonier av U87 og U373-cellelinjer. b) Kvantitativ RT-PCR av CD133 mRNA ekspresjon av U87 og U373-cellelinjer dyrket i CSC medium. Resultatene er gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført in triplo (* p-verdi 0,05, ** p verdi 0,01, n = 3). ML = monolags, CSC = kreftstamceller. c) Flowcytometri analyse av CD133 i U87 og U373 celler dyrket i CSC medium.
sFRP4 undertrykker vekst av GSCs fra U87 og U373 cellelinjer og øker responsen neurosfærer å temozolomid
for å estimere effektene av sFRP4 og strålebehandling, enten alene eller i kombinasjon, på veksten av sfæroide kolonier fra U87 og U373 cellelinjer, ble 3D-kulturene inkubert med sFRP4 (S), temozolomid (T), eller S + T for 24 timer. Veksthemming ble beregnet ved MTT, BrdU, og sfære hemming analyser. Ved anvendelse av MTT-analysen, ble det observert at S eller T alene inhiberte proliferasjon av U87 og U373 kuler med 25%. Imidlertid S + T hadde en større hemmende virkning på ca. 50% i sfæroider fra begge cellelinjer (figur 2A). Et lignende mønster ble observert ved bruk av BrdU-celleproliferasjonsanalyse, karakterisert ved at S + T behandling ble sett å hemme proliferasjon opp til 40% (figur 2B). I ubehandlede kontrollkulturer, viste resultatene at kulene forble intakte. Behandling med S alene eller T alene viste en beskjeden reduksjon i størrelse sfære i motsetning til S + T i hvilken oppløsningen av kulene var mer dramatisk. Dette ble ytterligere bekreftet ved merking sfæroidene for CD133 markør ved immunocytokjemi, noe som viste en markant reduksjon av CD133 farging i S + T behandlede prøver (figur 2C). For å beregne den prosentvise inhibering, og døde celler ble GSCs fra U87 og U373 cellelinjer kastes propidiumjodid (PI) farging etter forskjellige medikamentbehandlinger. Prosentandelen av friske celler var 83% i ubehandlet kontroll, redusert marginalt til 79% i S behandlet med et mer uttalt reduksjon på 68% i T behandles, som ble redusert drastisk til 27% i S + T behandlet GSCs fra U87-celler. I GSCs fra U373-celler, hadde den ubehandlede kontroll 86% friske celler, som gikk ned til 55% ved S-behandling. I motsetning til U87-celler, T behandling og S + T behandling av U373 GSCs ble ansett for å ha en tilsvarende prosentandel (26%) av friske celler (Fig 3). For å bestemme om celledød skyldes apoptose, studerte vi avbrudd i mitokondriemembranen, noe som er en indikator på apoptose, ved hjelp av JC-1 farvestoff [22]. Prosentandelen av apoptotiske celler økte i S, T, og S + T behandlet U87 og U373, hvilket indikerer starten av apoptose ved endringer i mitokondriemembranpotensialet (fig 4). I begge cellelinjer, ble det høyeste nivået av apoptose (57% for U87 GSCs og 38% for U373 GSCs) observert i kombinasjon behandlet GSCs. For å evaluere reduksjonen i den CD133 positiv populasjonen etter medikamentbehandling, strømningscytometri-analyse ble utført. Som forventet, var det en reduksjon i CD133-positive celler i både U87 og U373 GSCs, reduksjonen være fra 69% i ubehandlet til 62% i S behandlet, 54% i T, behandlet på 47% i S + T behandlet U87 GSCs og fra 68% i ubehandlet, 64% i S behandlet, 62% i T behandles, til 56% i S + T behandlet U373 GSCs (figur 5).
a) og b) grafer representerer inhibering henholdsvis fra U87 og U373 cscs etter behandling i 24 timer med sFRP4- 250pg /ml (S), temozolomide- 25 pm (T), og sFRP4 + temozolomid (S + T). Resultatene er gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført in triplo (* p-verdi 0,05, ** p verdi 0,01, n = 3). c) Mikrofotografier av sfære dannende analyse og immunocytokjemisk farving med CD133 etter behandling med kontroll, S, T, og S + T. Kjerner ble kontra med DAPI (blå), (skala bar = 100 pm).
Flowcytometrisk analyse av cellesyklus profiler av U87 og U373 cscs etter behandling med kontroll, S, T, eller S + T etter farging med propidiumjodid.
JC-1 mitokondrie depolarisering analysen etter kontroll, S, T, eller S + T behandling av U87 og U373 cscs.
Flow cytometri analyse av CD133 uttrykk analyse av ubehandlet, S, T og S + T behandlet U87 og U373 cscs sammen med kontroll farging med iso PE.
sFRP4 nedregulerer EMT fremme gener og chemo-motstand gener
Analyse ved semi-kvantitative og kvantitative RT-PCR ble benyttet for å bestemme uttrykket forandringer av CD133, EMT markører, og medikamentresistensgener. Behandling av U87 og U373 GSCs med sFRP4 og strålebehandling resulterte i en signifikant økning i ekspresjonen av epiteliale markør E-cadherin. Ekspresjon av mesenchymale markør N-cadherin ble observert å ha vesentlig redusert i S + T behandlet GSCs, med en markert reduksjon i U87 GSCs. En reduksjon i stemness tilhørende markør CD133 ble observert å være dramatisk i S + T behandlet GSCs fra U87 og U373 cellelinjer. For å vurdere om de strukturelle endringene i EMT ble reflektert i endringer av transkripsjons regulatorer av EMT, uttrykk for
Snail
,
Twist
, og
Slug
ble studert. Ventet, behandling med S + T førte til en betydelig reduksjon i ekspresjon av disse tre transkripsjonsfaktorer i begge cellelinjer som sett ved hjelp av RT-PCR (S3 figur) og qPCR (figur 6A og 6B). Disse resultatene klart peker til endringer knyttet til EMT på molekylært nivå. For å analysere om stoffet følsomhet ble ledsaget av en nedgang i uttrykket av narkotika transportører, ble uttrykket studier utført på
ABCG2
,
ABCC2
, og
ABCC4
. Det ble observert at uttrykket av disse markørene redusert betydelig etter behandling med S + T, og nivået på
ABCC2
var umulig å oppdage i S + T behandlet U87 GSCs (Fig 6A og 6B).
a) og b) Representative grafer som viser relativ mRNA uttrykk for CSC markør, EMT relaterte gener (
N-cadherin
,
Twist
,
Snail
, og
Slug)
og narkotika transport av gener (
ABCG2
,
ABCC4
, og
ABCC2
) i U87 (a) og U373 (b) cscs etter rusbehandling ble utført ved kvantitativ RT-PCR. Resultatene er gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført in triplo (* p-verdi 0,05, ** p verdi 0,01, n = 3).
sFRP4 nedregulerer fibrinoblast markører EMT og aktiverer Wnt /kalsium sti
Den typiske endringer observert i løpet av EMT omfatte mindre inter tilslutning, færre tett veikryss, og tap av mobilnettet polaritet. β-catenin aktivering og co-uttrykk for fibroblastisk markører vimentin og α-glatt muskel aktin (α-SMA) er cellulære hendelser følger disse endringene [23].
Vi undersøkte uttrykk for de tre EMT relaterte markører, β-catenin, α-SMA, og vimentin på proteinnivå. I U87 sfæroide kulturer behandlet med forskjellige medikamentkombinasjoner, cellene som uttrykker α-SMA, vimentin, og β-catenin ble analysert ved immunohistokjemisk lokalisering. De sfæroide kulturene mistet sin sfæriske morfologi, og ekspresjon av α-SMA og vimentin i S + T-behandlede celler var svak. Cellene hadde gjennomgått massiv celledød, sfære avbrudd, og var tilhenger i S + T behandlet U87 sfærer; og andelen av β-catenin flekker celler var meget lav sammenlignet med de ubehandlede kontroll sfæroide celler (figur 7A). Mønsteret observert av immunhistokjemisk farging ble ytterligere bekreftet ved Western blotting. Behandling av U87-sfæroider med S + T resulterte i en vesentlig reduksjon i α-SMA, vimentin, og β-catenin protein ekspresjon i forhold til den ubehandlede kontroll U87 sfæroide celler (figur 7B).
a) Immunocytochemistry av mesenchymale markører a glatt muskel aktin (α SMA), vimentin, og ß-catenin i U87 cscs behandlet med kontroll, S, T, eller S + T (skala bar = 100 pm). Kjerner ble kontra med DAPI (blå). b) immunoblotanalyse av α SMA, vimentin, og ß-catenin i U87 cscs behandlet med kontroll, S, T, eller S + T.
Vi neste undersøkte effekten av sFRP4 på ikke- kanoniske arm av Wnt signal via mobilisering av intracellulært Ca
2
+. Effekten av sFRP4 på Wnt /kalsium-signalveien i cscs ble undersøkt ved anvendelse av en fluoriserende indikator FURA-2. Etter behandling med sFRP4, var det en betydelig økning i intracellulær Ca
2
+ frigjøring (Fig 8), og dermed antyder en involvering av ikke-kanoniske Wnt signal i sFRP4 mediert hemming av cscs.
intracellulær kalsium analysen bestemmes av fluorescerende radiometriske Ca
2
+ indikator Fura-2, i U87 cscs behandlet med kontroll, S, T, eller S + T (* p-verdi 0,05, ** p verdi 0,01, n = 3).
spheroid celler vise lavere kolonidannende evne, ekstracellulær matriks (ECM) penetrasjon, og vandrende /invasiv potensial etter behandling med sFRP4 og temozolomid
Rapid selv -renewal er kjennetegnet eiendom cscs, og tapet av stemness resultater i differensiering og exit fra cellesyklusen. Som en analogi studerte vi den selvfornyelse trekk som en indikator på hemning eller apoptose av cscs. Ved kule-dannende analyser i myk agar, sammenlignet vi evnen til å danne kuler i ubehandlet kontroll, S, T, og S + T behandlet U87 sfæroider. Ved farging koloniene med krystallfiolett, ble det observert at ubehandlede GSCs dannet store kolonier, men i S alene og T alene behandlede celler, koloniene var mindre og spredning var svak. I tillegg, i U87 GSCs behandlet med S + T, koloniene hadde en drastisk reduksjon i størrelse og antall celler i koloniene var dårlig (figur 9A).
a) mikrograf bilder av myk agar-kolonianalyse av U87 cscs etter behandling med kontroll, S, T, eller S + T. Farging med krystallfiolett indikert kolonien størrelse (skala bar = 50 gm). b) angiogen analyse av U87 cscs (behandlet for 24 timer med kontroll eller S, T, eller S + T) seeded på en pro-angiogen ECMatrix gel pre-belagt plate. Farging med krystallfiolett oppdaget tube dannelse og innledende prosesser (skala bar = 100 pm). c) Etter behandling U87 CSC med kontroll, S, T, eller S + T for 24 timer, en
in vitro
transwell migrasjon analysen ble utført. Krystallfiolett farging indikerte cellemigrering over transwellkammeret (skala bar = 100 um).
Den primære evne cscs er evnen til å initiere veksten av primærtumor og drive invasjon og metastase. Det er en etablert forholdet mellom andelen av cscs i brystkreft og manifestasjonen av metastase [24]. Den invasive evne kan være korrelert til cellenes evne til å trenge inn og spre gjennom ECM. Vi undersøkte muligheten for U87 GSCs å vokse på en ECM og den påfølgende hemming av denne egenskapen ved medikamentell behandling. Det ble observert at, i S + T behandlet GSCs, ble formeringen hemmet etter 24 timer med lik celle poding (figur 9B, panel 2). Farging med krystallfiolett viste en tydelig hemming av celleveksten gjennom ECM i S + T-behandlede celler (figur 9B, panel 3). Invasion fører til metastatisk spredning og vi undersøkt dette ved å sammenligne metastatisk potensial av ulike legemiddelbehandlede U87-GSCs med en Matrigel invasjonen kammer. Vi har observert en dramatisk forskjell mellom ubehandlede og S + T-behandlede celler, som de ubehandlede celler migrert helt gjennom membranen og aggregert som kolonier. Den vandrende potensialet i S + T-behandlede celler ble betydelig svekket, og det ble observert at bare noen få celler med differensiert morfologi hadde migrert (Fig 9C).
karsinogent potensial
in vivo
redusert etter behandling av U87 GSCs med sFRP4 og temozolomid
for å bestemme nivået på tumorigenitet av U87 GSCs etter behandling med S, T og S + T, observerte vi svulst utvikling i hårløse mus som hadde blitt injisert subkutant med tumorceller. På fire
th dag av injeksjon, dyrene som fikk ingen behandlings utviklet svulster, mens dyrene mottar S + T behandlet GSCs hadde ingen tumordannelse. GSCs behandlet med t hadde en mindre tumor sammenlignet med S behandlet GSCs, men begge var mindre enn den ubehandlede kontroll ved 4
th dag av injeksjonen (figur 10A). På 10
th dag, etter innhøsting, var det betydelig mindre mengder subkutane svulster fra mus injisert med S + T behandlet GSCs enn for ubehandlet, S behandlet, og T behandlet grupper (figur 10B).
Gjennomsnittlig svulststørrelse (a, b) etter subkutan injeksjon av U87 cscs behandlet med kontroll (U), S, T, eller S + T (* p -verdi 0,05, ** p verdi 0,01, n = 4).
Diskusjoner
Glioma stamceller kan oppnås ved ulike strategier som celle sortering basert på overflatemarkører som CD133, berikelse av fargestoff effluxing side befolkningen, og narkotika og stråling motstandsdyktig cellepopulasjon som uttrykker ATP-bindende kassett transportører og minibank proteiner henholdsvis [25,26]. I denne studien, beriket vi CSC populasjoner fra to menneskelige glioblastom cellelinjer, U87 og U373, av voksende kuler i serumfritt kulturer og bekreftet CSC eiendom i kraft av sin uttalt heving av CD133 uttrykk. Bruke beriket glioma stamceller fra disse to glioma cellelinjer, studerte vi deres hemming av kjemoterapeutika, forsterket av sensibilisering med sFRP4. Vi kunne tydelig viser at en kombinert behandling av sFRP4 med standard stoffet som brukes for GBM, temozolomid, inhiberte proliferasjon av GSCs fra begge cellelinjer, forstyrret deres sfære formasjon egenskaper, nedsatt deres kolonidannelse i myk agar assay, og hindret cellesyklusprogresjon som gjenspeiles av PI farging. Depolarisering av mitokondriemembranen er en klar indikasjon på apoptose hvor integriteten av mitokondriemembranen er kompromittert [22]. Vi kunne tydelig viser en markant mitokondrie membran avbrudd i stoffet behandles GSCs.
For å bestemme tumorigent potensialet av stoffet behandlet GSCs
in vivo
, tumor utvikling ble utført i nakne mus. Resultatene og mønstre av
in vitro
eksperimenter ble ytterligere bekreftet
in vivo
, hvor S + T kombinasjon behandlet GSCs hadde de minste mengder subkutane svulster. Chemo-sensibilisering er en strategi for å overvinne chemo-motstand og innebærer bruk av en medikament for å øke aktiviteten av en annen ved å modulere mekanismene for kjemoterapi-resistens. Våre studier viser at sFRP4 forsterket effekt av TMZ på glioma stamceller. Wnt signalering er en viktig vei som er involvert i normalt vev homeostase. De sFRPs er den største familie av utskilte wnt antagonister og er homologe til det ligandbindende cysteinrike domene av frizzled familien av wnt reseptorer. sFRP4 er involvert i reguleringen av apoptose, proliferasjon, formasjons vev, og tumorvekst [10,12,27,28]. Chemo-allergi ved sFRP4 vil tjene to formål: redusere den nødvendige kjemoterapeutiske lasten til kreft og fremme en vedvarende Wnt hemning for å tilveiebringe et terapeutisk vindu for kjemoterapi, skåner de normale Wnt-avhengige vev. Denne doble fordel kunne forhindre langvarig bruk av både Wnt antagonist og temozolomid, og sidesteg de uønskede toksiske effekter av behandlingen på normale celler.
Aktivering av epitelial til mesenchymale overgang er vesentlig for effektiv metastatisk kolonisering, og det er en prosess aktivt oppregulert i cscs. Den nye, definerende trekk cscs er oppkjøpet av mesenchymale trekk og overgangen fra epiteliale til mesenchymale fenotype [29]. I denne studien presenterer vi et innblikk i mekanismen hemming av cscs av sFRP4 ved å analysere de epiteliale og mesenkymale egenskaper glioma stamceller etter chemo-sensibilisering med sFRP4. Ikke-adherente kuledannende analyser er pålitelige analyser som brukes til å evaluere stamcelle aktivitet i normale vev og antatte cscs, og neurosfærene er en godt studert sfære analyse [30]. Vi observerte at GSCs behandlet med S + T hadde betydelig økt forankring og redusert sfære dannende egenskaper, karakterisert ved at cellene kan vokse ut av kulene og holder seg til å danne et monolag. I en tilsvarende undersøkelse i cscs fra hode og nakke kreft, sfæroide kulturer der vist til over-express EMT markører og hadde redusert spheroid formasjon evne og økt etterlevelse var proporsjonal med mesenchymale til epitelial bryteren [31]. Et annet typisk fenotypiske manifestasjon av EMT er migrasjon og invasjon [32,33]. Vi observerte at behandling med S + T redusert GSC invasivitet gjennom ECM og migrasjon gjennom Transwell kamre, som kan bli lenket sammen til anskaffelse av epitelceller trekk ved denne legemiddelkombinasjonen.
Økt tilslutning og forankring er ledsaget av manifestasjonen av epitel markør E-cadherin, desmosomes, og innstramming av adherens veikryss, som er forankret til cytoskjelettet av ß-catenin; og ved tapet av mesenchymale definere markører slik som cytoskeletal proteiner vimentin og glatt muskulatur aktin [34]. Dette er ledsaget av en transkripsjonen forskyvning av faktorer som aktiverer mesenchymale gener og undertrykke epiteliale markører som sneglen, ZEB, og den bHLH familie av transkripsjonsfaktorer, og øker avsetningen av ECM protein, fibronektin. Den markerte reduksjon som vi har observert for cytoskeletal proteiner, vimentin, og a glatt muskulatur aktin, og adherens krysset proteinet, P-catenin, i S + T behandlet cscs er klart bevis på bryteren av status fra mesenchymale til epitel.
medlemmene av Snail familie- Snail, Slug, og Smuc, har en felles ulempe domene og en sink finger region ved C-terminalen der de binder seg til E-bokser i promotorområdene av målgener. The Snail familien av transkripsjonsfaktorer initierer undertrykkelse av E-cadherin ved å formidle histonmodifikasjonene, som endrer deres protein stabilitet og intracellulær lokalisering. Regulering av snegle-proteiner er under kontroll av forskjellige signaler, inkludert Wnt, Shh, EGF, FGF, og TGFp [35]. Transkripsjonsfaktor Twist samhandler med komponenter av Nurd komplekse, polycomb repressor komplekser PRC1 og PRC2 på E-cadherin promoter og undertrykker E-cadherin, mens binding av Twist 1 til metyltransferase SET8 aktiverer N-cadherin. Involvering av EMT-mediertranskripsjonsfaktorer ble tydelig i vår studie der uttrykk for
Snail
,
Slug
, og
Twist
redusert til halvparten i S + T behandlet GSCs. I samsvar, uttrykk for den funksjonelle epitel markør E-cadherin hadde en to gangers økning i S + T behandlet GSCs, og dens mesenchymale motstykke N-cadherin redusert ved medikamentell behandling.
sFRP4 har en multi-level handling på Wnt /ß-catenin sti og kan motvirke Wnt /ß-catenin og også de ikke-kanoniske Wnt /planar celle polaritet veien ved å aktivere Wnt /Ca
2
+ sti [36]. Akkumulering av Ca
2
+ av sFRP4 som vi har observert i våre studier kunne indikere aktivering av kalsineurin, som har vist seg å bli stimulert av sFRP2 via Wnt /Ca
2
+ pathway [ ,,,0],37]. Kalsium har vært innblandet å være en viktig formidler av antagonisme av Wnt signal ved å handle på flere punkter. En økning i den intracellulære kalsium resulterer i aktivering av kalsium /kalmodulin-avhengig protein-kinase II (CaMKII) og proteinkinase C (PKC), som i sin tur motvirker den kanoniske Wnt veien [38,39]. Den resulterende apoptose som vi har observert etter sFRP4 behandling kan således være en virkning av økte intracellulære kalsiumnivåer og, i sin tur, kan økningen i kalsium øke reaktive oksygenarter (ROS), og ROS kan indusere apoptose [36].
cscs spille en vesentlig rolle i tumorresidiv i kraft av sine forbedrede chemo-resistente egenskaper. Chemo-resistens er manifestert på molekylært nivå av ekspresjon av legemiddel transportører, nemlig den ATP-bindende kassett (ABC) proteiner assosiert med multippel medikamentresistens [40,41]. Videre er det etablert en sammenheng mellom de transkripsjonsfaktorer som regulerer EMT og over-uttrykk for legemiddeltransportører [42]. Følgelig kan den reduserte ekspresjon av medikament-avgivelses proteiner ABCG2 og ABCC4 av S + T behandling reflektere forsterkningen i epitel-egenskaper, og at de to prosesser av EMT og kjemo-resistens kan være sammenknyttet.
i sammendraget, i denne studien gir vi bevis for at endogent uttrykte Wnt antagonist, sFRP4, hjelpemidler i chemo-sensibiliserende glioma stamceller til brukte glioma kjemoterapeutisk middel, temozolomid. Våre data gir innsikt i de molekylære mekanismene bak denne effekten av sFRP4, noe som tyder på at sFRP4 virker gjennom å endre tett sammenvevd og kompleks CSC egenskapene til selvfornyelse, epitelial til mesenchymale overgang, og narkotika effluxing maskiner, som vi har oppsummert i en skjematisk representasjon (S4 fig). Kombinasjonsbehandling av sFRP4 med konvensjonelle kjemoterapeutika vil bidra til å redusere det kjemoterapeutiske lasten, noe som er viktig sett fra et klinisk synspunkt. Våre data antyder at målretting Wnt veien kunne hemme de pro-overlevelsessignaler til cscs innenfor glioma på den ene side, og retardere invasjon og migrering på den andre, for derved å forhindre tumormetastaser og tilbakefall.
Materialer og Metoder
Cell kultur
Menneskelig glioblastom cellelinjer U87 og U373 ble hentet fra Nasjonalt Senter for Cell Sciences, Pune, India og vedlikeholdes i DMEM /F-12 og DMEM-HG (Gibco) (1: 1), som inneholder 1X Glutamax (Life Technologies), 10% Fetal Bovine Serum (HiMedia), og 100U /ml PenStrep (Life Technologies). Serumfritt medium (SFM) for tjeneste-kultur ble utført i basalmedium (DMEM /F-12 + DMEM-HG) med 100 U /mL PenStrep, 2 mM Glutamax, og inneholdende 20 ng /ml hver av epidermal vekstfaktor (EGF), basis fibroblast vekstfaktor (bFGF; R & D Systems), og leukemi-inhiberende faktor (LIF, Chemicon). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktig inkubator med 5% CO
2.
Immunofluorescent flekker
For tidlig karakterisering av CSC markør, CD133, immunfluorescens (IF) farging av kuler avledet fra U87 og U373-cellelinjer dyrket i CSC medium ble utført. For ytterligere analyse av U87 og U373 cscs etter behandling, IF farging ble gjennomført for å undersøke α-SMA, vimentin, og ß-catenin uttrykk som tidligere beskrevet [43], med noen modifikasjoner. I korthet ble cellene fiksert ved bruk av 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved 4 ° C, og blokkert med 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter inkubert i 1 time i mørke ved 4 ° C med primære ikke-merket muse-anti-humane antistoffer mot CD133, α-SMA, vimentin, og P-catenin (1: 200 fortynninger, BD Biosciences), etterfulgt av anti -mouse kanin fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller fykoerytrin (PE) merkede sekundære antistoff (1: 500 fortynninger, Invitrogen) i 1 time ved 37 ° C.
