Abstract
TCTP har vært innblandet i en mengde av viktige cellulære prosesser relatert til cellevekst, cellesyklusprogresjon, malign transformasjon og inhibering av apoptose. I tillegg til disse intracellulære funksjoner har TCTP ekstracellulære funksjoner og spiller en viktig rolle i immunceller. TCTP uttrykk ble tidligere vist å bli deregulert i prostatakreft, men dens funksjon i prostatakreftceller er i stor grad ukjent. Her viser vi at TCTP uttrykket er regulert av androgener i LNCaP prostatakreftceller
in vitro
samt menneskelige prostata kreft xenografter
in vivo
. Knockdown av
TCTP
redusert kolonidannelse og økt apoptose i LNCaP celler, impliserer det som en viktig faktor for prostatakreft cellevekst. Global genekspresjon profilering i TCTP knockdown LNCaP celler viste at flere interferon regulerte gener er regulert av TCTP, noe som tyder på at det kan ha en rolle i å regulere immunfunksjon i prostatakreft. I tillegg er rekombinant TCTP behandlingen økte kolonidannelse i LNCaP-celler tyder på at utskilt TCTP kan fungere som en proliferativ faktor i prostata kreft. Disse resultatene tyder på at TCTP kan ha en rolle i prostatakreft utvikling
Citation. Kaarbø M, Storm ML, Qu S, Wæhre H, Risberg B, Danielsen HE, et al. (2013) TCTP Er en Androgen-regulert Gene innblandet i prostatakreft. PLoS ONE 8 (7): e69398. doi: 10,1371 /journal.pone.0069398
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 02.04.2013; Godkjent: 10 juni 2013; Publisert: 22.07.2013
Copyright: © 2013 Kaarbø et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet med tilskudd fra norsk forskningsråd (Grant # 193337 /V50, www.forskningsradet.no) og norske Kreftforening (Grant # 71395 – PR-2006-0335). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den hyppigste diagnosen non-kutan malignitet og den tredje største årsaken til kreft dødsfall blant menn i vestlige industrialiserte land [1]. Betydningen av androgener for utvikling og progresjon av prostatakreft ble vist tidlig på 20
århundre. Dette resulterte i signifikant fokus på androgener og reseptoren til hvilken de bindes, androgen reseptor (AR) [2], og androgen ablasjon ble hovedlinjen av behandlingen. Selv om AR og androgen action er kritisk viktige aspekter i prostatakreft, har det blitt tydelig at andre signalveier, så vel som ikke-genomiske og genomiske forandringer, er involvert i utvikling og progresjon av prostatakreft (anmeldt i [3]) .
translatorisk kontrollert svulst protein (TCTP) er en mangefasettert faktor som er høyt konservert i en rekke arter. Den ble opprinnelig oppdaget i en mus sarkom cellelinje som et protein regulert på det translasjonelle nivå [4]. TCTP har siden blitt implisert i en rekke viktige cellulære prosesser, så som cellevekst, malign transformasjon og inhibering av apoptose. TCTP er ikke funnet kun i tumorceller, men har en utbredt uttrykk profil som ikke er begrenset til et spesifikt vev eller celletype. Imidlertid er TCTP uttrykk generelt høyere i tumorer sammenlignet med tilsvarende normale vev (oversikt i [5]).
TCTP har en anti-apoptotiske rolle i et antall cellelinjer (oversikt i [6]). TCTP knockout mus er embryonically dødelig med redusert antall celler og en høyere forekomst av apoptose i embryoene, fremhever dens betydning i tidlig utvikling [7], [8]. I tillegg har TCTP blitt vist å binde kalsium [9] – [12]; denne egenskap kan være knyttet til sin anti-apoptotiske aktivitet når konsentrasjonen av fritt intracellulært kalsium er kjent for å øke i løpet av apoptose, utløser en sekvens av hendelser som fører til celledød [13]. TCTP er engasjert i en rekke av protein-protein interaksjoner og binder tubulin, Plk-1, p53 og guanin nukleotid utveksling faktor rheb bl.a. [14]. I tillegg
TCTP
mRNA er meget strukturert og aktiverer PKR, et protein kinase som er involvert i den inflammatoriske respons [15]. Selv om disse studiene gir plausible forklaringer på de mange rapporterte effekter av TCTP, de eksakte mekanismene som TCTP funksjoner gjenstår å bli avgrenset.
TCTP er også et utskilt protein med ekstracellulære funksjoner [16]. Den utskilte formen av TCTP ble opprinnelig identifisert ved sin evne til å fremme histaminfrigivelse fra basofiler i en undergruppe av allergiske donorer og således navngitt Histamine Releasing Factor (HRF) [17]. I tillegg TCTP stimulert B-celle-proliferasjon, induserte ekspresjon av IL-1, IL-6, og immunoglobulinproduksjon i overensstemmelse med en rolle som en B-celle-vekstfaktor [16]. TCTP ikke inneholder en N-terminal signalsekvens er typisk for utskilte proteiner og utskilles gjennom en ikke-klassiske veien involverer exosomes [18]. Interessant, nanovesicles utskilt fra apoptotiske endotelceller som fungerer i en parakrint mote inneholde TCTP, ytterligere utvide modalitet av sin ekstracellulære handling [19].
Nyere studier har identifisert TCTP uttrykk i den menneskelige prostata. TCTP ble funnet å bli uttrykt i prostatiske vev fra mennesker som gjennomgår kirurgi adenomectomy for benign prostatic hyperplasia (BPH) og i cellelinjer avledet fra normal prostata, så som cellelinjen PWR-1E, og prostatakreft [12]. TCTP ekspresjon ble også funnet å være høyere enn andre kalsiumbindende proteiner (CBPs) i det humane prostata. I tillegg analyserer immunohistokjemisk av normal prostata indikerte at TCTP var hovedsakelig uttrykt av de sekretoriske celler luminal og til en mindre grad av basalcellene. TCTP ble også identifisert i prostata fluider, noe som antyder at det kan ha en ekstracellulær rolle i prostata [12]. I tillegg kan TCTP påvirke proliferasjon og levedyktighet i prostata kreftceller [20]. LNCaP-celler ble behandlet med siRNA målretting TCTP indikerte at knockdown av TCTP øker apoptose gjennom kaspase 3 og kaspase 8 og reduserer celleproliferasjon i LNCaP-celler [20]. Videre resultater fra en fersk undersøkelse viser at heat shock protein 27 (Hsp27) samhandler med TCTP i prostatakreftceller og beskytter den mot nedbrytning [21]. I tillegg TCTP uttrykk nivåer korrelert med sykdomsprogresjon, der den ble oppregulert ved kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) [21]. Disse studiene implisere TCTP i prostata kreft; Men det er begrenset informasjon om sin regulering og funksjon i prostatakreftceller.
Her viser vi at TCTP er regulert av androgener, viktige overlevelsesfaktorer for prostata kreft celler samt normal prostata. Ektopisk uttrykk for TCTP og dens knockdown, samt eksperimenter med rekombinant TCTP, viser at det bidrar til cellevekst og spredning, impliserer det som en viktig faktor i prostata kreft.
Materialer og metoder
Etikk Uttalelse
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen Regional, REK Sør-Øst (S-07443a), og materiale fra fremdeles levende pasienter ble inkludert etter sitt skriftlige samtykke. Bruk av materiale fra døde pasienter ble tillatt av etikkomiteen. Dyreforsøk ble godkjent av Case Western Reserve University IACUC retningslinjer. Alle trinn tatt for dyrevelferd og for å minimere lidelse ble ifølge IACUC retningslinjer, og har tidligere blitt beskrevet [22], [23].
Cell Kultur
LNCaP celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS), 2 mM L-glutamin, 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin (Lonza). Den menneskelige bronkial epitelial BEAS-2B cellelinje transformert med SV40 var en generøs gave fra Sten Mollerup (Department of Toxicology, National Institute of Occupational Health, Oslo, Norge) [24]. BEAS-2B-celler ble opprettholdt i LHC-9 medium supplert med 1,8 mg /ml bovint serumalbumin (BSA) på plater belagt med 0,01 mg /ml fibronektin og 0,03 mg /ml bovint kollagen oppløst i PBS.
For begge cellelinjer kulturmediet ble skiftet hver to til tre dager, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2, 95% luftinkubator. For androgen induksjons forsøk ble LNCaP-celler sultet i 48 timer i RPMI 1640 inneholdende 2% trekull-behandlet (CT) -FCS, etterfulgt av ytterligere 24 timer i RPMI 1640 inneholdende 0,5% CT-FCS før behandling med 10
– 8 M R1881 (syntetisk androgen). R1881 ble oppnådd fra NEN.
xenograft Eksperimenter
Transplantation, vekst og innhøsting av tumorer fra mus som bærer CWR22 xenografter var som beskrevet tidligere [22], [23]. CWR22 xenografter dyrket i nakne mus i nærvær av et vedvarende-frigjørings testosteron pellet. Etter tumorvekst, ble mus kastrert, testosteron pelletene ble fjernet og regresjon av tumorene var samlet på 1, 2 eller 4 uker etter kastrering. Dyrene ble plassert og behandlet i henhold til de IACUC retningslinjer.
Kvantitativ PCR (qPCR)
Ved høsting ble totalt RNA ekstrahert fra celler ved hjelp Trizol® reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefalinger. 1-5 ug RNA ble brukt for første-tråd cDNA syntese med Superscript II-systemet (Invitrogen) og oligo-dT primere. qPCR analyser ble utført på LightCycler 480 instrument (Roche) med LightCycler 480 SYBR Grønn Jeg Master mix (Roche). En standardkurve laget av seriefortynninger av cDNA ble gjort for å beregne den relative mengden av target og referanse gen for hver prøve. Disse verdier ble så normalisert til den relative mengde av referanse genet. Primere er tilgjengelig på forespørsel. Forskjellene mellom gruppene ble evaluert ved hjelp av en to-tailed, sammen Student
t-
test, med
P
. 0,05 vurderes som betydelig
Protein Extraction og Western Analyser
Hele celleekstrakter ble fremstilt som tidligere beskrevet [25], løst ved hjelp av SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran (Bio-Rad). Den blottet Membranen ble blokkert i 10% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 0,1% Tween (TBS-Tween) i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med primært antistoff i TBS-Tween inneholdende 5% bovint serumalbumin (BSA) i 14-16 timer ved 4 ° C. Antistoffer mot enten TCTP (1:1000) [12], eller GAPDH (1:500) (Santa Cruz) ble anvendt. Forbedrede Chemiluminescence Western-blotting deteksjons reagenser (Amersham Biosciences) og analysesystem ble anvendt for påvisning av HRP-merkede proteiner. For kvantifisering, vestlige blotter ble digitalisert med en skanner maskin (Epson Perfection V700 Photo) og den optiske tetthet ble målt med programvaren Imagequant TL (Amersham Biosciences). Menneskelig TCTP monoklonalt antistoff var en generøs gave fra gruppen av del Vecchio [12].
RNA interferens
Syntetisk siRNA målretting TCTP (mål sekvens 5’AACCATCACCTGCAGGAAACA-3 «) ble oppnådd fra Dharmacon, mens siRNA for luciferase (target-sekvens: 5»-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3 «) var fra Qiagen. LNCaP-celler ble sådd ut i sin helhet mellom 24 timer før transfeksjon. Mediet ble forandret til RPMI 1640 uten FCS og antibiotika før transfeksjon, og cellene ble transfektert med 100 nM siRNA per brønn ved hjelp av Oligofectamine (Invitrogen) i følge produsentens protokoll.
Colony Forming Assay
LNCaP-celler ble transfektert med siRNA som beskrevet ovenfor, og sådd ut på 10 cm plater ved en tetthet på-100000 celler /brønn. Kolonier ble dyrket i tre uker. LNCaP-celler ble behandlet med rekombinant TCTP ble sådd ved en tetthet på 2500 celler per brønn i en seks-brønns plate i RPMI supplert med 10% FCS. Rekombinant TCTP, GST, eller kjøretøy kontroll ble lagt hver to til tre dager. Kolonidannelse ble vurdert etter to ukers vekst. Celler ble fiksert i metanol ved -20 ° C i 30 minutter, farget med 0,1% krystallfiolett i 20 min og deretter vasket med vann MQ. Området som dekkes av koloniene ble kvantifisert ved hjelp GeneTools programvare fra Syngene.
TUNEL analysen
LNCaP celler ble sådd på cover-slips, sultet og transfektert med siRNA som beskrevet ovenfor. For thapsigargin (TG) induksjon ble cellene enten ble behandlet med vehikkel eller 100 nM TG for de siste 36 timer av den 72 timers transfeksjon periode. For å oppdage apoptose, ble en TUNEL
In Situ
celledød Detection Kit (Roche) brukes i henhold til produsentens instruksjoner. Fluorescens ble påvist ved hjelp av en Axioplan2 bildebehandling mikroskop (Zeiss) og bildene ble tatt med en AxioCam HRc kamera (Zeiss). Antallet TUNEL-positive celler ble uttrykt som en prosentandel av det totale antall celler.
Gene Expression Profilerings
Total RNA fra celler behandlet med siRNA ble isolert ved hjelp av TRIzol® reagens ifølge produsentens instruksjoner og ble analysert ved norsk Microarray Consortium (NMC), Oslo universitetssykehus, Oslo, Norge. RNA ble amplifisert ved hjelp av Illumina® TotalPrep RNA Amplification Kit (Illumina). 500 ng total-RNA ble anvendt i amplifiseringen og merkingsreaksjonen. Kvaliteten av cRNA ble vurdert ved hjelp av en Bioanalyser. Biotin-merket cRNA (1,5 ug) ble deretter benyttet til å hybridisere på Illumina Human-6 v3 Expression beadchips hjelp av hel-genom-genekspresjon direkte hybridiseringsanalyse fra Illumina. Etter skanning, ble resultatene importert til Illumina BeadStudio, der kvaliteten på hver matrise og skanning ble testet.
Generering av og behandling med rekombinant TCTP
Den åpne leseramme (ORF) av hTCTP ble klonet inn i Dyre 28a for uttrykk av rekombinant TCTP. 0,1 mM IPTG ble anvendt for å indusere ekspresjon, og etter innhøsting pelleten ble resuspendert i bindingsbuffer (20 mM NaH
2PO
4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 7,4). Protease-inhibitorer ble tilsatt, og cellesuspensjonen ble sonikert ved 4 ° C. Hans-merket hTCTP ble renset etter innfødte forhold ved hjelp av en HiTrap ™ Chela HP kolonne (GE Healthcare) som belastes med Ni
2 + -ioner i henhold til produsentens instruksjoner. Prøven ble sterilfiltrert og fortynnet med bindingsbuffer før påføring på kolonnen. Kolonnen ble vasket med bindingsbuffer inntil absorbansen (280 nm) stabilisert. Bundede proteiner ble deretter eluert med elueringsbuffer (20 mM NaH
2PO
4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 7,4). Renseprosedyren ble utført ved 4 ° C for å forhindre proteinnedbrytingen. Eluatet ble dialysert mot PBS ved hjelp av Slide-A-Lyzer® 10K dialyse kassetter med en cut-off-verdi på 10 kDa. For å oppnå rekombinant GST, ble pGEX-4T dyrket i BL21-celler indusert med 0,1 mM IPTG og renset ved hjelp av inkubasjon med 50% Glutation Sepharose 4B slurry. Perlene ble vasket med PBS før eluering (50 mM Tris-HCl, 10 mM redusert glutation, pH 8,0). De rensede proteiner ble kjørt sammen med Precision Plus Dual farge Protein Standard, Prestained Protein Markers, Broad Range (7-175 kDa) og uplettet Protein Markers, Broad Range (2-212 kDa) (Biorad) for å anslå hvor mye protein.
BEAS-2B celler ble behandlet med rekombinant TCTP /GST for en time før innhøstingen.
Immunohistochemistry
microarray (TMA) ble fremstilt fra radikal prostatektomi prøver fra pasienter operert på norske Radiumhospital mellom 1988 og 1996, og fulgte opp etter operasjonen. Prostataspesifikt antigen (PSA) målinger ble utført før og etter operasjonen, og ved alle påfølgende klinisk undersøkelse. Oppfølgings perioder varierte fra 2 til 176 måneder (mener, 73,3 måneder). Pasientene ble ansett å ha klinisk tydelig tilbakefall av sykdommen hvis noen av følgende var til stede: (
en
) bevis for lokalt tilbakefall (bekreftet av histologiske biopsier eller ultralyd) eller (
b
) bevis av fjernmetastaser (oppdaget av skjelett scintigrafi og /eller magnetisk resonans imaging). Hvis en pasient som led av tilbakefall hadde postoperativ serum PSA av 4 ng /ml før datoen for enten lokalt tilbakefall eller metastasering, ble datoen for forhøyet PSA angitt som tilbakefall dato. H E-fargede snitt ble laget fra hver av de valgte primærtumor blokk (donor-blokker) av parafin-innleiret materiale for å definere representative tumor regioner. Med bruk av vevet matrise instrumentet (Beecher Instruments) ble to vev sylindre (0,6 mm i diameter) utstanset fra regioner i donor blokken. Kontrollprøver av ikke-kreft-vev fra parafinblokker ble også tatt. Gleason score brukes i analysen var den høyeste Gleason score i hver av de prostatektomi serien.
TMA var første de-paraffinized av xylen og serie etanol fortynninger og vasket i H
2o før slukking av endogen peroksidase i 0,3% H
2o
2 i H
2o i 30 min. Antigen gjenfinning ble utført ved autoklavering ved 121 ° C i 20 minutter i 0,01 M citratbuffer (pH 6,4). Den BioGenex Super Sensitive Link-etikett IHC Detection kit (BioGenex) ble brukt for antigendeteksjon. Seksjonene ble ekvilibrert i TBS-Tween (0,05 M Tris, pH 7,5, 0,3 M NaCl, 0,1% Tween 20) i 5 minutter før inkubering over natten ved 4 ° C med anti-humant TCTP mus monoklonalt antistoff fortynnet i TBS 1:100 Tween med 1% BSA. Snittene ble deretter vasket med TBS-Tween før inkubering med biotinylert sekundært anti imouse IgG (link) i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vask i TBS-Tween, ble det sekundære antistoff ble inkubert med enzym-HRP-merket streptavidin i 30 minutter ved romtemperatur. Objektglassene ble deretter vasket i TBS-Tween og farget med DAB i 5 minutter og reaksjonen ble stoppet i H
2O. Counterstain ble utført av haematoxylin (DAKO) farging og lysbildene ble montert med DAKO Faramount vandig montering medium. Mus non-immunserum ble anvendt som negativ kontroll. Normale prostata vevssnitt ble anvendt som positive kontroller. Intensitet ble scoret ved hjelp av en 0-3 skala, tilsvarende fraværende, svak, moderat og intens farging, henholdsvis. Forskjellene mellom gruppene ble evaluert ved hjelp av en to-tailed, uparede Student
t-
test, med
P
. 0,05 vurderes som betydelig
Statistikk
med unntak av microarray analyser, statistikk ble utført ved hjelp av t-test hvor p-verdiene. . 0,05 ble vurdert som signifikante
Statistisk analyse av genuttrykk data
Statistisk analyse ble utført på grunnlag av sammendrags uttrykk verdier for hver sonde og normalisert ved quantile normaliseringen hvilket resulterer i flisen som har identisk intensitetsfordeling. Dataene ble analysert ved J-Express v2.7 programvare (https://www.molmine.com). Statistisk analyse av mikromatriser (SAM) og Feature Delsett Selection (FSS) ble brukt for statistiske analyser.
Resultater
TCTP Expression er indusert av androgener
Vi først undersøkt mulig regulering av TCTP ekspresjon av androgener hos androgen responsiv prostatacancer LNCaP-cellelinje i et tidsforløp eksperiment. Som vist i
figurene 1A og 1B
, var der en androgen-indusert økning i både TCTP mRNA og protein akkumulering over tid, som nådde omtrent fire ganger høyere nivåer sammenlignet med ubehandlede celler ved 48 timer. For å avgjøre om TCTP uttrykk er også regulert av androgener
in vivo
, brukte vi den menneskelige androgen-avhengige prostatakreft xenograft modell CWR22 som markert går tilbake etter kastrering [22], [23]. Western-analyse av CWR22 tumorer som er samlet fra mus ved forskjellige tidspunkter etter kastrering viste at TCTP ekspresjon signifikant redusert på en tidsavhengig måte og var nesten tapt på fire uker (
figur 1C
). Disse resultatene viser at TCTP uttrykk er regulert av androgener i prostata kreft celler både
in vitro Hotell og
in vivo
.
A. LNCaP-celler var enten ubehandlet eller behandlet med det syntetiske androgen R1881 (10
-8 M) i de angitte tidsrom. Totalt RNA ble isolert og qPCR analyser ble utført.
TCTP
mRNA uttrykk var normalisert til
GAPDH
. Grafen illustrerer en representant eksperiment utført i tre eksemplarer med feilfelt som indikerer ± SEM, uttrykket nivåer står i forhold til celler behandlet uten androgen (satt til 1). Forsøket ble gjentatt mer enn tre ganger B. Western-analyser ble utført på fullcelle-ekstrakter fremstilt fra celler behandlet i fravær eller nærvær av R1881 (10
-8 M) for de angitte tidspunkter. Uttrykket nivåer ble normalisert til GAPDH. De presenterte verdiene står i forhold til ubehandlede prøver (satt til 1). Grafen viser data fra to eksperimenter utført i tre eksemplarer med feilfelt illustrerer ± SEM. C. CWR22 xenografter dyrket i nakne mus og tumorprøver ble samlet enten før (T = 0) eller 1, 2 og 4 uker etter kastrering. Totale celleekstrakter ble laget og anvendt for Western blot-analyser. Figuren viser en representant blot for TCTP og GAPDH, med relative verdier av TCTP (t = 0 sett til en) normalisert til GAPDH. Forskjellene mellom gruppene ble evaluert ved hjelp av to-tailed, paret t-test sammenlignet med ikke-behandlede prøver, med P 0,05 vurderes som betydelig. Betydning er merket med en stjerne; en stjerne indikerer P 0,05, to stjerner indikerer P. 0,01
knockdown av TCTP Reduserer Colony Forming av LNCaP celler
Androgen regulering av TCTP uttrykk, som vist ovenfor, foreslått at det kan ha en rolle i veksten av prostata kreftceller. Dette kan enten være gjennom induksjon av proliferasjon eller inhibering av apoptose, eller en kombinasjon av begge. For å undersøke den mulige rolle TCTP i cellevekst, ble dets ekspresjon hemmet i LNCaP-celler etter behandling siRNA og kolonidannelse ble bestemt sammenlignet med kontroll siRNA behandlede celler. Som vist i figur 2A, ble TCTP proteinekspresjon redusert med 85% etter 72 timer med transfeksjon med siRNA målretting TCTP. Kolonidannelse av TCTP knockdown-celler ble redusert med 50% sammenlignet med kontrollceller (figurene 2B og 2C). Disse data indikerte at TCTP kan ha en rolle i LNCaP-celleformering og /eller levedyktighet.
A. siRNA mediert knockdown av
TCTP
i LNCaP celler. LNCaP celler ble transfektert med siRNA (100 nM) rettet mot enten
Luciferase (Luc)
eller
TCTP
. På angitte tidspunkter ble cellene høstet, ble proteinekstrakter fremstilt og analysert ved hjelp av Western-analyse. Antisera dannet mot TCTP og GAPDH ble brukt etter hverandre på samme blott. B. LNCaP-celler ble transfektert med 100 nM siRNA målretting
Luc
eller
TCTP
, utsådd i 10 cm plater og analysert for kolonidannelse evne ved krystallfiolett farging etter tre ukers vekst. Representative bildene vises. C. Kvantifisering av kolonidannelse av LNCaP celler etter siRNA mediert knockdown av TCTP. Diagrammet viser to forsøk in triplo. Forskjellene mellom gruppene ble evaluert ved hjelp av to-tailed, paret t-test i forhold til Luc-siRNA behandlet prøvene, med *: P 0,05 indikerer signifikant forskjell
nedregulering av TCTP øker. apoptose av LNCaP-celler
TCTP ble tidligere rapportert til å inhibere apoptose i et antall cellelinjer [20], [26] – [28]. I tillegg RNAi-mediert knockdown av TCTP i LNCaP-celler aktivert kaspase 3 og kaspase 8, en indikasjon på økt apoptose [20], [21]. Vi undersøkte derfor hvilken rolle TCTP på apoptose i LNCaP celler. Tidligere arbeid fra vårt laboratorium har fastslått at Thapsigargin (TG) induserer betydelig apoptose etter 36 timers behandling i LNCaP celler [25]. Vi dermed avgjøres om TCTP kan endre TG-indusert apoptose. LNCaP-celler ble transfektert med enten siRNA mot TCTP eller kontroll (Luciferase) siRNA, og deretter blir behandlet eller utsatt for TG, hvoretter graden av apoptose ble bestemt ved anvendelse av TUNEL-analysen. Som vist i figur 3A og 3B, i fravær av TG behandling, var det en omtrent tre-gangers økning i apoptose i TCTP knockdown-celler sammenlignet med kontrollceller. Som forventet, TG betydelig økt apoptose i både kontroll eller TCTP-siRNA behandlede celler, men det var omtrent 2,5 ganger høyere på TCTP knockdown. Knockdown av
TCTP
ble verifisert ved qPCR for alle forsøkene (data ikke vist). Disse data tyder på at TCTP er involvert i regulering av apoptose i prostatakreftceller.
LNCaP cellene ble dyrket på Dekk og transfektert med siRNA mot
TCTP
eller
Luciferase (Luc)
i 72 timer. Apoptose ble indusert ved 100 nM TG i 36 timer under siRNA behandling. Etter behandling og fiksering, ble apoptotisk celledød påvises ved å bruke TUNEL-analysen, ble cellekjerner farvet med DAPI og celler ble visualisert ved anvendelse Axioplan avbildning mikroskop. A. Representative bilder av LNCaP celler transfektert med enten
TCTP Anmeldelser – eller
Luc
-siRNA i 72 timer og behandlet med DMSO eller TG i 36 timer under transfeksjon. Tunel positive celler vises som røde flekker. Pilene viser apoptotiske celler. B. Kvantifisering av apoptose forekomst. Dataene viser prosentandelen av levedyktige celler etter 36 timers behandling med TG i celler transfektert med
TCTP
eller
Luc siRNA
. Kolonnene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter utført in triplo og søylene representerer ± SEM med *: P 0,05 indikerer signifikant forskjell
Nedregulering av TCTP Resultater i oppregulering av immunresponsgener i LNCaP-celler.
for å belyse trasé TCTP kan påvirke i prostatakreftceller, gjennomførte vi en global genekspresjon profilering i TCTP knockdown celler sammenlignet med kontroll LNCaP celler. Betydelig TCTP knockdown ble bekreftet både mRNA og proteinnivå (data ikke vist). Dataene ble analysert ved hjelp av to metoder: den statistiske analysen av mikromatriser (SAM) og Feature Subset utvalg (FSS) verktøy implementert i J-Express [29]. Ut fra de 15 mest signifikant regulerte gener bestemt ved hver analyse, ble ni funnet å være signifikant ved begge metoder, som illustrert i Venn-diagrammet i figur 4A. Figur 4B viser opp- eller nedregulering av noen av genene, mens en oversikt over de mest signifikant regulerte gener i matrisen, deres ontology, kjent funksjon og definisjon er vist i figur 4C. Flertallet av genene anslått til å være betydelig reguleres ved TCTP knockdown er involvert i den interferon signalveien og /eller immun-relaterte reaksjoner. Uttrykket av seks av disse genene (IFIT1, SLITRK3, IFI44L, IFIT3, OAS2 og MX1) ble validert ved qPCR (figur 5A-F). Disse resultatene antyder at TCTP modulerer immunresponser i prostatakreftceller.
LNCaP celler ble transfektert med siRNA mot
TCTP
eller
Luciferase
i 72 timer, RNA ble isolert og brukt i global genekspresjon profilering som beskrevet i materialer og metoder. A. Venn-diagram av genene som er betydelig regulert av genuttrykk profilering. B. Heatmap representasjon av gener opp- eller nedregulert i respons til
TCTP
knockdown. Rød og grønn representerer opp- og downregulated gener, henholdsvis. C. Liste over de ti mest betydelig regulert gener med sine tiltredelses tall, definisjon og ontologi prosessen som de er involvert i. Foldendring forhold til
Luciferase
siRNA behandlede cellene er indikert.
A-F. qPCR ble brukt for å vurdere ekspresjon av gener som forutsagt til å være forskjellig uttrykt i celler transfekterte med Luc-siRNA versus TCTP-siRNA. MRNA uttrykk var normalisert til
GAPDH Hotell og ble beregnet i forhold til Luc-siRNA prøver (satt til 1). Forsøk ble utført i tre eksemplarer. Alle feilfelt representerer ± SEM. Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av to-tailed, paret t-test med *: P 0,05 og **: P 0,01 vurderes som betydelig
Rekombinant TCTP induserer Prostate Cancer Cell Vekst
utskilte formen av TCTP har tidligere blitt vist å indusere ekspresjon av flere mediatorer, initiere distinkte signalhendelser og føre til en økning i celle-proliferasjon av immunceller [30] – [32]. Siden TCTP er tilstede i prostata fluider [12], kan det ha en ekstracellulær funksjon i prostatakreftceller. For å vurdere denne muligheten, har vi gjort rekombinant TCTP (rTCTP) i
E. coli
og bestemmes sin biologiske aktivitet i BEAS-2B-celler sammenlignet med rekombinant glutation S-transferase (rGST) som en kontroll [33]. BEAS-2B-celler ble behandlet med rTCTP eller rGST ved en endelig konsentrasjon på 1,0 ug /ml i 1 time og
IL-8
mRNA-produksjon ble bestemt ved qPCR.
IL-8
mRNA-ekspresjon ble betydelig øket i celler behandlet med rTCTP sammenlignet med celler behandlet med rGST (figur 6A) som indikerer at rTCTP er biologisk aktive. LNCaP-celler ble deretter behandlet med 1,0 ug /ml rTCTP eller rGST og en kolonidannelsesbestemmelsen ble utført. Etter to uker i kultur med kontinuerlig eksponering for de rekombinante proteiner, ble cellene fiksert og farget for å visualisere kolonier. Som vist i figurene 6B og 6C, var det et signifikant høyere antall kolonier dannet av celler behandlet med rTCTP sammenlignet med rGST-behandlede celler. Disse data indikerer at rTCTP har en proliferativ /pro-overlevelse effekt på LNCaP-celler og foreslår en rolle utskilt TCTP i prostatacancer-cellevekst.
A. BEAS-2B-celler ble behandlet med rekombinant TCTP eller GST (rTCTP og rGST) til en endelig konsentrasjon på 1,0 ug /ml, total-RNA ble ekstrahert, cDNA syntetisert og qPCR utført. GAPDH ble brukt som en referanse-gen og verdiene presentert står i forhold til GST (satt til 1). B. kolonidannelse assay i LNCaP-celler ble behandlet med rTCTP eller rGST. Celler ble dyrket i nærvær av rTCTP eller rGST ved en endelig konsentrasjon på 1,0 ug /ml for to uker, og koloniene som ble dannet ble visualisert med 0,1% krystallfiolett. Området som dekkes på hver plate av koloniene ble målt og representert som prosent av totalarealet av platen. C. To representative bilder vises. Eksperimentet ble utført på triplikate tre ganger. Feilfelt representerer ± SEM. Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av to-tailed, paret t-test. Betydning er angitt med stjerne, P . 0,05
TCTP Expression er oppregulert i prostatakreft i forhold til normal prostata
Siden TCTP er uttrykt i normal prostata, samt regulert av
