Abstract
Ikke-småcellet lungekreft husing epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) mutasjoner oppnår en meningsfull respons på EGFR-tyrosinkinasehemmere (TKI). Imidlertid kan ervervet resistens mot EGFR-TKI påvirke langsiktig utfall i nesten alle pasienter. For å identifisere potensielle resistensmekanismer, etablerte vi cellelinjer som er resistente mot EGFR-TKI fra den menneskelige lungekreft cellelinjer PC9 and11-18, som næret aktive EGFR mutasjoner. En erlotinib-resistent cellelinje fra PC9 og to erlotinib-resistente cellelinjer og to gefitinib-resistente cellelinjer fra 11-18 ble etablert uavhengig av hverandre. Nesten fullstendig tap av mutant delE746-A750 EGFR-genet ble observert i erlotinib-resistente celler isolert fra PC9, og delvis tap av den mutante L858R EGFR-genet kopi ble spesielt observert i erlotinib- og gefitinib-resistente celler 11-18. Imidlertid konstitutiv aktivering av EGFR nedstrøms signalering, PI3K /Akt, ble observert selv etter tap av det muterte EGFR-genet i alle resistente cellelinjer, selv i nærvær av stoffet. I erlotinib-resistente celler fra PC9, ble konstituerende PI3K /Akt aktivering effektivt hemmet av lapatinib (en dual TKI av EGFR og HER2) eller BIBW2992 (pan-TKI av EGFR familien proteiner). Videre erlotinib med enten HER2 eller HER3 knockdown av sine beslektede sirnas også hemmet PI3K /Akt aktivering. Transfeksjon av aktiverende mutant EGFR komplementært DNA gjenmedikamentsensitivitet i erlotinib-resistent cellelinje. Vår studie viser at tapet av avhengighet til mutant EGFR resulterte i gevinst på avhengighet til både HER2 /HER3 og PI3K /Akt aliserte til erverve EGFR-TKI motstand
Citation. Tabara K, Kanda R, Sonoda K, Kubo T, Murakami Y, Kawahara A, et al. (2012) Tap av Aktivering EGFR muterte genet Bidrar til ervervet Motstand mot EGFR tyrosinkinasehemmere i lungekreft celler. PLoS ONE syv (7): e41017. doi: 10,1371 /journal.pone.0041017
Redaktør: Yiqun G. Shellman, University of Colorado, USA
mottatt: 21 februar 2012; Godkjent: 15 juni 2012; Publisert: 17.07.2012
Copyright: © 2012 Tabara et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Grants-i-aid for Scientific Research på Prioriterte områder (Cancer) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan og ved tredje Term omfattende kontroll Forskning for Cancer fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferd, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er en av de mest utbredte ondartet kreft og en ledende dødsårsaken i verden. Utvikling av kreftmedisiner som er rettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) har forbedret behandling av NSCLC. To representative EGFR-tyrosinkinasehemmere (EGFR-TKI), gefitinib og erlotinib, har en felles kinazolin struktur og er godkjent for behandling av progressiv NSCLC. Både erlotinib og gefitinib vise lignende kinase hemming selektivitet basert på kvantitativ analyse av små molekyl-kinase interaksjon kart for 38 kinase hemmere [1], og viser terapeutisk effekt mot progressive NSCLC pasienter [2] – [4].
de mest vanlige aktiverende EGFR mutasjoner er i leseramme delesjon i exon 19 (delE746-A750) og punktmutasjonen erstatte leucin med arginin i kodon 858 fra exon21 (L858R) [5] – [9]. Disse to store mutasjoner står for 85-90% av alle mutasjoner og forbedre den terapeutiske effekten av EGFR-målrettede medikamenter [10] – [13]. Videre disse aktiverende mutasjoner fått avhengighet til EGFR i lungekreftceller, noe som resulterer i økt mottakelighet for EGFR-TKI som gefitinib og erlotinib [6], [14] -. [16]
Et alvorlig problem med EGFR -TKI behandling er utseendet av resistente svulster. For ervervet resistens, sekundær mutasjon i EGFR-genet T790M [16] – [18], eller alternativt EGFR-uavhengig aktivering av cellevekst signalveier inkludert c-Met aktivering er velkjent [19], [20]. Tapet av PTEN uttrykk er en av de oppkjøpte resistente mekanismer, som ble demonstrert ved å isolere gefitinib-resistente mutanter fra PC9 celler som havn aktiverende mutasjon av EGFR [21], [22]. I tillegg til de veldefinerte årsaker til legemiddelresistens i lungekreftpasienter, er belysning av ytterligere mekanisme for ervervet resistens avgjørende for utviklingen av nye EGFR-målrettede medikamenter.
I denne studien, erlotinib- og gefitinib -resistente cellelinjer ble etablert fra to humane lungekreftcellelinjer, PC9 celler husing delE746-A750 mutasjon og 11-18 celler husing L858R mutasjon, henholdsvis. Overraskende ble det delvis eller fullstendig tap av det muterte genet EGFR kopi observert i erlotinib- og gefitinib-resistente cellelinjer. Den kliniske betydningen av tap av mutant EGFR er drøftet i forhold til sin nære tilknytning til kjøp av narkotika motstand mot EGFR-TKI i NSCLC.
Materialer og metoder
Cell Culture Reagenser og
humane lungekreftcellelinjer, PC9, QG56 og 11-18 ble dyrket i RPMI-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), som beskrevet tidligere [14], [21]. PC9 og QG56 ble vennlig levert av Dr. Yukito Ichinose (National Hospital Organization Kyushu Cancer Center, Fukuoka, Japan), og 11-18 var av Dr. Kazuhiko Nakagawa (Kinki University, Osaka, Japan). Erlotinib ble vennlig levert av F. Hoffman-La Roche Ltd, gefitinib var av Astrazeneca Inc. BIBW2992 ble kjøpt fra Selleck Chemicals, SU11274 og Wortmannin var fra Calbiochem, LY294002 var fra Cell Signaling Technology og Lapatinib var fra Toronto Research Chemicals. Anti-HER2 og anti-fosfor-HER2-antistoffer ble kjøpt fra Upstate Bioteknologi, Anti-fosfor-EGFR, anti-EGFR, anti-fosfor-HER3, anti-fosfor-c-Met, anti-fosfor-Akt, anti-Akt, anti-PTEN, anti-fosfo-ERK1 /2, anti-ERK1 /2, og mutasjonsspesifikk (L858R i exon 21 og delesjon E746-A750 i ekson 19) antistoffer var fra Cell Signaling Technology, anti-HER3 og anti-c -Met-antistoffer var fra Santa Cruz Biotechnology, anti-α-tubulin-antistoff var fra Sigma-Aldrich, og anti-GAPDH-antistoff var fra Trevigen. Komplementære DNA (cDNA) for EGFR og aktivere mutant EGFR ble vennlig levert av Dr. Willam Pao og Dr. Nishio. Cellene ble transfektert med cDNA ved hjelp Lipofectamine LTX, PLUS reagens og Opti-MEM (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefalinger. Rekombinant humant EGF ble kjøpt fra Peprotech. De små interfererende RNA (siRNA) som tilsvarer HER2 (5′-AAACGUGUCUGUGUUGUAGGUGACC-3 «), HER3 (5′-GGCAGUGUAUAAUCUAUCUCCACUA-3′) og PIK3CA (5»-CCCUAUUGGUGGUGUUACUGGAUCAAAU-3 «) ble innkjøpt fra Invitrogen, og som svarer til EGFR (5»-GAGGAAAUAUGUACUACGA-3 «) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich. Cellene ble transfektert med siRNA tomannsboliger ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX og Opti-MEM (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefalinger.
cytotoksisitetsassayer
eksponentielt voksende cellesuspensjoner ble sådd i hver brønn og påfølgende dag indikerte konsentrasjoner av de forskjellige stoffer ble tilsatt. Etter inkubasjon i 72 timer ble cytotoksisitet bestemt som tidligere beskrevet [21].
Western blot-analyse
Celler ble skylt med iskald PBS og lysert i Triton X-100 buffer (50 mmol /L HEPES, 150 mmol /l NaCl, 50 mmol /l NaF, 1% Triton X-100 og 10% glycerol, inneholdende 5 mmol /l EDTA, 1 mmol /l fenylmetylsulfonylfluorid, 10 ug /mL aprotinin og 10 ug /ml leupeptin, og 1 mmol /l natrium ortovanadat), og proteiner fra cellelysater ble separert ved SDS-PAGE og overført til Immobilon-membraner (Millipore Corp.), som beskrevet tidligere (21). Etter overføring ble membranene inkubert i blokkeringsløsning, probet med de forskjellige antistoffer, vasket, og visualisert ved hjelp av pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer (GE Healthcare) og forsterket kjemiluminescens-reagens (Amersham).
A, Western blot analyse som viser ekspresjonen av pEGFR, EGFR, pHER2, HER2, pHER3, HER3, pc-Met, c-Met, PTEN, pakt, Akt, pErk1 /2, og ERK1 /2-proteiner, og α-tubulin som en lasting kontroll. B, Eksponensielt voksende PC9 og PC9 /ER1-celler ble utsatt for forskjellige doser av erlotinib i 5 timer, og etterfulgt av Western blot-analyse. C, eksponentielt voksende 11-18, 11-18 /ER1-7, og 11-18 /ER2-1 celler ble eksponert for ulike doser av erlotinib i 5 timer, og etterfulgt av Western blot analyse.
menneskelig RTK arrays
Proteome Profiler menneske fosfor-RTK antistoff arrays (R R
h (test) = M x (X /Y), hvor M er et allel avhengig konstant som kommer fra forskjellene i PCR-amplifikasjon effektivitet, merking effektivitet, og formen på toppen, mellom vill-type og mutante alleler. Tilsvarende R
h av en lik-del blanding av testceller og referanse, R
h (mix), er gitt i den følgende ligning.
Fra de to ligninger ovenfor, X og Y blir oppnådd som følger.
ligningene ovenfor implisere at absoluttkopitall av mutant allel i de testede cellene ikke kan beregnes, fordi M er ukjent. Imidlertid kan relative verdier av kopitallet for det samme mutant allel i forskjellige testceller beregnes, fordi M er en konstant.
A, Western blot som viser ekspresjon av delE746-A750 EGFR og total EGFR i PC9 og PC9 /ER1 celler. B, Påvisning av villtype og mutasjonssekvenser ved hjelp av spesifikke primere. PC9 celler viser både villtype og mutant-spesifikke bånd, mens PC9 /ER1, 11-18, og QG56 cellene vise bare villtype-spesifikke bånd. Mut, mutant exon19, og WT, vill-type exon19. C viser PCR-analyse heterodupleks (Mut /WT) og homoduplex (vekt /vekt og Mut /Mut) i PC9 celler, og bare homoduplex (vekt /vekt) i PC9 /ER1 celler, 11-18 celler husing L858R mutasjon, og QG56 celler som vill-type EGFR.
A, Western blot-analyse ved bruk av L858R-spesifikt antistoff og total EGFR-antistoff som gjenkjenner både villtype og mutant EGFR. Expression nivåer av mutant EGFR (L858R), total EGFR og L858R versus total EGFR (L858R /total EGFR) er normalisert ved deres uttrykk nivåer i 11-18 celler. Western blot-analyse med primære humane endotelceller (HUVEC) viser ekspresjon av total EGFR, men ikke mutant L858R EGFR. B, leser DNA-sekvenser av 15 baser rundt den L858R mutasjon i 11-18, 11-18 /ER1-7, og 11-18 /ER2-1 celler blir sammenlignet. Piler indikerer base på 2573. Merk at nucleotide av 11-18 på 2573 var G /T heterozygote. C, PLACE-SSCP analyse av DNA-prøver av 11-18, 11-18 /ER1-7, og 11-18 /ER2-1 celler i fravær eller nærvær av like mengder DNA fra humane vaskulære endotelceller (HUVECs) er vist. To topper viser villtype (WT) og mutant (Mut) EGFR-gen (a). Basert på ligningene vist i Materialer og metoder, kopiere antall endringer av villtype og mutant EGFR genene er estimert (b).
PCR analyse
For å analysere mutasjon sletting , exon 19 av EGFR-genet ble amplifisert ved anvendelse av følgende PCR forover primere:
villtypespesifikke, 5′-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAG-3 «mutant spesifikk, 5′-TCCCGTCGCTATCAAAACATC-3′ både villtype og mutant type, 5»-ATGTGGCACCATCTCACAATTGCC-3 «reverse primer 5′-CCACACAGCAAAGCAGAAACTCAC-3» og Takara ExTaq polymerase.
for å analysere sletting mutasjon, exon5 og åtte av PTEN genet ble forsterket ved hjelp av de følgende PCR forover primere : exon5, 5′-CTCTGGAATCCAGTGTTTCTTT-3 «exon8, 5′-GCAACAGATAACTCAGATTGCC-3» reverse primer. exon5, 5’CCAATAAATTCTCAGATCCAGG-3 «exon8, 5′-GTTCTTCATCAGCTGTACTCCT-3»
For å analysere sletting mutasjon, Akt gen ble forsterket ved hjelp av de følgende PCR fremover primere: 5′-GGGTCTGACGGGTAGAGTGT-3 «reverse primer: 5′-GCGCCACAGAGAAGTTGTT-3»
pasient~~POS=TRUNC
Vi valgte primære NSCLC. skjuler EGFR mutasjoner, som ekson 19 delE746-A750 og ekson 21 L858R punktmutasjon fra EGFR mutasjonsstatus registreringer av Institutt for diagnostisk patologi, Kurume universitetssykehus, Kurume, Japan. Disse EGFR mutasjons status poster hadde blitt bestemt av DNA direkte sekvensering eller PNA-LNA PCR klemme analyse [27], [28].
cytologisk Prøver fra kreftpasienter
Celleprøver ble innhentet fra pleural effusjon (5 tilfeller), lymfeknute tynn nål aspirasjon cytologi (2 tilfeller), perikardialeffusjon (1 sak), og cerebrospinalvæsken (3 tilfeller), ifølge en tidligere studie [28]. Pleural effusjon og spinalvæske ble sentrifugert ved 1500 rpm i 10 minutter, og den overliggende væske ble fjernet. Sedimentet ble smurt på glassplater, og ble løst i 95% etanol over natten. Tynn nål aspirasjon cytologi av lymfeknuter ble utført ved hjelp av en 23-gauge engangsnål festet til en 10 ml plastsprøyte, og raset ble løst over natten i 95% etanol.
farging for aktivering EGFR mutasjoner
immunofarging analyse ble utført ved hjelp av anti-EGFR delE746-A750 spesifikke (6B6), EGFR L858R Mutant-spesifikk (43B2), og total EGFR (D38B1) antistoff (Cell Signaling Technology) som tidligere beskrevet [27].
Etikk erklæringen
studiet av kliniske prøver ble godkjent av etisk komité Kurume University.
A, B, eksponentielt voksende PC9 og PC9 /ER1 celler ble eksponert for ulike doser av Wortmannin (A) og LY294002 (B) i 5 timer, og etterfulgt av Western blot-analyse. C. PC9 og PC9 /ER1 celler ble behandlet med PIK3CA siRNA eller krafse (SC) siRNA i 48 timer, og etterfulgt av western blot analyse.
Resultater
Etablering av Erlotinib- og Gefitinib-resistente cellelinjer fra PC9 og 11-18 Cells
For å isolere erlotinib-resistente cellelinjer fra PC9 celler som delE746-A750, og fra 11-18 celler som L858R, begge cellelinjene ble dyrket i trinnvis økende doser av erlotinib fra 0,05 til 10 uM, i omtrent 6 måneder, som tidligere beskrevet [21]. Deretter ble cellene uavhengig valgt fra hverandre erlotinib-resistent cellelinje fra hvert plastskål, for å ekspandere klonalt en erlotinib-resistent cellelinje, PC9 /ER1, fra PC9 celler, og to erlotinib-resistente cellelinjer, 11-18 /ER1- 7 og 11-18 /ER2-1, fra 11 til 18 celler, henholdsvis. Videre gefitinib-resistente cellelinjer ble også uavhengig av hverandre og isolert klonalt ekspandert (11-18 /GEF10-1 og 11-18 /GEF20-1) fra 11-18 celler. Dose responskurver av resistente cellelinjer og foreldre motstykke til erlotinib eller gefitinib viste oppkjøp av resistens mot disse stoffene i ulike resistente underlinjer (figur S1).
A, eksponentielt voksende PC9 og PC9 /ER1 cellene utsatt for forskjellige doser av erlotinib i 5 timer, og etterfulgt av western blot analyse. B, C, D, PC9 og PC9 /ER1-celler ble behandlet i 48 timer med 10 nM krafse (sc) siRNA, 2 nM, eller henholdsvis 10 nM EGFR siRNA, HER2 siRNA eller HER3 siRNA, og etterfulgt av Western blot-analyse.
A, PC9 /ER1 celler ble behandlet med eller uten 1fiM erlotinib, og fem mikrometer lapatinib i 5 timer, og fulgt Western blot analyse. B, PC9 /ER1 celler ble behandlet med 10 nM sirnas av Scrumble og EGFR familie gener, og utsatt for erlotinib (1 mm) eller BIBW2992 (1 mm) i 5 timer, og fulgt Western blot analyse.
A, PC9 /ER1 celler ble transfektert med del EGFR (E746-A750) cDNA, og fulgt inkubasjon i ulike dager. Western blot analyse ble utført med antistoffer som gjenkjenner del EGFR og total EGFR. B, var doseresponskurver av mock- og aktivert mutant EGFR cDNA transfektanter av PC9 /ER1 bestemmes av cytotoksisitet analysen. Hver verdi er gjennomsnittet av tredoble retter ± SD. C, 11-18 /ER1-7-celler ble transfektert med L858R EGFR cDNA, og etterfulgt av Western blot-analyse med et spesifikt antistoff av L858R EGFR. D, Dose responskurver av mock- og aktiverte mutante EGFR cDNA transfektanter av 11-18 /ER1-7. Hver verdier er gjennomsnittet av tredoble retter ± SD.
PC-9 /ER1 celler viste 160-250 ganger høyere motstand mot erlotinib og gefitinib, fem ganger høyere motstand mot lapatinib på det meste, og om 2000 ganger høyere motstand mot BIBW2992 (tabell 1). 11-18 /ER1-7, 11-18 /ER2-1, 11-18 /GEF10-1, og 11-18 /GEF20-1 celler viste 20-110 ganger høyere motstand mot erlotinib og gefitinib og syv ganger høyere motstand mot lapatinib og BIBW2992 på de fleste (tabell 1). På den annen side, alle disse resistente celler viste lignende overfølsomhet for SU11274 og cisplatin som foreldre kolleger (tabell 1).
Uttrykk av vekstfaktor reseptor og deres Aktivering Status i Erlotinib-resistente cellelinjer Etablert fra PC9 og 11-18 Cells
Western blot analyse viste det mest slående forskjellen i fosforylering av EGFR uten markert endring i fosforylering status for HER3, c-Met, Akt og ERK1 /2 mellom PC9 og PC9 /ER1 celler. På den annen side var forholdsvis lavere fosforylering av EGFR sett i 11-18 /ER1-7 og 11-18 /ER2-1 celler enn 11-18 celler (figur 1A).
neste sammenaktiveringsstatusen av flere reseptortyrosinkinaser inkludert c-Met, Axl, PDGFR og IGF1R som ble overuttrykt i svulster med EGFR mutasjoner mellom erlotinib-resistente underlinjer og deres kolleger ved hjelp av fosfor reseptortyrosinkinasehemming (RTK) matrise [29]. Imidlertid var det ingen forskjell i aktiveringsstatusen til disse vekstfaktorreseptorer inkludert c-Met mellom medikamentsensitive og resistente cellelinjer (figur S2).
Total EGFR-antistoff farget alle fire histologiske og cytologiske prøver. Anti-delE746-A750 antistoff farget bare kreftceller med den delE746-A750-mutasjonen (A, tilfelle 1) (se tabell 2), og EGFR-L858R antistoff farget bare kreftceller med L858R mutasjoner (B, Ved 9) i begge histologisk og cytologiske prøver. Ingen flekker var tydelig av både EGFR delE746-A750 og EGFR L858R antistoffer i kreftceller uten aktiverings EGFR mutasjoner i cytologiske prøver (C: Ved 6 og D: case 11)
Akt. fosforylering er blokkert Ikke ved erlotinib i erlotinib-resistente cellelinjer
Vi undersøkte neste effekten av erlotinib på fosforylering av EGFR, Akt, og ERK1 /2 i erlotinib-resistente cellelinjer og deres foreldre kolleger (Figur 1B og 1C). I PC9 celler, EGFR, Akt, og ERK1 /2-fosforylering ble alle inhibert på en doseavhengig måte ved erlotinib. Men det var nesten ingen hemming av Akt fosforylering i PC9 /ER1 celler av erlotinib, men ERK1 /2 fosforylering ble på samme måte hemmet som i PC9 celler (Figur 1b). På den annen side ble EGFR fosforylering funnet å være ekvivalent trykkes på 11-18, 11-18 /ER1-7, og 11-18 /ER2-1 celler ved erlotinib. Imidlertid, sammenlignet med 11-18 celler, Akt-fosforylering i 11-18 /ER1-7 og 11-18 /ER2-1-celler ble ikke hemmet av erlotinib. I motsetning ERK1 /2 fosforylering var svært følsom overfor erlotinib i alt 11-18, 11-18 /ER1-7, og 11-18 /ER2-1 celler (figur 1C). Oppkjøp av erlotinib-resistens utgjør således konstituerende PI3K /Akt fosforylering i resistente celler fra PC9 og 11-18 celler.
fullstendig tap av Aktivering Mutant EGFR (delE746-A750) Gene i Erlotinib-resistente PC9 /ER1 Cells
Vi neste undersøkt EGFR status i PC9 /ER1 celler. Western blot analyse ved hjelp av anti-delE746-A750, L858R, og totalt EGFR antistoffer viste fullstendig tap av mutant EGFR protein uttrykk i PC9 /ER1 celler (figur 2A). Deretter ble genet profilen av villtype og mutant EGFR mellom PC9 og PC9 /ER1 celler sammenlignet. Den direkte sekvensanalyse av exon 19 av EGFR-genet viste fullstendig tap av bare den mutante sekvens i PC9 /ER1-celler (data ikke vist). Deretter ble utført PCR-analyse i exon 19 av EGFR-genet ved hjelp av villtype og mutasjonsspesifikke primere. PC9 celler inneholdt både villtype og slettingsmutasjon sekvenser, noe som indikerer heterozygote alleler for villtype og mutant EGFR, mens det var bare en villtypesekvensen i PC9 /ER1 celler (figur 2B). Exon 19 av EGFR-genet ble ytterligere forsterket, og analysen av disse DNA-prøvene i gelen gående viste tilstedeværelse av bare villtypesekvensen i exon 19 av EGFR-genet i PC9 /ER1 celler, selv om PC9 celler inneholdt både sletting og villtypesekvensen (figur 2C). Tatt sammen, PC9 /ER1 celler viste fullstendig tap av mutant EGFR-genet ved erverv av resistens overfor erlotinib.
Cell spredning og overlevelse av menneskelige lungekreft celler som aktiveres mutant EGFR (PC9 og 11-18 celler ) nært avhenge av EGFR-drevet PI3K /Akt vei, og denne spredningen /overlevelse er svært utsatt for erlotinib og andre EGFR TKI. Først, det er delvis eller fullstendig tap av mEGFR genet allel i narkotika-resistente cellelinjer, og deretter få av avhengighet til HER2 /HER3 og PI3K /Akt signalisering (PC9 /ER1 celler). Men det kreves mer definitive analyse på resistente cellelinjer av 11-18 fordi 11-18 resistente cellelinjer viser bare delvis tap av mEGFR.
delvis tap av Aktivere Mutant EGFR (L858R) Gene i Erlotinib- eller Gefitinib-resistente cellelinjer fra 11-18
Vi ytterligere sammenlignet uttrykk nivåer av villtype EGFR og mutant EGFR av et spesifikt antistoff som gjenkjenner L858R mutant EGFR av western blot analyse. Sammenlignet med foreldre 11-18 celler, uttrykk for mutant L858R EGFR-proteinet var relativt lavere versus total cellular EGFR nivåer (figur 3A).
Vi neste undersøkt om aktivering mutant EGFR-genet i 11-18 /ER1- 7 og 11-18 /ER2-1 celler ble påvirket av oppkjøpet av erlotinib motstand eller ikke. DNA-sekvensanalyse viste tilstedeværelse av mutasjonen (L858R) både i de paren og resistente celler (figur 3B, pilene viser nukleotid 2573), selv om veksling av topphøyder på nukleotid 2573 var åpenbare. Endret forholdet mellom vill-type mutant til EGFR-genet ble også observert ved PLACE-SSCP-analyse [23], [24], som eksemplifisert i figur 3C. Denne analyse viste to uavhengige topper, en for vill-type og en annen for mutant EGFR-genet, både i 11-18 og erlotinib-resistente celler. Imidlertid topphøydeforhold (Rh) av de to resistente cellelinjer var klart forskjellig. Ved å ta i bruk å blande strategi, det vil si å blande DNA fra HUVECs bære 2 kopier av villtype-EGFR-genet med det av resistente celler, kan endringen i kopiantallet av den allele kvantifiseres som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene indikerte om en reduksjon av den mutante EGFR-genet 50% uten tilsynelatende forandring av EGFR-genet kopivilltype (figur 3C).
Vi undersøkte også om utvalg av medikamentresistens til gefitinib også induserte tilsvarende endringer av redusert ekspresjon av den aktiverende EGFR-genet. To gefitinib-resistente cellelinjer, 11-18 /GEF10-1 og 11-18 /GEF20-1, viste økt EGFR protein uttrykk med relativt redusert uttrykk av HER2 og pHER2 i forhold til foreldre 11-18 celler (Figur S3A). Som sammenlignet med foreldre 11-18 celler, Akt-fosforylering i 11-18 /GEF10-1 og 11-18 /GEF20-1 ble ikke påvirket av gefitinib når fosforylering av EGFR og ERK1 /2 ble likeledes hemmet av gefitinib (figur S3b) . Western blot-analyse med anti-L858R-antistoff viste redusert ekspresjon av det mutante EGFR og lignende uttrykk for den totale EGFR i to resistente cellelinjer sammenlignet med 11-18 celler (figur S3C). Deretter utførte vi DNA sekvensanalyse og fant en vekslende topphøyde på nukleotid 2573 i gefitinib-resistente celler (Figur s3D). PLACE-SSCP-analyse avslørte også en redusert mutant EGFR-genet kopi uten åpenbare endringer i villtype-EGFR-genet kopi, og kvantitativ analyse som indikerer om en reduksjon av den mutante EGFR-genet 50% i gefitinib-resistente celler (figur S3E). Fra disse analysene av erlotinib- eller gefitinib-resistente cellelinjer, kan kjøp av narkotika motstand bli formidlet gjennom en redusert mutant EGFR-genet kopi.
knockdown av HER2 eller HER3 sensitizes konstitutiv aktivering av Akt å Erlotinib i PC9 /ER1 Celler
det var nesten fullstendig tap av mutant EGFR-genet i PC9 /ER1 mens det var bare delvis tap av det mutante genet i EGFR erlotinib-resistente cellelinjer avledet 11-18. Vi videre analysert mer i detalj noen mekanisme underliggende tilegnelsen av erlotinib motstand i PC9 /ER1. Vi undersøkte effekten av PI3K hemmere, Wortmannin og LY294002 på Akt aktivering i PC9 og PC9 /ER1 celler (figur 4A og 4B). Begge PI3K hemmere samme måte hemmet fosforylering av Akt, noe som indikerer at aktivert Akt er like utsatt for både hemmere i PC9 /ER1 og PC9 celler. Vi har også bekreftet bestemt undertrykkelse av Akt aktivering i både PC9 og PC9 /ER1 celler ved behandling med PIK3CA siRNA (Figur 4C). Videre sekvensanalyse viste at det ikke var noen mutasjon i hot spots i PIK3CA, PTEN og Akt genet (data ikke vist). Den konstituerende Akt aktivering i PC9 /ER1 synes ikke å skyldes endret PI3K /Akt veien selv.
Vi endelig undersøkt hvilke molekyler blant EGFR, HER2 eller HER3 kunne være ansvarlig for det konstituerende Akt aktivering i erlotinib bestandig PC9 /ER1 celler. Vi fant fosforylering av HER3 ble ikke undertrykt av erlotinib i PC9 /ER1 forhold til PC9 (figur 5A). Vi undersøkte om knockdown av EGFR, HER2 eller HER3 av sine beslektede sirnas kunne modulere aktivering av Akt og EGFR familie proteiner. Knockdown av EGFR resulterte i markert redusert aktivering av Akt bare i PC9 celler, men ikke i PC9 /ER (figur 5B). På den annen side, kan knockdown av HER3 undertrykke aktivering av Akt i både PC9 og PC9 /ER (figur 5D). Videre aktivering av HER3 ble markert trykt av HER2 knockdown bare i PC9 /ER (figur 5B). Disse resultatene tyder på at HER3 sammen med HER2 signalisering er ansvarlig for konstitutiv aktivering av PI3K /Akt i ervervet resistens overfor erlotinib i PC9 /ER.
Vi videre undersøkt om lapatinib, en dual kinase inhibitor av EGFR og HER2, kunne undertrykke Akt aktivering i PC9 /ER1. Behandling med lapatinib hemmet fosforylering av Akt og HER3 mens erlotinib ikke (Figur 6A). Vi neste undersøkt effekten av erlotinib eller en pan-tyrosinkinasehemmer av alt EGFR familie, BIBW2992 [30], på Akt fosforylering i PC9 /ER1 når hver EGFR, HER2 eller HER3 ble stille (figur 6B). Fosforyleringen av HER2, HER3 og Akt ble alle undertrykket ved BIBW2992 alene. På den annen side ble fosforyleringen av Akt inhibert ved erlotinib med enten HER2 eller HER3 knockdown. Videre HER2 knockdown resulterte i en markant hemming av HER3 fosforylering, som tyder på at PC9 /ER1 celler få avhengighet til HER2 /HER3 signalering (figur 6B).
Vi endelig undersøkt om uttrykk for aktivering mutant EGFR kunne gjenopprette narkotika følsomhet som erlotinib i resistente cellelinjer, PC9 /ER1 og 11-18 /ER1-7. Transient transfeksjon av del (E746-A750) EGFR cDNA indusert økt uttrykk av aktivert mutant EGFR i PC9 /ER1 (figur 7A). Overekspresjon av del (E746-A750) EGFR cDNA vant resistens overfor erlotinib i PC9 /ER1 (figur 7B). Videre transfeksjon av en annen aktivert mutant L858R EGFR cDNA også indusert forbedret uttrykk (figur 7C) og restaurert medikament følsomhet overfor erlotinib i 11-18 /ER1-7 celler (figur 7D).
Tap av Aktivering Mutant EGFR i ildfast ikke-småcellet lungekreft
Figur 8 viser representative IHC bilder for villtype, delE746-A750, og L858R EGFR uttrykk i primærlungekreft vev (Figur 8, hver øvre panel), og også kreft celler i pleural effusjon eller spinalvæske i gående pasienter etter behandling med gefitinib (figur 8, hvert nedre panel). Som vist i tabell 2, ut fra 11 pasienter som først mottok gefitinib etter lungekirurgi og viste regelmessighet, 8 pasientene hadde delE746-A750-mutasjonen og 3 hadde L858R mutasjon i sitt primære lungesvulster. Fire hadde T790M mutasjon i formidling eller metastatiske cytologiske prøver. Av 11 pasienter, ildfaste 2 av de 8 tilfellene som hadde næret den delE746-A750 viste tap av aktiverings EGFR-mutasjonen, og en av de 3 tilfeller som hadde næret L858R viste tap av den aktiverende mutasjoner (tabell 2). I ett tilfelle (sak 6), ble det observert både T790M mutasjon og villtype EGFR uttrykk. Det var ingen uenighet mellom ekspresjon av EGFR mutasjon-spesifikke antistoffer, og påvisning av EGFR mutasjoner ved sekvensanalyse ved anvendelse av PNA-LNA PCR klemme assay i alle prøver som ble testet i denne undersøkelsen.
diskusjon
Aktivering EGFR mutasjoner, som delE746-A750 og L858R, forårsake lungekreft celler tett par EGFR med celleproliferasjon eller overlevelse [5], [6], [15].
