Abstract
Ufrivillig vekttap hos pasienter med kreft er kjennetegnet av kreft kakeksi. Årsakene til kakeksi er multifaktoriell involverer tap av skjelettmuskulatur og fettvev forbundet med høye systemiske nivåer av akuttfaseproteiner og inflammatoriske cytokiner. Mens muskelsvinn åpenlyst virkninger på kreft pasientens livskvalitet, tap av lipid depoter representerer en vedvarende energi ubalanse. I denne studien fett uttømming ble undersøkt i Colon-26 modell av kreft kakeksi, som er en mye brukt gnager-modell av dette syndromet. Vi undersøkte dagaktive uttrykk for døgnrytme regulatorer samt viktige formidlere av energi metabolisme og cytokin signalering. Mus som bærer C26 svulst utstilt redusert fettmasse, lipolyse forhøyet fettvev og en fem-ganger økning i plasmanivåer av frie fettsyrer. Disse endringene var assosiert med aktivert IL-6 signal i WAT gjennom en 3-ganger økning i fosforylert STAT3 og høy SOCS3 genuttrykk nivåer. I tillegg forstyrrelser i døgnrytmen regulering av lipid metabolisme ble også observert. Lipid katabolisme synes ikke å bli påvirket av den klassiske PKA veien aktivere lipase HSL. ATGL protein nivåer ble hevet to ganger i cachectic mus mens 4-dobling fosforylert ACC og en to-fold reduksjon i fosforylert 4EBP1 ble observert indikerer at lipid metabolisme er modulert av ATGL AMPK /mTOR veier. Denne studien gir bevis for aktivering av cytokin signalisering og samtidige endringer i døgnrytme og regulatorer i lipidmetabolismen i WAT av cachectic dyr
Citation. Tsoli M, Schweiger M, Vanniasinghe AS, Painter A, Zechner R, Clarke S, et al. (2014) Nedbryting av Hvit fettvev i Cancer kakeksi syndrom er assosiert med inflammatorisk Signalering og Forstyrret Circadian forordning. PLoS ONE 9 (3): e92966. doi: 10,1371 /journal.pone.0092966
Redaktør: Harpal Singh Randeva, University of Warwick – Medical School, Storbritannia
mottatt: 29 oktober 2013; Godkjent: 27 februar 2014; Publisert: 25 mars 2014
Copyright: © 2014 Tsoli et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Cancer Institute NSW translasjonsforskning program stipend for tykktarmskreft. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Cachectic Colon 26 celler ble vennlig levert av Amgen. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft kakeksi syndrom (CCS) er ofte oppleves av avanserte kreftpasienter er mest utbredt i bukspyttkjertelen, øvre gastrointestinale og lunge kreft og står for nesten 20% av kreftrelaterte følgesykdommer [1], [2]. Foreløpig er det ingen effektive behandlinger eller prognostiske tester for å indikere de pasientene i fare for å utvikle kakeksi. CCS er en kompleks stoffskiftesykdom karakterisert av ufrivillig vekttap, fettvev og skjelettmuskel utarming, anoreksi og tretthet. Kakeksi er ofte assosiert med systemisk inflammasjon angitt med forhøyet plasma CRP og reduserte nivåer av albumin [3]. I tillegg cachectic kreftpasienter opplever ofte økt toksisitet under cellegift /strålebehandling fører til redusert livskvalitet og påfølgende dårlig overlevelse [4], [5]. Selv om den eksakte mekanismen er ennå ikke helt klarlagt, er det allment akseptert at økte nivåer av cytokiner som interleukin-6 (IL-6), tumor nekrose faktor (TNF) og andre faktorer som sink-alpha2-glykoprotein (ZAG) utløse den katabolske hendelser som fremmer lipid uttømming fra fettdepoter og asteni [6], [7], [8]. Spesielt har IL-6 er implisert i utviklingen av kakeksi i tumor-bærende gnagermodeller og tap av fettvev hos kreftpasienter [9], [10], så vel som direkte stimulerer lipolyse hos voksne [11]. Colon-26 (C26) karsinom er en veletablert murin modell av kreft kakeksi resulterer i høye systemiske nivåer av IL-6. Administrering av legemidler som hemmer IL-6 signale forhindre sløsing og andre trekk ved kakeksi i flere dyremodeller av kakeksi inkludert Colon 26 [12], [13], [14].
I tillegg til å virke som en isolator og lipid reservoar i perioder med metabolske krav, rollen av hvite fettvev (WAT) strekker seg til nevroendokrine kontroll av energihomeostase, appetitt og immune /inflammatoriske responser. Mens mobilisering av lipider fra adipocytter å levere energi til andre organer under fasting /kalori begrensning er den primære funksjon av WAT, det er også involvert i utskillelsen av adipokines og cytokiner, med mange adipokines utviser døgnlige variasjoner i plasma som kan påvirke appetitt, energi utgifter og reproduksjon [15]. Motsatt distale organer kontrollere lipolytic vs lipogenic trasé i WAT via hormoner og cytokiner å regulere lipid metabolske veier og dermed oppnå hele kroppen energibalanse. Derfor tap av WAT masse under utviklingen av kakeksi vil påvirke flere organsystemer utover svekket bestemmelse av energirike lipider.
sekresjon og aktivitet av dagaktive regulatorer av stoffskiftet er knyttet til kroppens eget endogene klokke for å matche nærings forsyning med aktivitetssykluser og miljømessige signaler [16]. Sentral kontroll av døgnrytmen er mediert av suprachiasmatic kjernen som en auto-reguleres molekylær feedback mekanisme som involverer BMAL /klokke regulatorer og Per /Cry target proteiner driver å utøve nevrale regulering på klokkefunksjonene i perifere organer. En ekstra feedback loop involverer kjernefysisk reseptor Rev-erbα, som også spiller en viktig rolle i adipogenesen. Molekylær analyse av WAT funnet at ~ 20% av adipose transkriptomet viser en rytmisk dagaktive uttrykk mønster [17]. Faktisk er mange atomtranskripsjonsfaktorer slik som peroksisom proliferator-aktiverte reseptorer (PPAR), så vel som de viktigste energi homeostatisk regulator AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) og metabolske enzymer (lipoprotein lipase-LPL) oppviser svingnings profiler som angir komplekse interaksjoner mellom circadian klokke, energibalanse og miljømessige signaler [18]. Circadian dysregulering er forbundet med økt risiko for metabolsk syndrom omfattende fedme, insulinresistens og kardiovaskulær sykdom [19], [20]. Musemodeller av genetisk manipulerte biologiske klokke komponenter Bmal eller Clock displayfunksjonene metabolsk syndrom-lignende fenotyper eller forgår henholdsvis [21], [22]. Videre har kliniske studier vist økt risiko for fedme og dens samtidige sykdommer i nattskift og jet-lagged arbeidere [20], [23].
Tidligere studier har funnet at hvitt fettvev er en av de første organer til bli påvirket i løpet av kreft kakeksi med WAT uttømming ofte tydelig i fravær av åpen mager kroppsmasse tap [9]. Tap av fettvev blir mediert overveiende av økt lipolyse forbundet med en hypermetabolsk tilstand og til en viss grad redusert fettdeponering [24], [25], [26]. Mobilisering av lipidreserver i fettvev i løpet av kakeksi er mediert av fettvev triglycerid lipase (ATGL), og hormonsensitiv lipase (HSL) [24]. Den kritiske rollen som ATGL spiller i kreft kakeksi ble markert med ikke bare bevaring av fettmasse, men også mangel på skjelettmuskelsvinn, i ATGL mangelfull mus med kreftkakeksi-induserende Lewis lungekarsinom eller B16 melanomer [24]. Selv om disse studiene utvide vår forståelse av bidraget disse lipaser gjør i fettvev integritet i kreft, så vel som andre metabolske tilstander [27], signaleringsmekanisme som setter i gang fettlaget i kakeksi forblir dårlig forstått, [28], [29]. Flere spørsmål forblir ubesvart i forhold til hypermetabolsk funksjoner – spesielt økt lipolyse – tilsynelatende i kreft kakeksi. Hva er sammenhengen mellom økt lipolyse og systemisk inflammasjon assosiert med kreft kakeksi? Er økt cytokin signale operativ i løpet av fettvev utarming? Hvordan er dagaktive uttrykk for master-regulatorer av døgnrytmen og lipidmetabolisme berørt under kreft kakeksi? Er de normale dagaktive nivåer av viktige sensorer og formidlere av ernæringsstatus og lipidmetabolisme endret i WAT?
I denne studien undersøkte vi effekten av cachectic colon-26 carcinoma på hvitt adipocyte dagaktive rhythmicity og funksjon. Denne murine modellen av kreft kakeksi har blitt mye brukt til å studere kakeksi som den oppviser lignende funksjonelle og metabolske nedsatt til den kliniske tilstanden [30]. Vi karakterisert spesifikt diurnal ekspresjon av gener som er viktige for døgnrytmen kontroll og lipid metabolisme, så vel som av aktiveringstilstanden av viktige regulatorer av energihomeostase på to motstående tidspunkter i diurnal syklus. Vi viser bevis for cytokin-signalisering gjennom komponenter av IL-6 signalkaskade – STAT3 og SOCS3. I tillegg rapporterer vi at stimulering av det lipolytiske veien i WAT av kakeksi mus er forbundet med økt ATGL og perilipin snarere enn via PKA /HSL. Våre data identifiserer potensielle krysstale mellom AMPK, mTOR og 4EBP1 som viktige formidlere av endret fettmetabolismen i kreft kakeksi.
Materialer og metoder
Cell Culture and Animal Studies
de kreftkakeksi-induserende Colon 26 celler (C26) er en muse kolon adenokarsinom og ble vennlig gitt som en gave av Amgen (USA) [31]. C26-celler ble dyrket og opprettholdt i RPMI-medium (Invitrogen) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) og 100 ug /ml penicillin /streptomycin (Invitrogen) i en 5% CO
2 miljø. Patogen-frie, 10-12 uker gamle BALB /c * DBA2 (F1 hybrid) mus ble innkjøpt fra ARC, Perth (Australia), og holdt ved en omgivelsestemperatur på 22 ° C under en 12-timers lyssyklus (lys på 6:00 til 6:00). Colon 26-celler ble inokulert subkutant på 1 x 10
6 celler /100 ul i den høyre flanken til mus. Kontroll mus ble injisert med 100 ul av RPMI-medium inneholdende antibiotika. Over en periode på 14 dager etter inokulering, ble kroppsvekt, matinntak og tumor dimensjoner målt daglig. Tumorbærende og fri-matet kontroll mus hadde
ad libitum
tilgang til mat. En gruppe av kontrollmusene var pair-matet å matche den daglige matinntaket av cachectic C26-lagergruppe. Pair-foring ble oppnådd ved å gi ikke-tumorbærende kontrollmus matinntaket av tilsvarende C26-tumorbærende dyr. Mus ble euthanazed ved cervikal dislokasjon før høsting epididymal adipose vev som ble hurtigfrosset i flytende nitrogen. Dyreforsøk ble utført i henhold til den australske anbefalingen for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål under forsøksdyr forordning (2005) av NSW. Virkningen av tumorvekst og utvikling av kakeksi på dyrevelferd ble vurdert, med egnede tiltak for å overvåke og lindre lidelse gjennomført under protokollen # 2007/006 godkjent av Animal Welfare Committee of Sydney South-West-området Health Service.
Evaluering av kakeksi og biokjemisk analyse
Fjorten dager etter tumorcelle inokulering, ble musene bedøvet med ketamin /xylazin og euthanazed etter blodsamlingen ved hjertepunktering. Nettovekten av skrottene ble målt. Epididymal fett ble samlet, veiet og deretter lagret ved -80 ° C inntil bruk. Aliquoter av plasma erholdt fra blodet hos hver mus ble holdt frosset inntil videre analyse. Den ikke-forestrede fettsyrer i plasmaet til dyrene ble kakektiske bestemt enzymatisk ved bruk av NEFA C-kit (Wako Pure Chemicals /Novachem, Collingwood, VIC, Australia). Den triglyserid-innholdet i plasma av kakeksi indusere C26 bærende dyr ble bestemt ved hjelp av den kliniske Automater analysator (Roche Modular E170) å følge produsentens instruksjoner (Roche).
fettvev Histologi og Mikros
WAT prøvene ble fiksert i 10% formalin nøytral bufret oppløsning (Sigma-Aldrich), innstøpt i parafin voks, og 5 um seksjoner kuttet og montert på objektglass. Etter dehydrering, ble seksjonene farget med hematoksylin-eosin (H /E) for histologisk undersøkelse ved lysmikroskopi og CAST grid programvare (Olympus Corp., Albertslund, Danmark). Morfologisk analyse ble utført vev oppnådd fra 4 dyr per gruppe (kontroll, C26-bærende mus og par matet). Areal og omkrets ble beregnet fra ca 5-8 forskjellige synsfelt per bilde som gir totalt gir 250 per dyr dvs. 1000 adipocytter per forsøksgruppe.
lipolyse av Isolated WAT Organ kulturer
gonadale fettputer ble kirurgisk fjernet og vasket flere ganger med PBS. Tissue stykker (~15 mg) ble for-inkubert i 2 timer i DMEM i nærvær eller i fravær av 25 pM Hi-76-0079 (Novo Nordisk) ved C37 ° C, 5% CO
2, 95% fuktig atmosfære. Deretter ble mediet erstattet med DMEM inneholdende 2% BSA (fettsyre-fri) enten i nærvær eller i fravær av 10 uM forskolin og 25 uM Hi-76-0079 og inkubert i ytterligere 60 minutter ved 37 ° C. Porsjoner av mediet ble fjernet og analysert for FFA og glyserol innhold ved hjelp av kommersielle kits (HR-serien NEFA-HR (2), Wako Diagnostics). For protein bestemmelser, ble fettputer vasket grundig med PBS og lysert i 0,3 N NaOH /0,1% SDS. Protein-målinger ble utført ved anvendelse av BCA-reagens (Pierce).
Kvantitativ Real-Time PCR-analyse
Total RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Første-tråd cDNA ble syntetisert fra total RNA ved hjelp av Superscript III med tilfeldige primere (Invitrogen) og oligo (dT) 12-14 (Invitrogen). Alle primer sekvenser ble sprengt mot NCBI musen genomisk sekvens database for å sikre spesifisitet for tilsvarende genet. Primersekvensene er vist i tabell S1. qPCR reaksjoner inneholdt 1,25 ng cDNA, 300 nM genspesifikke primere og 12 ul SybrGreen (Invitrogen). Alle reaksjoner ble utført ved hjelp av Corbett Rotor Gene 6000 (Corbett Life Science). Relative mRNA nivåer ble beregnet ved sammenlignende terskelen syklusen metoden ved å bruke
36B4
,
Tfrc Hotell og
Hmbs
gener som renhold kontrollene.
Western blotting
Hel-celle ekstrakter fra fettvev ble oppnådd ved hjelp av RIPA Lysis Buffer supplert med fosfatase og proteasehemmere (Roche) ved hjelp av et glass homogenisator og konsentrert med sentrifugale filter enheter i henhold til produsentens protokoller (cellesignalisering Technologies, Millipore) og ble deretter kvantifisert ved BCA protein syre analysesett (Pierce). Proteiner (20 ug) ble løst i 10% Tris-HCl-geler (Bio-Rad), og blottet (iBlot, Invitrogen) som beskrevet av produsenten. Cellelysater ble analysert med følgende primære antistoffer: kanin anti-fosfo-P44 /42-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) -Thr202 /Tyr204, kanin anti-P44 /42-MAPK, kanin anti-fosfo-p38 MAPK-Thr180 /Tyr182, kanin-anti-p38 MAPK, kanin anti-signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3), kanin-anti-fosfo-STAT3-Ser727, kanin anti-ATGL kanin anti-hormon-Sensitive lipase (HSL), kanin-anti -phospho-HSL-Ser563, kanin anti-acetyl-CoA-karboksylase (ACC), kanin anti-perilipin, kanin anti-AMP-aktiverte protein kinase α (AMPKα), kanin anti-fosfor-AMPKα-Thr172, kanin anti-raptor , kanin anti-pattedyr målet for rapamycin (mTOR), kanin-anti-fosfo-mTOR-Ser2481, kanin anti-eukaryote translasjonsinitieringssete faktor 4E-bindende protein 1 (4EBP1), kanin-anti-fosfo-4EBP1-Thr37 /46, kanin anti -phospho-4EBP1-Thr70, kanin anti-fosfo-4EBP1-Ser65, kanin-anti-3-hydroksyacyl-CoA-dehydrogenase (EHHADH /PBE) og kanin-anti-beta-aktin. Alle anti-fosfo primære antistoffer ble fortynnet 1:500 mens de resterende antistoffer ble fortynnet 1:1000. Proteinene ble visualisert ved hjelp av geit anti-kanin-HRP sekundært antistoff (1:2000) og vest-femto kit (Pierce). Bortsett fra EHHADH (Abcam) resten av antistoffer ble oppnådd fra Cell Signaling Technology.
Statistical Analysis
Data er presentert som gjennomsnitt verdier ± S.E.M.. Statistiske analyser ble utført med uparede Student t-tester. Analyse mellom 3 grupper (kontroll, tykktarm-26 og paret matet) ble utført ved anvendelse av enveis Anova post hoc test Tyrkia. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant ved P . 0,05
Resultater
Effekt av C26 Carcinoma på Epidydimal Hvit fettvev
Colon26 karsinom er en veletablert modell av kreft kakeksi hos mus som utviser betydelig vekttap, muskelsvinn, fett utarming og gradvis reduksjon av matinntak 14 dager etter tumor implantat. Etter avtale med tidligere rapporter, ble massen av epididymal WAT betydelig redusert i forhold til gratis-matet og pair-matet kontroller (Figur 1a). Vi undersøkte om dette dramatisk reduksjon i fettvev masse var tydelig på mikroskopisk nivå. Haematoxylin /eosin farging viste betydelige morfologiske endringer. Hvite adipocytter fra kontrollmusene vises enkle sekskantede-formet lipid vakuoler som var mindre i par-matet dyrene, og dukket opp mer sfærisk i cachectic mus (Figur 1B-D). Morfometrisk analyse viste en signifikant reduksjon i tverrsnittsareal og perimeter av hvite adipocytter fra C26 kakektiske mus sammenlignet med ytterligere
ad lib
og par-matede, ikke-tumorbærende kontrollmus (Figur 1E-1F). Reduksjonen i WAT vekt ble fulgt av en økning i plasma ikke-forestrede fettsyrer (NEFA) i cachectic mus (figur 1G) og en reduksjon av plasma triglyseridnivåer (figur 1 H). For å undersøke bidraget av lipaser til mobilisering av triglyserider fra fettvev, bestemt vi lipid mobilisering aktivitet WAT explants. Frekvensen av frie fettsyrer (FFA) utgivelse var fem ganger høyere i WAT av C26 cachectic mus sammenlignet med kontroll ikke-tumorbærende mus (figur 1i) med en tilsvarende økning i glyserol frigjøring (figur 1J). Tilsetningen av HSL-spesifikke inhibitor (Hi 76-0079) bare marginalt redusert FFA frigivelse som indikerer at ATGL er den dominerende lipase ansvarlig for fettvev lipolyse (figur 1I). For å vurdere effekten av kakeksi på total lipid hydrolytiske kapasitet etter hormonstimulering, var WAT vev behandles med forskolin. En ytterligere økning av FFA frigivelse var tydelig for både kontroll- og C26 kakektiske mus, med cachectic mus oppnår en maksimal hastighet av FFA produksjon av 250 nmol /t * mg protein, sammenlignet med 100 nmol /t * mg i kontrollmusene (fig. 1K) . Glyserol utgivelsen viste også en høyere maksimal hastighet i C26 versus kontroll mus etter stimulering av WAT explants med forskolin (Figur 1L) indikerer en høyere lipolytic kapasitet på WAT explants fra C26 cachectic mus.
(A) epididymal adipose tissue vekter fra cachectic dyrene på dag 14 etter tumorinokulasjon (
*** P 0,001,
¥¥¥ P 0,001 vs pair-fed); (C-E) Hematoxylin og eosin farging og (B-F) kvantifisering av adipocyte størrelse fra cachectic og pair-matet mus. (G) sirkulerende nivåer av ikke-forestret frie fettsyrer i plasma av cachectic dyr (* P 0,05; vs kontroll); (H, I) av fri fettsyre (FFA) og glycerol-frigjøring fra WAT eksplantasjoner oppnådd fra kontroll og C26 tumor-bærende mus i henhold til basal betingelser i nærvær og i fravær av HSL inhibitor Hi 76-0079; (J, K) av fri fettsyre (FFA) og glycerol-frigjøring fra WAT eksplantasjoner henhold til forskolin stimulerte betingelser i nærvær eller i fravær av Hi-76-0079. For A, verdier presentert som gjennomsnitt ± standardavvik i 8-10 dyr pr gruppe. For B, C og D representative bilder som vises fra H E-bilder tatt fra 4 dyr per gruppe. For E og F-verdier er presentert som som gjennomsnitt ± standardavvik for 4 dyr per gruppe. Rundt 250 adipocytter ble regnet per dyr gi totalt 1000 adipocytter fra hver gruppe. G og H verdiene er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. for 4 dyr per gruppe. For I-K-verdier er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. for 5 dyr per gruppe.
Aktivering av IL-6 signalveien i C26 kakeksi
cytokiner som IL-6 synes å være viktige drivere for den vinn prosess i denne kreft kakeksi modellen [12]. For å avgjøre om aktiv cytokin signalering er tilstede i adipocytter fra cachectic mus vi undersøkte dagaktive mRNA uttrykk for SOCS3, og fosforylering av STAT3 (figur 2). Transkripsjonsnivåer av SOCS3 mRNA ble betydelig økt ved alle tidspunkter i cachectic mus. Det ble også forbedret fosforylering av STAT3 protein (Ser727) i nærvær av C26 tumoren. Disse data viser aktiv signalisering nedstrøms for den IL-6 reseptor i WAT av kakeksi mus som kan påvirke lipid metabolske veier i kakektiske mus.
diurnal mRNA-ekspresjon av SOCS3 mRNA i hvitt adiposevev fra kontrollmus (hvit sirkel) og cachectic mus (svart firkant) (
* P 0,05,
** P 0,01,
*** P 0,001 vs kontroll). 6 am verdier er duplisert i grafen for å illustrere dagaktive rhythmicity. mRNA-ekspresjon verdier er gjennomsnitt ± S.E.M. i forhold til kontroller for 4-6 dyr per gruppe. Western blot og densitometrisk analyse av STAT3 protein og fosfor-STAT3 (Ser727), i hvitt fettvev fra cachectic og kontrolldyrene.
Effect of Cancer kakeksi på Døgnvariasjoner Expression Pattern av lipogenese Pathway
for å undersøke virkningen av kreft kakeksi på
de novo
syntese av fettsyrer i WAT vi undersøkt dagaktive uttrykk profilen til metabolske gener og atomtranskripsjonsfaktorer som er involvert i lipogenese. Lipoprotein lipase (LPL) er et viktig enzym som er involvert i TG hydrolyse av lipoproteiner for å frigjøre fettsyrer for opptak i cellene. I kontrollmus dets transkripsjonsnivåer viste ingen døgnrytme mens i kakektiske mus ekspresjonsnivåer ble betydelig dempet ved de fleste tidspunkter (figur 3). Sammen med
Lpl
, uttrykk for
Ap2
ble redusert mens
CD36
ble ikke endret i WAT av cachectic mus indikerer en viss grad av undertrykkelse i opptak eller intracellulær håndtering av fett syrer (Figur S1). PPAR er den dominerende atomtranskripsjonsfaktor som regulerer lipid metabolisme i adipocytter. I kontroll mus,
PPAR Kjøpe og tilhørende målgener
Fas Hotell og
DGAT2
toppet seg under lyset syklus, mens i svulsten bærende cachectic dyr rhythmicity gikk tapt, og mRNA nivåer ble markant redusert på de fleste tidspunkter. Tilsvar
Scd1
utstilt redusert mRNA uttrykk i cachectic mus. C /EBPα er viktig for adipogenese og normal adipocyttfunksjon. I kontroll mus
C /ebpα
viste ikke en dagaktive uttrykk mønster mens i cachectic mus transkripsjonsnivåer ble betydelig redusert i løpet av dagen. Interessant direkte sammenligninger på genuttrykket nivåer for
Fas Hotell og
C /ebpα
mellom pair-matet mus og cachectic mus indikerte signifikante forskjeller på 2 am tidspunkt indikerer at lipid syntese kan hovedsakelig påvirket under kakeksi og ikke så mye i løpet av kalori begrensning.
mRNA analyse av
PPARy
,
C /ebpα
,
Lpl
,
Fas
,
Scd1
,
DGAT2
, isolert fra WAT av kontroll (hvit sirkel), og C26-bærende mus (svart firkant); Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik presentert som prosenter i forhold til kontrollene for 4-5 dyr per gruppe (* P 0,05, ** P 0,01; *** P 0,001 C26 vs kontroll). 6 am verdier er duplisert i hver graf for å illustrere en komplett 24-timers syklus.
PKA-indusert Lipolytiske Pathway er ikke forbedret i Cancer kakeksi
Stimulering av FFA løslatelse fra triglyserid var antas å være i hovedsak mediert via protein kinase A (PKA), som direkte phosphorylates perilipin og hormon sensitiv lipase (HSL) og påvirker også adipose triglyserid lipase (ATGL), om enn indirekte. Men nyere studier har identifisert AMPK-mediert fosforylering av ATGL og interaksjoner med CGI-58 som avgjørende for maksimal ATGL hydrolase aktivitet [27]. Vi vurderte om lipolyse er formidlet gjennom PKA sti under uttømming av WAT i kreft kakeksi. Som vist i figur 4A, observerte vi en liten nedgang i fosforylert PKA og totale PKA nivåer på 2 am, mens på 14:00 ingen åpenbare endringer ble observert mellom kontroll og cachectic dyr (Figur S2). mRNA uttrykk nivåer dukket redusert mens total og fosfor-HSL proteinnivået uendret på enten tids tidspunkt under kreft kakeksi. Interessant på genuttrykk nivå ble det ikke observert signifikante endringer mellom kontroll og pair-matet mus (Figur S3), mens på proteinnivå, observerte vi økt fosforylering i både PKA og HSL på 2 am (Figur S3). Perilipin er en sentral lipid belegg protein for fett dråpedannelse og er direkte påvirket av PKA. Vi undersøkte om kreft kakeksi påvirket mRNA og proteinnivåer perilipin og fant ingen åpenbar døgnrytme i transkripsjonsnivåer av perilipin i kontroll mus, mens uttrykket ble redusert i cachectic dyr (figur 4B). Men Western analyse viste økt nivå av perilipin protein ved begge tidspunkter (Figur 4C, Figur S2). ATGL er den kritiske lipase som initierer det første trinnet i triglyserid degradering. Vi observerte ikke døgn rhythmicity i uttrykket av dette genet, og det var ingen innvirkning på ATGL mRNA under kreft kakeksi. Men Western analyse avslørte økt ATGL protein nivå for begge tidspunkter i WAT fra C26 tumorbærende dyr (Figur 4, Figur S2). I likhet med den tilsynelatende uoverensstemmelse i perilipin protein og mRNA-nivåer, synes det som ATGL er hovedsakelig regulert ved et post-transkripsjonsnivået i kakeksi. Disse data indikerer at i løpet av sent stadium kakeksi, fettmobilisering fra WAT for C26 mus ikke er indusert av PKA reaksjonsveien for å stimulere HSL-mediert lipolyse, men er assosiert med økt ATGL protein.
(A) mRNA-analyse av
Hsl
genekspresjon og Western blot analyse av fosfor-PKA (Thr197), total PKA, fosfor-HSL og totale HSL proteiner på 2 am og 14:00; (B) mRNA analyse av
Atgl Hotell og
Perilipin
genuttrykk fra WAT av kontroll (hvit sirkel), og C26 tumorbærende mus (svart firkant); Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik presentert som prosenter i forhold til kontrollene for 4-5 dyr per gruppe (* P 0,05, ** P 0,01; *** P 0,001, C26 vs kontroll). 6 am verdier er duplisert i hver graf for å illustrere en komplett 24-timers syklus; (C) Western blot analyse av ATGL og PERILIPIN proteiner på 14:00 og 2 am.
opprørt dagaktive uttrykk for fettsyre utnyttelse veien i cachectic mus.
En viktig funksjon av WAT er lipid forbruk gjennom aktivering av fettsyre β-oksidasjon i mitokondrier og peroxisomes. For å forstå rollen til WAT i genereringen av frie fettsyrer som brennstoffkilde under kreft kakeksi, undersøkte vi diurnal ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer som er involvert i regulering av fettsyre katabolisme og tilsvarende målgener (figur 5A). I samsvar med tidligere rapporter,
PPARa
utstilt circadian pendling mens
Pparδ
viste ikke rhythmicity i kontroll mus. Det var ingen signifikant endring synlig for enten
PPARa
eller
Pparδ
mellom kontroll og cachectic mus. Tilsvar
Pgc1α
hadde en særegen dagaktive mønster av uttrykk, men var uendret i WAT av cachectic mus.
Nrf1
, en viktig regulator av metabolske gener involvert i mitokondriell respirasjon, viste ikke circadian oscillation, men det var signifikant økt ved bestemte tidspunkter i løpet av 24-timers periode. Tfam er en mester regulator av mitokondrie biogenesis. Dens transkripsjonsnivåer ikke vise rhythmicity og vesentlige endringer var ikke tydelig under kreft kakeksi. I likhet med
Tfam
, ekspresjon av karnitin palmitoyl-transferase 1α (
Cpt1α)
kreves for opptak av langkjedede fettsyrer i mitokondriene ble opprettholdt i C26 tumorbærende dyr. Den PPAR målet genet, peroksisomal bifunctional enzym (
PBE
) involvert i peroksisomal fettsyre β-oksidasjon, viser en dagaktive topp på 22:00 i mørke syklusen hos friske mus. WAT fra cachectic mus viste høyere overflod av
PBE
mRNA på de fleste tider, samt en betydelig 12-timers fase forhånd, med en topp på 10 am (Figur 6A). I tillegg ble det observert signifikante endringer mellom cachectic mus og pair-matet mus ved 14:00 (figur S4). Ytterligere bevis for forbedret peroksisomal β-oksidasjon er høyere proteinnivå PBE i cachectic dyr på både 2 am og 14:00 (figur 5B, figur S4). Men det ser ut til at andre komponenter av fettsyre utnyttelse som AOX, HADHA og HADHB er uendret (figur S5).
(A) mRNA analyse av
PPARa, Pgc1α, Pparδ
,
Nrf1, Tfam, Cpt1α Hotell og
PBE
fra WAT av kontroll (hvit sirkel) og C26 svulst bærende mus (svart firkant); Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik presentert som prosentandeler i forhold til kontrollene for 4-5 dyr per gruppe (* P 0,05, ** P 0,01, C26 vs kontroll). 6 am verdier er duplisert i hver graf for å illustrere en komplett 24-timers syklus; (B) Western blot analyse av PBE protein på 2 pm og 2 am tidspunkter.
(A) mRNA analyse av
Ampkα1, Ampkα2 Hotell og
Acc
fra WAT av kontroll (hvit sirkel), og C26-bærende mus (svart firkant); (B) Western blot analyse av fosfor-AMPK (Thr192) og total AMPK på 14:00 og 2 am; Immunoblot analyse av Phospho-ACC og total ACC for 2 pm WAT prøver. (C) mRNA analyse av
mTOR Hotell og
4Ebp1;
fra WAT av kontroll (hvit sirkel), og C26-bærende mus (svart firkant); (D) Western blot analyse av fosfor-mTOR (Ser2448) total mTOR, fosfor-4EBP1 (Ser65), fosfor-4EBP1 (Thr37 /46) og total 4EBP1 på 14:00 og 2 am. Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik presentert som prosentandeler i forhold til kontrollene for 4-5 dyr per gruppe (* P 0,05, ** P 0,01, C26 vs kontroll). 6 am verdier er duplisert i hver graf for å illustrere en komplett 24-timers syklus.
Aktivering av AMPK Pathway i C26 bærende dyr
AMP-aktivert protein kinase (AMPK) er en større regulator av energihomeostase, svarer til økt AMP: ATP-forhold ved å stimulere fettsyreoksidasjon og øker glukoseopptak [32]. En av de viktigste rolle er AMPK fosforylering og derav følgende hemning av acetyl-CoA-karboksylase (ACC), det hastighetsbegrensende enzym i syntesen av fettsyrer.
