Abstract
Mitokondrie-nucleus kryss foredrag og mitokondrie retrograd regulering kan spille en betydelig rolle i cellulære egenskaper. Transmitochondrial cybrid systemer (cybrids) er et utmerket verktøy for å studere spesifikke effekter av endrede mitokondrier under et definert kjernefysisk bakgrunn. De fleste av studiene ved hjelp av cybrid modellen fokusert på betydningen av spesifikke mitokondrielle DNA-variasjoner i mitokondrienes funksjon eller tumor egenskaper. Men de fleste av disse variantene er godartet polymorfismer uten kjent funksjonell betydning. Fra et mål for likeretting mitokondrielle defekter i kreftceller og for å etablere mitokondrier som et potensielt anticancer medikament mål, å forstå rollen av funksjonelle mitokondrier i reverserings onkogene egenskaper under en kreft atom bakgrunn er meget viktig. Her analyserte vi potensialet reversering av onkogene egenskaper av et høyt metastatisk cellelinje med innføringen av ikke-kreft mitokondriene. Cybrids ble etablert ved å fusjonere de mitokondriene DNA utarmet 143B tk ρ0 celler fra en aggressiv osteosarkomcellelinje med mitokondrier fra godartet bryst epiteliale cellelinje MCF10A, moderat metastatisk brystkreft cellelinjen MDA-MB-468 og 143B celler. På tross av den ensartede kreft atom bakgrunn, som observert med mitokondriene donorcellene, cybrids med benigne mitokondrier viste høye mitokondrielle funksjonelle egenskaper inkludert økt ATP syntese, oksygenforbruk og respiratoriske kjedeaktivitet sammenlignet med cybrids med kreft mitokondriene. Interessant nok kan benigne mitokondrier reversere forskjellige onkogene egenskaper ved 143B TK
– celle, inkludert celleproliferasjon, levedyktigheten etter hypoksisk tilstand, anti-apoptotiske egenskaper, resistens mot anti-kreft legemiddel, invasjon, og kolonidannelse i myk agar, og
in vivo
tumorvekst i nakne mus. Microarray analyse antydet at flere onkogene trasé observert i cybrids med kreft mitokondriene blir hemmet i cybrids med ikke-kreft mitokondriene. Disse resultatene tyder på det kritiske onkogene regulering av mitokondrie-atomkrysstale og høydepunkter rette opp mitokondrie funksjonelle egenskaper som et lovende mål i kreftbehandling
Citation. Kaipparettu BA, Ma Y, Park JH, Lee TL, Zhang Y, Yotnda P, et al. (2013) Høring fra ikke-kreft Mitokondrier kan hemme tumor egenskaper av metastaserende celler ved å undertrykke onkogene Pathways. PLoS ONE 8 (5): e61747. doi: 10,1371 /journal.pone.0061747
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 24 oktober 2012; Godkjent: 11 mars 2013; Publisert: 09.05.2013
Copyright: © 2013 Kaipparettu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av DOD (W81XWH-11-1-0292), National Institutes of Health /National Cancer Institute (NIH /NCI) (U54-CA149196 Pilot Project) og DLD Cancer Center Pilotprosjekt til B. Kaipparettu og NIH /NCI ( R01 CA-100023) tilskudd til L. Wong. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP tilpasse seg hypoksiske betingelser ved progressiv tumorcellevekst ved å forskyve byrden av energimetabolisme fra oksydativ fosforylering til glykolysen, referert til som den Warburg virkning [1]. Reguleringen av atom genekspresjon av mitokondrielle genom, gjennom «mitokondrier retrograd signal», gjør at organ å koordinere sin funksjon med kjernen. Tumorceller fortsetter å utnytte glykolyse som den viktigste energikilden selv i kultur i henhold normoksisk veibane [2], noe som tyder på at mulige stabile genetiske eller epigenetiske endringer har skjedd i kreftceller. I tillegg kan kreft mitokondrier uten påviselige genetiske endringer overføre onkogene signaler til kjernen og initiere mitokondriell retrograd regulering som fører til toveis kommunikasjon mellom de to genomer [3].
For å undersøke den spesifikke mitochondrial bidraget til tumor egenskaper, må effekten av kjernegener utelukkes. Transmitochondrial cybrid system er en utmerket måte å oppnå dette målet [4] – [9]. Flere studier benyttet denne spennende teknologien for det meste for å vise den funksjonelle og patogene betydning av spesifikke mitokondrie DNA (mtDNA) mutasjoner eller varianter [5], [10]. MtDNA er kjent for å mutere ofte i en rekke kreftformer, men de fleste av disse mtDNA endringer, unntatt noen få, er uten kjent funksjonell betydning og kan bare gjenspeile den genomiske ustabilitet av tumorceller. Selv uten tilstedeværelse av kjente skadelige mtDNA mutasjoner, har studier vist at metastatisk mitokondriene kan forbedre svulsten tilhører en kreftcelle og gjøre dem metastatisk [9], [11]. Men fra et terapeutisk synspunkt, for å målrette syke mitokondriene, er det viktig å vite om ikke-kreft funksjonelle mitokondriene kan reversere onkogene tilhører metastatiske celler. I så fall kan målrette syke mitokondriene eller rette opp funksjonell defekt av normale mitokondriene gi en kritisk druggable område for kreftbehandling. I denne studien har vi bedt et interessant spørsmål om ikke-kreft mitokondriene kan reversere onkogene egenskaper en aggressiv kreftcelle. Under et definert kreft atom bakgrunn, sammenlignet vi mitokondrier fra ikke-kreft, moderat metastaserende brystceller i en svært metastatisk atom bakgrunn med mitokondrier fra svært aggressiv kreftcelle som kontroll. Selv under de samme kjernefysiske bakgrunnen, kan mitokondrier fra ikke-kreftceller hemme flere onkogene trasé, reversere onkogene egenskaper og forbedre terapeutisk respons av kreft celler. Dette understreker betydningen av mitokondrier som en kritisk regulator av cellekreft eiendom og et potensielt mål for kreftbehandling.
Materialer og metoder
Etikk Erklæring om dyreforsøk
Alle dyr prosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Baylor College of Medicine og utført i samsvar med NIH retningslinjer for etisk behandling av dyr.
Cybrids
udødelig ikke-kreft mammary epitelceller MCF10A celler , brystkreft MDA-MB-468-celler og metastatiske osteosarkom-avledede 143B TK
– celler (143b) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). En detaljert protokoll for generering av
ρ
0
celler og cybrids har nylig publisert [3], [6], [8]. I korthet mtDNA utarmet 143B ρ
0-cellene ble anvendt som den kjernefysiske donor. For å generere cybrids, mitokondrie donorceller (MCF10A, MDA-MB-468 og 143B tk) ble enucleated av natten actinomycin-D behandling og smeltet sammen med 143B ρ
0 celler ved hjelp av 45% polyetylenglykol (MW 1450; Sigma katt P-5402) i 60 sekunder. En dag etter fusjon, ble cellene dyrket i seleksjonsmedium med bromdeoksyuridin (BrdU), men uten uridin [3], [12]. Ufiksert kontroll 143B ρ
0 celler kan ikke overleve uten uridine og mitokondrier donorceller ble drept av BrdU. Cybrids inneholder mitokondrier avledet fra MCF10A, MDA-MB-468 og 143B celler med 143B ρ
0 celler som kjernefysisk bakgrunn er navngitt som 10A /143B, 468 /143B og 143B /143B cybrids hhv.
kvantifisering og sekvensanalyse av mtDNA og validering av Nuclear DNA
Totalt genomisk DNA ble ekstrahert med fenol /kloroform metoden og 16,6 kb mitokondrielle genom ble forsterket av 24 par overlapp primere som er publisert før [13] – [ ,,,0],15]. qPCR ble brukt til å kvantifisere mtDNA kopi nummer for å verifisere
ρ
0
tilstand og for å kvantifisere mtDNA innhold i cybrids ifølge publiserte prosedyrer [16], [17]. Bare cybrid kloner som inneholder sammenlign mtDNA kopiantall ble brukt til eksperimenter. Hele genomet mtDNA og referanse nukleært DNA sekvensanalyse ble utført ved hjelp BigDye terminator (versjon 3.1) syklus sekvense reagenssett på en ABI 3730XL DNA Analyzer (Foster City, CA). Resultatene av DNA sekvensene ble sammenlignet med publiserte Cambridge referansesekvens fra https://www.mitomap.org. Nuclear kilde cybrids ble bekreftet av genotyping.
reaktive oksygen arter (ROS) Produksjon
celler ble sådd og dyrket i glukose eller galaktose medium i 24 timer i 24-brønners plater (2 × 10
4 per brønn). ROS produksjon ble målt 30 minutter etter å ha lastet med 5 mikromol /L 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) [18]. Etter vasking med PBS-buffer, ble cellene trypsinert og suspendert i PBS-buffer. Fluorescens målinger ved eksitasjon og emisjonsbølgelengder av 485 og 535 nm, henholdsvis, ble utført med en Tecan uendelige M200® mikroplateleser (Mannedorf, Sveits).
ATP syntese
ATP syntesen var målt ved luciferin /luciferase-assay [3]. Celler ble inkubert med 5 mmol /l malat pluss 5 mmol /l glutamat (kompleks I-drevet substrater), eller med 10 mmol /l succinat (kompleks II-drevet substrat) pluss 2 pg /ml rotenon (kompleks I-inhibitor), og 0,2 mmol /L ADP i 3 minutter i nærvær eller fravær av 10 pg /ml oligomycin. Satsen for oligomycin sensitive ATP syntese ble analysert ved hjelp av Tecan uendelige M200® og uttrykt som nmol ATP produseres /min /mg protein.
Western Blot analyse
Proteiner ble separert ved SDS-PAGE på en 12% gel. Spesifikke antistoffer som benyttes for Western Blot-analyse og kjemiluminescens ble påvist ved anvendelse av pepperrot peroksidase-merket sekundært antistoff (Bio-Rad, CA). Mitokondrie proteiner: ATP syntase subenheten alfa (F1α), Core 2, FeS subenhet (Ip), COXII, ND6, og Porin (alt fra Mitoscience, OR). Apoptotiske proteiner: spaltet kaspase 3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (Cell Signaling, MA). β-aktin og Porin ble brukt som laste kontroller for kjernekraft og mitokondrielle kodet proteiner henholdsvis [3].
Cell Proliferation Assay
Celleproliferering ble målt til normoxia (21% O
2 ) eller hypoksi tilstand (1% O
2) ved hjelp av kolorimetrisk analyse basert på måling av BrdU-inkorporering (4 timer) i løpet av DNA-syntese, i henhold til produsentens protokoll (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland).
TUNEL analysen
Apoptose ble analysert ved TUNEL analysen hjelp av blindgaten ™ Fluorometrisk TUNEL system (Promega, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner [19], [20].
kreft narkotika behandling og MTT analysen
Etter over natten dyrkning av 5 × 10
3 cybrids i en 96well plate ble cybrids behandlet med kjøretøy, doxorubicin (0,1 mm) i henhold normoksiske (21% O
2) og hypoksisk (1% O
2) betingelser i ytterligere 24 timer. Celleviabilitet ble analysert ved MTT analyse ved bruk av Tecan Infinite M200 ifølge publisert protokollen [21], [22].
Colony Dannelse i Soft Agar
Six-brønns plate med 0,5% agar i DMEM medium som bunnlaget ble anvendt for bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen. For hver brønn, 5 x 10
3 cybrids suspendert i DMEM-medium med 0,35% agarose ble platet som topplaget og inkubert ved 37 ° C i 3-4 uker. Koloniene ble farget med 0,005% krystallfiolett og telles. Antallet kolonier for hver cybrid ble plottet som gjennomsnitt ± SD.
Matrigel ™ Invasion analysen
invasiv vekst evnen til cybrids ble kvantifisert ved hjelp av BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chamber (6- vel) (Becton Dickinson biovitenskap, MA, USA) i henhold til produsentens protokoll [23]. Etter trypsinering, 5 x 10
4-celler i 0,5 ml medium ble tilsatt til hver brønn i triplikat. Etter 24 timer ble cellene invaderte til det nedre kammer fiksert og farget med 100% metanol og 1% toluidin blått. Antallet invaderte celler ble talt ved hjelp av et mikroskop og prosenter av Matrigel matrise invadere celler ble beregnet i forhold til den ikke-belagte kontroll membranen.
Microarray Gene Expression analyse og validering av qPCR
Gene uttrykk profilen til 10A /143B og 468 /143B cybrids ble sammenliknet med Affymetrix menneskelig U133 Plus 2,0 arrays i tre eksemplarer i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet RNA fra 10A /143B og 468 /143B cybrids ble ekstrahert i triplikat og 5 ug av total-RNA ble anvendt for første- og andre-tråd cDNA syntese. Den microarray hybridisering ble utført i Affymetrix U133 Plus 2,0 microarray chips på Affymetrix F450 fluidics stasjonen ved hjelp av EukGE-WS2v5_450 protokoll og skannet med Affymetrix Genechip 7 G scanner (Affymetrix, Santa Clara, CA). Dataene ble analysert ved hjelp av statistisk kjernefasiliteten på Dan L. Duncan Cancer Center ved Baylor College of Medicine. Gener ble definert vesentlig endret mellom de to cybrids med t-test P 0,01, fold change 2 eller 0,5; globale forskjeller langt overskredet sjanse forventet. Genuttrykket Datasettet ble ytterligere utsatt for skoleveien signaturanalyse for å finne antatte differensial vei aktiverings hendelser. Pathway-forbundet gen signaturer ble definert, ved hjelp av offentlig data: p53 signatur besto av kanoniske bundet og oppregulert p53 genet mål, som katalogisert i p53 IARC database (https://www-p53.iarc.fr/TargetGenes.html ), og de andre genet skriftene undersøkt tidligere ble katalogisert og beskrevet [24]. Ved hjelp av et sett av unike gener som er representert i datasettet (der flere sonder referert til det samme genet, ble proben med den høyeste variasjon brukes til å representere-genet), og med uttrykksverdier sentrert på den gjennomsnittlige tvers prøvene var den gjennomsnittlige uttrykk for gener «opp» i signaturen ble trukket fra gjennomsnittet for de genene «ned», for å beregne et sammendrag vei score for en gitt signatur og prøve profil. For tilfeldig utvalgte gener, ble mRNA uttrykk forskjeller observert i microarray analyse ytterligere validert av q-RT-PCR ved hjelp av primere beskrevet i tabell S1.
In vivo
tumorvekst Analyse
Tumorvekst vekst~~POS=HEADCOMP ble analysert med hensyn på cybrids ble utført ved anvendelse av nu /nu hunn nakne mus (Charles River Laboratories, MA, USA). Fire mus ble benyttet for hver cybrid gruppe. Omtrent 1,5 millioner celler av hver av de samme cybrids ble blandet med Matrigel (300 ul celle-suspensjon i PBS med 300 ul redusert vekstfaktor Matrigel), og injiseres inn i både venstre og høyre flankene av dyr ved hjelp av en 26 gauge nål. Tumorstørrelse ble målt to ganger i uken med kaliper og tumorvolum ble beregnet ved bruk av formelen LW
2/2 (L og W representerer lengden og bredden av tumorer) [25]. Eksperimentet ble avsluttet når det midlere tumorvolum i en hvilken som helst av kontrollmusene (143B /143B) er overskredet 1,0 cm
3. Ved slutten av eksperimentet ble musene avlivet ved eksponering for CO
2 og primære tumorer ble skåret ut og veiet.
statistikker og
Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD eller SEM . Statistisk analyse ble utført ved hjelp av
t
test og ANOVA. P-verdi. 0,05 ble ansett som vesentlig
Diskusjon
cybrid teknologien beskrevet her gjør at etterforskningen av effekt mitokondriene stammer fra kreft eller ikke-kreftceller på mitokondrienes funksjon
Resultater og og onkogene egenskaper i et felles kjernefysisk bakgrunn. Ikke alle cellene kan overleve under mitokondriene oppbrukt forhold. Her har vi brukt 143B TK
-. Celler som atom donor, som er en av de mest godt karakterisert cellelinje for cybrid studier og den første etablerte menneskelige ρ0 cellelinje
Ikke-kreftceller og deres Cybrids Utstillings bedre mITOKONDRIELLE Funksjonelle egenskaper i forhold til kreft Mitokondrier
Vi først analysert mitokondrienes funksjon av foreldre mitokondrielle donor cellelinjer og deres cybrids. Siden lekkasje av ROS er en indikasjon på defekte mitokondriell funksjon, ble ROS produksjon analysert i alle foreldrecellelinjer ved bruk av celle-gjennomtrengelige sonde, DCFH-DA. Under metabolsk stress, slik som i fravær av glukose ble cellene tvunget til å utelukkende være avhengig av mitokondriell oksidativ fosforylering for energiforsyning [22]. Derfor, hvis det er feil i mitokondriell respirasjon, blir cellene forventes å produsere økte mengden av ROS i den galaktose-medium [25]. Som forventet begge cancercellelinjer (143B og MDA-MB-468) produserte signifikant høyere (p 0,05) ROS i galaktose medium sammenlignet med glukosemedium. Imidlertid var det ingen signifikant økning i ROS-produksjon for MCF10A celler i galaktose medium (Fig. 1A). Vi deretter analysert cybrids og fått en tilsvarende reaksjon som observert med foreldre celler. For cybrids med mitokondrier fra godartede MCF10A celler, var det ingen signifikant økning i ROS-nivå i galaktose medium. Imidlertid cybrids cancer mitokondrier viste signifikant øket ROS nivå i galaktose medium (Fig. 1B). For å undersøke området av svikt i den respiratoriske kjeden er ansvarlig for den reduserte oksidativ fosforylering ytterligere, ble ATP-syntesehastighetene målt i nærvær av komplekse substrater (I-glutamat pluss malat), eller kompleks II substrat (suksinat). Som vist på fig. 1C, ATP syntese ratene var signifikant høyere i godartede celler sammenlignet med kreftceller i nærvær av kompleks I (p 0,01) eller komplekse substrater II (p 0,01). Som forventet, cybrid celler viste også tilsvarende resultater for ATP syntese som observert med foreldre celler. I nærvær av enten komplekse substrater I eller II komplekse substrater, ble ATP syntesehastigheten markert økt i 10A /143B cybrids sammenlignet med 143B /143B og 468 /143B cybrids (p 0,01) (figur 1D.). Disse resultatene tyder på at kreft mitokondrier sannsynligvis ha endrede funksjon å påvirke flere komplekser i respirasjonskjeden. Western blot analyse viste at i forhold til cybrids med kreft mitokondriene ble mtDNA-kodet mitokondrie-komplekset Jeg ND6 underenhet av mitokondriell NADH dehydrogenase protein betydelig økt i MCF10A /143 cybrids men ingen forskjell i kjernefysiske kodede proteiner som F1α, Core2 og Ip (Fig. 1E). Dermed innføring av mitokondrier fra ikke-kreft MCF10A kunne i det minste delvis øke uttrykket av mtDNA kodet respiratoriske kjeden proteiner, og dermed avhjelpe redusert mitokondriefunksjonen i 143B kreftcellen.
(A) ROS produksjon i foreldreceller . Etter Cellene ble dyrket i DMEM-glukose eller galaktose DMEM-medium i 24 timer og ROS ble målt ved bruk av DCFH-DA fluorescerende fargestoff. Data uttrykt som DCF fluorescens /mg protein. (B) ROS produksjon i cybrid celler. (C) mitokondrie ATP syntese rate i foreldre celler. ATP-syntese ble drevet av komplekse substrater (I glutamat pluss malat) eller kompleks II substrat (suksinat), i nærvær av kompleks-I-inhibitor (rotenon). Satsene for ATP syntese er uttrykt som nmol ATP /min /mg protein. (D) Mitokondrie ATP syntese rate i cybrids. (E) Western blot analyse av representative protein subenheter av mitokondriene respiratoriske komplekser i cybrids. β-aktin og Porin ble brukt som laste kontroller for kjernekraft og mitokondrier proteiner hhv. (* = P 0,05).
Ikke-kreft Mitokondrier kan reversere onkogen Properties av metastatisk Cell
For å forstå den funksjonelle betydningen av mitokondrie retrograd regulering fra ikke-kreft mitokondriene på de tumorigene egenskaper av en metastatisk kjernen, sammenlignet vi cybrids for ulike onkogene egenskaper.
Cell Proliferation og levedyktighet etter hypoksisk tilstand
i solide tumorer, kreftceller har kapasitet til å spre og opprettholde levedyktighet i henhold til hypoksiske betingelser på grunn av redusert vaskularisering og redusert blodtilførsel i tumorvev. Vi sammenlignet med celleformering i henhold til cybrids hypoksiske betingelser. Interessant, selv under ensartet atom bakgrunn, cybrids med ikke-kreft mitokondrier viste signifikant redusert celleproliferasjon i hypoksiske betingelser (Fig. 2A).
(A) Prosent av celleproliferasjon i cybrids henhold hypoksisk tilstand (1% O
2 for 4 timer) sammenlignet med normoksiske tilstand (21% O
2). DNA-replikasjon ble evaluert ved anvendelse av en ELISA-basert assay BrdU-inkorporering. (B) Andelen cybrids invadert i en Matrigel invasjonen assay. (C) Fase kontrast bilde av forankringsuavhengig vekst av cybrids med kolonidannelse analysen i myk agar. (D) Mean (± SD) antall kolonier med hver cybrids. (E) Anticancer narkotika motstand av cybrids: Andel av levedyktige cybrid celler oppdaget MTT analyse etter behandling med doxorubicin i normoksiske (krysset bar) og hypoksisk (forherliges bar) betingelser for 24 timer. (B) Western blot-analyse av apoptotiske markører spaltet kaspase 3 og PARP-1 etter behandling med bærer eller doksorubicin (DOX) i 24 timer. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. (* = P 0,05, 10A /143B vs 143B /143B og 468 /143B;
† = P 0,05, 468 /143B vs 143B /143B og
# = P 0,05, 10A /143B doxorubicin etter normoksiske vs hypoksisk tilstand).
In vitro
Svulst Properties
evnen til å invadere celle matrise og å vokse under forankrings uavhengige forhold er noen av de krefttrekk . Atom donor 143B osteosarkomcellelinje er svært tumorigent og metastatisk i naturen. Vi først analysert invasjonen potensialet cybrids bruker Matrigel invasjonen kammeret. Som vist på fig. 2B, Matrigel invasjonen assay foreslått betydelig lavere invasjon indeks for 10A /143B cybrids forhold til de cybrids med kreft avledet mitokondriene. Vi deretter analysert anker uavhengig vekstpotensial ved bruk av
in vitro
kolonidannelse analysen i myk agar. Selv under ensartet metastatisk kjerne bakgrunn, cybrids inneholdende ikke-kreft mitokondriene dannes betydelig mindre kolonier sammenlignet med cybrids cancer mitokondriene. Antallet kolonier i cybrids med moderat metastaserende MDA-MB-468 celler var i mellom 10A /143B og 143B /143B cybrids (Fig. 2C og D).
Motstand mot Anticancer Medikamentell behandling
Motstand mot celledød fra anticancer stoff er en av de viktigste årsaker til kreftbehandling svikt. De fleste av de konvensjonelle kjemoterapeutika drepe via den mitokondrielle vei av apoptose. Siden doksorubicin er ofte brukt i behandlingen av faste tumorer, inkludert bryst, lever, og bentumorer, ble cellelevedyktigheten etter å ha anticancermedikamentelle behandlinger analysert i henhold til normoksisk cybrids og hypoksiske betingelser. Celleviabilitet analyse antydet at i forhold til 143B /143B og 468 /143B cybrids med kreft mitokondriene, cybrids inneholder ikke-kreft MCF10A mitokondriene hadde signifikant økt celledød etter kreft behandling i både normoksisk og hypoksiske forhold (Fig. 2E). Den økte celledød etter å ha anticancerterapi ble ytterligere bekreftet ved den økte ekspresjon av apoptotiske markører aktivert kaspase-3 og spaltet PARP i doksorubicin behandlet 10A /143B cybrids (fig. 2F). Disse resultatene tyder på at mitokondrie egenskaper spille betydelig bidrag til svar på kreft medikamentell behandling.
In vivo
tumorvekst
in vitro
analyser sterkt foreslo inhibering av onkogene egenskaper av aggressive 143B celler ved innføring av ikke-kreft mitokondriene. Disse funnene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av en
in vivo
hårløse mus modell. Som forventet, alle cybrids dannet svulster under høyt tumorigent og metastatisk 143B atom bakgrunn. Imidlertid, som observert med
in vitro
kolonidannelsesbestemmelsen, tumorveksten ble hemmet signifikant i 10A /143B cybrids inneholdende ikke-kreft mitokondrier sammenlignet med 143B /143B cybrids med kreft mitochondria (Fig. 3A). Tumorvekt og størrelse var signifikant lavere i cybrids med mitokondrier avledet fra godartede MCF10A-celler (fig. 3B og C). Som observert i
in vitro
kolonidannelse analysen, tumorstørrelse og vekst i cybrids med mitokondrier avledet fra moderat kreft MDA-MB-468 brystkreftceller var i mellom 143B /143B cybrids og 10A /143B cybrids . Til sammen våre
in vitro Hotell og
in vivo
studier tyder sterkt på at mitokondriene-atomkrysstale fra ikke-kreft mitokondriene kan hemme tumor egenskapene til en svært metastatisk celle.
(A) Fotografi av tumorene som er dannet med forskjellige cybrids etter implantering i til nakne mus. (B) Den gjennomsnittlige (SEM) vekten av tumorene etter deres kirurgisk fjerning. (C) Den gjennomsnittlige (± SEM) volum av
in vivo
tumorvekst på forskjellige dager etter transplantasjon av cybrids. (* = P 0,05 t-test i forhold til 143B /143B og # = P 0,01 i ANOVA).
Mitokondrieretrograd Signa fra Benign Mitokondrier Dempe Flere onkogene Pathways
Mitokondriell retrograd signalering er en sti for kommunikasjon fra mitokondriene til kjernen under normale og patofysiologiske forhold. For å forstå den mitokondrielle retrograd regulering av kjernefysiske gener av kreft og ikke-kreft mitokondriene, brukte vi microarray analyse. Genuttrykk profiler ble sammenlignet og bioinformatically analysert onkogene trasé for cybrids med mitokondrier fra godartet bryst epitel (10A /143B) og brystkreft celle (468 /143B). Interessant, selv under de samme atom bakgrunn, 6478 probe-sett som representerer 4071 unike gener ble signifikant endret i 10A /143B cybrids sammenlignet med 468 /143B cybrids (Fig. 4A). Blant vesentlig endrede gener, 4794 probe sett representerer 2816 unike gener fikk oppregulert og 1684 probe sett representerer 1255 unike gener ned regulert i cybrids med MCF10A mitokondriene. Videre analyse av onkogene trasé tyder på at mange onkogene trasé inkludert RAS, HER2, SRC og P53 veier er nedregulert i MCF10A /143B cybrids med ikke-kreft mitokondriene (fig. 4A). Noen av tumorsuppressorgener inkludert RB1, PTEN og VHL økt betydelig i MCF10A /143B cybrids med godartede mitokondriene. Microarray data for tilfeldig utvalgte gener ble validert av q-RT-PCR-analyse (figur S1). Dermed tyder microarray analyse at selv under en svært aggressiv kreft atom bakgrunn, kan mitokondrier-atomkrysstale fra ikke-kreft mitokondriene undertrykke flere onkogene stier og gjør cellene mindre kreft.
(A) Sammenligning av 10A /143B vs 468 /143B cybrids med definerte gener vesentlige med t-test P 0,01, fold change 2 eller 0,5. Gul, høyere uttrykk. Gener validert ved RT-PCR er indikert. (B) Pathway signaturanalyse av uttrykket datasettet som viser mulige differensial pathway aktiveringsnivå (signaturnavn i kursiv betegne forskjeller mellom utvalgsgrupper med P 0,01, t-test). Rød, høyere inferred pathway signatur aktivitet. Pathway signaturer ble definert ved hjelp tidligere studier, er angitt i parentes [24].
Selv i mer enn 3 tiår, er svulster betraktes som sykdommer muterte onkogener, alternative «metabolske» modeller har også blitt foreslått å spille en rolle i utvikling og progresjon av kreft. Mitokondriell dysfunksjon anses som en av de mest vanlige og konsistente fenotyper av kreftceller. I de senere årene, er en økende strøm av dokumenter knytte kreftgener med energiomsetningen [26]. Tallrike forskjeller i den molekylære sammensetning av mitokondriell indre membran mellom normale celler og kreftceller har også blitt rapportert. Analyse av den indre membran lipidsammensetningen av forskjellige tumor mitokondriene har indikert forhøyede nivåer av kolesterol, varierende totale fosfolipidinnhold, og /eller endringer i mengden av individuelle fosfolipider i forhold til normale kontroller [27]. Våre resultater viste at selv om gener som koder for de mitokondrielle proteiner er lokalisert i kjernen, innføring av mitokondrier som stammer fra ikke-kreft-celle til en kreftatom miljø resulterte i undertrykkelse av onkogene trasé og endret kreft egenskaper. Flere rapporter postulerte at ROS kan være formidler av de defekte mitokondriene i kreft [11], [25]. Imidlertid kan andre enn ROS faktorer fra kreft mitokondrier også spille en rolle i tumoregenskaper. Det er også mulig at som ble observert med cellulær omprogrammering, mitokondrier fra forskjellige cellulære miljø kan ha blitt programmert på bestemt måte, og det kan bære over en del av sin effekt til den neste generasjon, uavhengig av den nukleære bakgrunn. Nylige studier har antydet at endrede mitokondriene kan påvirke epigenetiske endringer i kjernegener, inkludert DNA-metylering [28], [29]. Slike epigenetiske forandringer inkludert DNA og kromatin modifikasjoner og signalering gjennom små RNA kan bidra til opprettholdelse av mitokondrier medierte onkogen transformasjon i generasjoner.
De fleste av cybrid studiene fokuserte på somatiske mutasjoner i mitokondriene genom og dets funksjonelle betydning. Mange forsøk har blitt gjennomført for å undersøke hvilken rolle spesifikke mtDNA mutasjoner i kreft [3], [30] – [36]. Selv om somatiske mtDNA endringene er de vanligste funksjonene i kreft og noen bevis tyder på at enkelte mtDNA mutasjoner gjør faktisk spille en rolle i utviklingen av kreft, effekten av kreft mitokondrier på tumorigenesis fortsatt i stor grad uklart [5], [25]. Vi observerte ikke noen kjente patogene mutasjons forskjell mellom 143B og MCF10A celler. Imidlertid, selv om de fleste av mitokondrie mutasjoner er hver for seg ikke er skadelig, er det en mulighet for at kombinasjon av ulike nivåer av mutasjoner kollektivt kan bidra til proteinstabilitet og /eller retrograd-signalering.
Motstand mot celledød fra anticancer medikament er en av de viktigste årsakene til kreftbehandling svikt. De fleste av de konvensjonelle kjemoterapeutika drepe via den mitokondrielle vei av apoptose. Mitokondriell vei av apoptose oppfører seg som et viktig fenomen, der det er et hurtig, binær overgang fra et normalt fungerende celle til den raske utførelsen av et program av celledød [37]. En fersk spennende studie antydet at forskjellene i respons til kjemoterapeutisk behandling kan være på grunn av forskjeller i forbehandling i beredskap av tumorceller til å gjennomgå apoptose, en målbar egenskap som de kaller «mitokondriell priming» [38]. Ifølge deres funn, er differensial «mitokondrie priming «en viktig mekanisme som ligger til grunn den terapeutiske indeks av konvensjonell kjemoterapi [38]. Anti-kreft agenter spesifikt rettet mot kreft celle mitokondriene er navngitt som «mitocans «[39] – [42].
