Abstract
Fucosylation er en avgjørende oligosakkarid endring i kreft. Den kjent funksjon av fucosylation i kreft er å formidle metastase gjennom selektin ligand-avhengige prosesser. Tidligere har vi funnet fullstendig tap av fucosylation i colon cancercellelinje HCT116 på grunn av en mutasjon i GDP-fucose syntetisk enzym, GDP-mannose-4,6-dehydratase (GMDS). Tap av fucosylation førte til utslipp av kreftceller fra svulsten immune overvåking fulgt av tumorprogresjon og metastasering, noe som tyder på en ny funksjon fucosylation i tumorprogresjon veien. I den foreliggende studien undersøkte vi frekvensen av GMDS mutasjon i et antall kliniske kolorektal kreft vevsprøver: 81 prøver av primær kolorektal cancer vev og 39 prøver av metastatiske lesjoner, inkludert leveren og lymfeknuter. Fire typer slettingsmutasjon i GMDS ble identifisert opprinnelige kreftvev, så vel som metastatiske lesjoner. Hyppigheten av GMDS mutasjon var noe høyere i metastatiske lesjoner (12,8% hadde 5/39 prøver) enn i original kreft vev (8,6%, 7/81 prøver). Ingen mutasjoner av GMDS genet ble observert hos normale tykktarm vev som omgir kreftvev, noe som tyder på at mutasjonen er somatiske og ikke i kimlinje. Immunhistokjemisk analyse viste fullstendig tap av fucosylation i tre tilfeller av kreft vev. Alle tre tilfellene hadde GMDS mutasjon. I en av de tre tilfeller ble tap av fucosylation observert i kun metastatisk lesjon, men ikke sin opprinnelige tykktarmskreft vev. Disse dataene viser involvering av GMDS mutasjon i utviklingen av tykktarmskreft
Citation. Nakayama K, Moriwaki K, Imai T, Shinzaki S, Kamada Y, Murata K, et al. (2013) Mutasjon av BNP-Mannose-4,6-dehydratase i tykktarmskreft metastasering. PLoS ONE 8 (7): e70298. doi: 10,1371 /journal.pone.0070298
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 25 januar 2013; Godkjent: 18 juni 2013; Publisert: 29.07.2013
Copyright: © 2013 Nakayama et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Fucosylation er en av de viktigste oligosakkaridmodifisering i kreft og inflammasjon [1]. Fucosylation er regulert av ulike fucosyltransferases, guanosine 5′-difosfat (BNP) -fucose syntetiske enzymer, og BNP-fucose transportører. Mest GDP-fukose er syntetisert av de novo syntesen hvori GDP-mannose blir transformert inn i GDP-fucose av GDP-mannose-4,6-dehydratase (GMDS) og GDP-4-keto-6-deoksymannose-3,5- epimerase-4-reduktase (FX) [2] – [4]. Flere antistoffer som gjenkjenner fucosylated glykoproteiner eller glykolipider i sera av pasienter med kreft har lenge vært anvendt som tumormarkører [5]. Alfa-fetoprotein (AFP) -L3 fraksjon, som er fucosylated AFP, har også blitt anvendt klinisk som en tumormarkør for leverkreft siden 1996 i Japan, og siden 2005 i USA [6]. Generelt er fucosylation nivåene økt i karsinogenese av flere typer kreft [7], [8]. Tidligere, men vi fant ut at fullstendig tap av fucosylation grunn av sletting mutasjon av GMDS genet tillatt tykktarmskreftceller til å flykte fra natural killer celle-mediert svulst overvåking gjennom modulering av tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) signal [9 ], tyder på at en ny metastatisk vei avhengig av tap av fucosylation. GMDS mutasjon har blitt observert i tykktarmen (HCT116, LS174T, NCI-H716) og mage (SCH) kreft cellelinjer så vel som i menneskets tykktarm og eggstokk-kreft vev [9]. Interessant, GMDS mutasjonen ble ikke funnet i noen tilstøtende normalt vev, noe som tyder på at GMDS mutasjon var somatisk. Hvis tap av fucosylation er kritisk for metastase i løpet av kolorektal kreft progresjon, vil hyppigheten av GMDS mutasjon trolig bli økt i metastatiske lesjoner. I denne studien undersøkte vi hyppigheten av GMDS mutasjon i metastatisk kolorektalcancer vev som lever og lymfeknuter.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Protokollen og informert samtykke ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene ved Osaka University Graduate School of Medicine. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter, og studien ble gjennomført i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
vevsprøver
Tretti-en prøver av metastatisk leverkreft, 2 prøver av metastatisk andre krefttyper (magekreft, skjoldbruskkjertelen) og 81 prøver av de opprinnelige tykktarm kreft vev avledet fra pasienter med tykktarmskreft som gjennomgikk primær reseksjon ved Kirurgisk avdeling ved Osaka Medical Center for Cancer og hjerte- og karsykdommer fra 1995 til 2005 ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. Seks prøver fra metastatiske lymfeknuter fra pasienter med tykktarmskreft som gjennomgikk primær reseksjon ved Kirurgisk avdeling ved Suita Municipal Hospital 2010-2012 ble også brukt i denne studien. Kliniske parametre av pasientene i denne studien er oppsummert i Tabell 1. Noen av kreftvev ble innleiret i parafin og anvendt for immunhistokjemisk analyse. Disse studiene ble godkjent av den institusjonelle etiske komité av Osaka University Hospital.
Screening av GMDS Mutation med Reverse Transcription-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) Analyse
Total RNA var hentet fra frosne vev i henhold til en standard protokoll hjelp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California). Den ekstraherte RNA ble revers-transkribert ved hjelp av Super Script ™ III revers transkriptase og Oligo dT primer (Invitrogen). Ved hjelp av syntetiserte cDNA, ble PCR utført med KOD-Plus-DNA polymerase (Toyobo, Osaka, Japan). PCR-primere for GMDS var som følger: F, 5′-GCAAGCTTAAAATGGCACACGCACCGGCAC-3 «og R, 5′-GCGGATCCTCAGGCATTGGGGTTTGTC-3». Glyceraldehydes-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en intern kontroll, og de følgende PCR-primere ble anvendt for å amplifisere GAPDH: F, 5′-AACGGGAAGCTTGTCATCAAT-3 «og R, 5′-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3». Sekvensanalyse ble utført med en ABI PRISM 3100 genetisk analysator (Applied Biosystems, Foster City, California).
Immunhistokjemisk Studier
Kreft og normal kolon vev ble fiksert med 10% formalin /fosfat-bufret saltvann (PBS) og lagret som parafininnstøpte prøver. De 4-um vevssnitt ble de-vokset, og endogen peroksidase-aktivitet ble blokkert ved behandling med 0,3% hydrogenperoksid i metanol i 10 min. Etter vasking to ganger med PBS, ble prøvene inkubert med Tris-bufret saltvann og Tween 20 inneholdende 5% bovint serumalbumin over natten ved 4 ° C. Prøvene ble inkubert med biotinylert
Aleuria aurantia
lectin (AAL; 2,0 ug /ml) eller kanin-anti-GMDS antistoff (0,3 ug /ml) i 1 time ved romtemperatur. Prøvene ble vasket tre ganger med PBS og deretter inkubert med ABC-kit (Vector Labs, Burlingame, CA) for AAL farging eller med Dako Cytomation Envision + System-HRP-merkede Polymer-anti-kanin-antistoff (Dako, Glostrup, Danmark) for GMDS farging ved romtemperatur i 30 min. Etter prøvene ble vasket tre ganger med PBS, ble positiv farging visualisert ved hjelp av diaminobenzidin (Dako).
Resultater
GMDS Mutasjon i tykktarmskreft
For å undersøke hyppigheten av GMDS mutasjon i original og metastatisk kolorektal kreft, ble total RNA ekstrahert fra 81 prøver av human kolorektal kreft opprinnelige vev, for 39 prøver av metastatisk kreft, vev og tilstøtende normal tykktarm vev og ble underkastet RT-PCR-analyse. Fire kortere PCR-produkter ble funnet i flere originale og metastatisk kreft vev (Fig. 1). Detaljert sekvensanalyse avslørte forskjellige typer av delesjon av exoner GMDS: exonene 2-4, 5-7, 2-7, og 3-7. To av disse mutasjoner, delesjon av exon 5-7 og exoner 2-4, var identiske med de i HCT116 og SCH cellelinjer, henholdsvis. Sletting av eksoner 2-7 og 3-7 GMDS genet representerer nye mutasjoner identifisert i denne studien. De GMDS mutasjoner i metastatiske lesjoner var i samsvar med de fra de opprinnelige kolorektal kreft vev. Interessant nok var homozygot av GMDS mutasjon uten normal type GMDS transkripsjon funnet i en metastatisk lever kreft vev (case 1 i fig. 1). Hyppigheten av GMDS mutasjon i metastatiske lesjoner var 12,8% (hadde 5/39 prøver): 12,9% (4/31 prøver) i leveren, 16,7% (1/6 prøver) i lymfeknute, og 0% (0/2 prøver) i andre organer (tabell 2). En litt lavere frekvens 8,6% (7/81 prøver) av GMDS mutasjon ble observert i de opprinnelige kreftvevet i forhold til deres metastatiske lesjoner, selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant (
p
0,10, etter χ
2-test). Ingen GMDS mutasjon ble observert i 24 prøver av tilstøtende normale kolon vev.
GMDS mutasjoner ble observert i syv tilfeller av originale kolorektal kreft vev og fem tilfeller av metastatiske lesjoner. Pilene viser band som representerer GMDS mutasjon: sletting av eksoner 2-4 (A, 876 bp), 5-7 (B, 693 bp), 2-7 (C, 450 bp), og 3-7 (D, 495 bp) . Pilspisser angir villtype GMDS (*) og ikke-spesifikk (**) bånd. L-6 viser en av sakene med metastatiske lymfeknuter. N, tilstøtende normalt vev; T, svulst; LN, lymfeknute.
Immunohistochemistry
For å undersøke cellulære fucosylation nivå i disse kreft vev, 33 tilfeller av originale kolorektal kreft vev og fire tilfeller av deres metastatiske lymfeknuter var farget med anti-GMDS-antistoff og et fucosylated glykan-bindende lektin, AAL. RT-PCR-analyser viste heterozygot GMDS mutasjon i fem av de 33 sakene. Tjueåtte kolorektal kreft vev uten GMDS mutasjon viste positiv farging for både GMDS og AAL. Representative bilder er vist i fig. 2A (case-N). I motsetning til dette, to av fem tilfeller av den opprinnelige kreft med GMDS mutasjon viste negativ farging for både GMDS og AAL (case 4 og 6 i fig. 2A). Interessant, en av fem tilfeller med GMDS mutasjon viste negativ farging for både GMDS og AAL i den metastatisk lymfeknute til tross for positiv farging i sin opprinnelige tykktarmskreft vev (saken L-6 i fig. 2B og C).
Trettitre tilfeller av originale kolorektal kreft vev og fire tilfeller av deres metastatiske lymfeknuter ble farget med anti-GMDS antistoff og AAL. (A) Saker 4 og 6, som skildrer den opprinnelige tykktarmskreft med GMDS mutasjon, men ikke tilfelle N, som ikke hadde GMDS mutasjon, viste negativ farging for både GMDS og AAL. (B, C) Ved L-6, som gjorde havnen GMDS mutasjon ble metastatisk lymfeknute ikke farget for GMDS (B) og AAL (C) til tross for positiv farging for både GMDS og AAL i original kolorektal kreft vevsprøve. Sak L-4 uten GMDS mutasjon viste positiv farging for GMDS og AAL i både originale og metastatiske legioner. Bar indikerer 100 mikrometer. LN, lymfeknute.
Diskusjoner
I forrige vår studie ble GMDS mutasjon identifisert av gDNA sekvensering i to av 100 tilfeller av human kolorektal kreft vev og ved RT-PCR analyse i fem av 10 tilfeller av microdissected menneskelig eggstokkreft vev. I denne studien har vi ytterligere demonstrert GMDS mutasjon i flere menneskerettighets originale og metastatisk kolorektalcancer vev. Frekvensen av GMDS mutasjonen var noe høyere i metastatiske lesjoner (12,8%) enn i de opprinnelige kreftvev (8,6%). Interessant, i ett tilfelle (L-6), tap av fucosylation ble observert i den metastatisk lymfeknute, men ikke i sin opprinnelige kreftvev (Fig. 2B og C). Disse resultatene tyder på at GMDS mutasjon er involvert i utviklingen av tykktarmskreft. Antallet tilfeller med GMDS mutasjon var ikke tilstrekkelig til å undersøke statistisk sammenheng mellom GMDS mutasjon og sykdomsaktivitet med sikkerhet. Videre analyser med flere antall prøver vil være nødvendig for å fastslå sammenhengen mellom GMDS mutasjon og tykktarmskreft progresjon. Fire av ni pasienter med GMDS mutasjon (case 1-8 og case L-6) ble utsatt for kirurgisk operasjon innen 3 år etter diagnose. Dermed er en oppfølgingsstudie også nødvendig å undersøke tilbakefall av metastaser.
Selv om de fleste av de GMDS mutasjoner observert i denne studien var heterozygote, ble homozygot mutasjon observert i en metastatisk lever kreft vev (sak 1, Figur 1). Siden cancervev bestå av en rekke forskjellige celler, inkludert ikke bare kreftceller, men også interstitielle celler, er det vanskelig å påvise hvorvidt kreftceller havn en heterozygot eller homozygot type mutasjon ved hjelp av RT-PCR-analyse ved bruk av hele kreftvevet. Dermed blir muligheten for at kreftcellene har en homozygot delesjon GMDS mutasjon i vev hvor heterozygot delesjonsmutasjon ble observert gjenstår. Faktisk ble uttrykk for GMDS og fucosylated glykaner knapt oppdaget ved immunhistokjemisk analyse ved hjelp av anti-GMDS antistoff og AAL i tre av fem tilfeller med heterozygot GMDS mutasjon, noe som tyder på at kreftceller i disse vev kan faktisk ha homozygot GMDS mutasjon.
Expression nivåer av GMDS genet i kreftvev er påvirket av ikke bare genmutasjon, men også av transkripsjonsregulering. Selv om noen av glykosyleringsseter-relaterte gener ble rapportert å være epigenetiske regulerte [10], [11], ekspresjon av GMDS ble ikke endret ved behandling med midler som modulerer epigenetisk DNA-struktur via DNA-metylering eller histon acetylering, noe som tyder på at epigenetiske effekter ikke spille en viktig rolle i regulering GMDS genekspresjon [12] (data ikke vist). Videre studier adressering genuttrykk regulering av GMDS genet er garantert.
Blant mange fucosylation relaterte gener, mutasjon av fucosyltransferases FUT1, 2 og 3, som katalyserer α1-2 eller 1-3 /4 fucosylation, har blitt rapportert hos pasienter med sjeldne blodtyper [13], [14]. I tillegg har GDP-fukose transportøren også blitt rapportert å være ansvarlig for leukocyttadhesjon mangel type II, som er et sjeldent recessiv syndrom karakterisert ved vekst og mental retardasjon og alvorlig immunsvikt [15] – [17]. Ingen mutasjon av fucosylation relaterte gener har blitt rapportert i humane kreftvevet før. GMDS er den første fucosylation-relatert gen som ble funnet å være mutert i kreftvev. Neste generasjons DNA sekvensanalyse kan være et nyttig verktøy for å finne ut hvorfor GMDS mutasjon forekommer i flere typer kreft.
Høy fucosylation nivå i kreftceller ble vist å øke metastase gjennom upregulating uttrykk for sialyl Lewis A og X, selektin ligander på celleoverflaten [10]. I kontrast til våre resultater viser at tapet av fucosylation også økt metastasering til og med i fravær av selektin ligander. Kreft metastase utvikler seg gjennom mange trinn: flykte fra immunceller, invasjon, angiogenese, intravasation, målsøkende til metastatisk vev, bloduttredelse, og kolonisering [18]. Fucosylation kan ha en annen rolle i hvert trinn. Fucosylation i kreftceller må strengt regulert og dens dysregulaiton vil føre til ytterligere kreft progresjon og metastasering. Konklusjonen er at denne studien viste at GMDS mutasjon bør være involvert i utviklingen av tykktarmskreft. Neste generasjons DNA sekvensanalyse kan gi oss mer informasjon om GMDS mutasjon i tykk- og endetarmskreft.
Takk
Denne studien ble utført som et forskningsprogram av prosjektet for utvikling av innovativ forskning på kreftbehandling (P-Direct), Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan og ble delvis støttet av New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO) som en del av det å utvikle teknologi Project for Implementering av sukkerkjede funksjoner i Japan . Dette arbeidet ble også støttet delvis av Global COE Program fra Osaka University finansiert av departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan.
