Abstract
bukspyttkjertelen stel celler (PSC avtaler) spiller en avgjørende rolle i den aggressive oppførselen til kreft i bukspyttkjertelen. Selv om heterogenitet av PSC avtaler har blitt identifisert, de funksjonelle forskjellene fortsatt uklare. Vi preget CD271
+ PSC avtaler i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen. Immunhistokjemi for CD271 ble utført for 31 normale bukspyttkjertelen vev og 105 pancreatic ductal adenokarsinomer (PDACs). Vi utførte flowcytometri og kvantitativ RT-PCR, og vurderes CD271 uttrykk i PSC avtaler isolert fra bukspyttkjertelen vev og endringene i CD271 uttrykk i PSC avtaler cocultured med kreftceller. Vi har også undersøkt mønsteret av CD271 uttrykk i en SCID mus xenograft modell. I immunhistokjemiske analyser, de CD271-høy flekker priser i bukspyttkjertelen stroma i normale bukspyttkjertelen vev og PDACs var 2/31 (6,5%) og 29/105 (27,6%), henholdsvis (p = 0,0069). I PDACs, ble CD271
+ stromale celler hyppig observert på kanten i stedet for sentrum av svulstene. Stromal CD271 høy uttrykket var forbundet med en god prognose (p = 0,0040). Flowcytometrisk analyser viste CD271-positive priser pscs var 0 til 2,1%. Kvantitativ RT-PCR-analyser viste at CD271 mRNA uttrykk ble økt i PSC avtaler etter coculture med kreft i bukspyttkjertelen celler. Imidlertid er graden av CD271 mRNA-ekspresjon deretter redusert etter forbigående økning. Videre ble CD271 mRNA uttrykk redusert i PSC avtaler migrere mot kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom Matrigel. I xenograft modell, CD271
+ pscs var til stede på tumor marginene /periferi og var fraværende i svulsten kjernen. Avslutningsvis ble CD271 uttrykt i PSC avtaler rundt pankreastumorer, men ikke i sentrum av svulstene, og uttrykket ble redusert etter lang coculture med kreft i bukspyttkjertelen celler eller etter bevegelse mot kreft i bukspyttkjertelen celler. Disse funnene tyder på at CD271
+ PSC avtaler vises på et tidlig stadium av bukspyttkjertelkreftutvikling, og at CD271 uttrykk er signifikant korrelert med en bedre prognose hos pasienter med PDAC
Citation. Fujiwara K, Ohuchida K, Mizumoto K , Shindo K, Eguchi D, Kozono S, et al. (2012) CD271
+ undergruppe av bukspyttkjertelen stel celler korrelerer med prognose av kreft i bukspyttkjertelen og er regulert av Interaksjon med kreftceller. PLoS ONE 7 (12): e52682. doi: 10,1371 /journal.pone.0052682
Redaktør: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, USA
mottatt: 19 juli 2012; Godkjent: 19 november 2012; Publisert: 27.12.2012
Copyright: © 2012 Fujiwara et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI tilskudd tall 24-1237, 23390327, 24659613, 23659654, 24390319, 22591524, 23-11109, 23659655, 24390318. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest dødelige kreftformer, og sin 5-års overlevelse er bare 4% [1]. Den er karakterisert ved overdreven desmoplasia, som spiller en avgjørende rolle i den aggressive oppførsel [2], [3]. Nylig har forskning på kreft biologi fokusert på kreft-stroma interaksjoner. Interaksjoner mellom kreftceller og stromale vev er avgjørende for utvikling og progresjon av tumorer [4]. Terapi rettet mot kreft-stroma interaksjoner kan representere en ny tilnærming for kontroll av kreft i bukspyttkjertelen.
bukspyttkjertelen stel celler (PSC avtaler) er identifisert som den viktigste kilden til overdreven ekstracellulære matrise observert i kronisk pankreatitt og bukspyttkjertelen adenokarsinom [ ,,,0],5], [6]. I likhet med leverstel celler, en viktig celletype for ekstracellulære matrise produksjon i hepatisk fibrose, PSC avtaler lagre fett dråper som inneholder vitamin A i sin cytoplasma [7]. PSC avtaler blir aktivert ved stimulering av ulike autokrine eller parakrine faktorer. De uttrykker α-glatt muskel aktin (α-SMA) og produserer ulike ekstracellulære matrix proteiner [8], [9]. Løselige faktorer utskilt av aktiverte pscs fremme spredning, migrasjon, invasjon, og overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen celler mot gemcitabin terapi [10]. Således pscs spiller en viktig rolle i kreft-stromaceller interaksjoner i bukspyttkjertelkreft.
Flere rapporter tyder på at stromale celler, slik som myofibroblasts og mesenchymale celler, isolert fra forskjellige humane vev viser ulike fenotyper [11], [12 ]. Vi har tidligere rapportert at CD10
+ pscs forbedre utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen celler [13]. Disse observasjonene tyder på at PSC avtaler har funksjonell heterogenitet og videre foreslå at PSC avtaler kan inneholde flere andre cellepopulasjoner som enkeltvis eller synergistisk påvirke utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen. Detaljert karakterisering av de pscs i bukspyttkjertelkreft vil bidra til å klargjøre den mekanisme som ligger til grunn interaksjoner mellom kreftceller og stromale celler, og kan tilveiebringe nye mål for stroma-rettet terapi.
CD271 (også kjent som nervevekstfaktor-reseptor , NGFR eller p75NTR) er et neurotrofin reseptor som har vært innblandet i den parakrine vekstregulering av et antall neuronale og ikke-neuronale tumortyper, [14], [15]. Nyere studier har fokusert på CD271, fordi det ble identifisert som en markør av humane stamceller [16], og det har vært vurdert som et viktig kreft stamcelle markør i melanom [17]. CD271 kan være en markør for en bestemt funksjonell underpopulasjon, slik som stemness. I bukspyttkjertelen, har CD271-ekspresjon i pscs blitt påvist [18]. Men CD271 uttrykk raskt redusert etter celle isolasjon fra bukspyttkjertelen vev [19]. Derfor rolle CD271 uttrykk i PSC avtaler er fortsatt uklart.
Hensikten med denne studien var å identifisere de spesifikke PSC avtaler som påvirker utviklingen av kreftceller ved å fokusere på uttrykk for CD271. Vi vurderte ytterligere betydningen av CD271 uttrykk i PSC avtaler.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Studiet ble godkjent av etikkomiteen av Kyushu University (godkjenningsnummer, 23 -64) og gjennomført i henhold til de etiske retningslinjene for human Genome /Gene Forskning vedtatt av den japanske regjeringen og Helsinki-deklarasjonen. Alle pasientene forutsatt signert informert samtykke godkjenne bruk av sine vev for uspesifiserte forskningsformål. For alle forsøk med mus, ble dyrene plassert i laminær-flow skap under spesifikke patogen-frie forhold i anlegg som er godkjent av Kyushu University (godkjenningsnummer, A24-112-0).
Pasienter og bukspyttkjertelen vev
kreft i bukspyttkjertelen vev ble innhentet fra 105 pasienter som gjennomgikk bukspyttkjertelen reseksjon for kreft i bukspyttkjertelen ved vår institusjon. De clinicopathologic kjennetegn ved pasientene er beskrevet i tabell S1. Overlevelse ble målt fra tidspunktet for bukspyttkjertel reseksjon inntil døden. Prognose ble bestemt i september 2011. Median total overlevelse var 23,5 måneder (range, 1-114 måneder). Seksti-to pasienter døde under oppfølging. Alle vev ved siden av prøvene ble undersøkt histologisk henhold til kriteriene for Verdens helseorganisasjon. Svulsten scenen ble vurdert i henhold til Union for International Cancer Control (UICC). Vi fikk også 31 normale bukspyttkjertelen (NP) prøver fra intakte bukspyttkjertelen vev resected for gallegang kreft, godartet solid-pseudopapillary svulst eller nevroendokrine svulster for bruk som kontroll vev. Vi videre samlet 10 bukspyttkjertel intraepitelial neoplasi (Panin) og 39 intraductal papillær mucinous svulst (IPMN) prøver.
Immunohistokjemiske prosedyrer og evaluering
Immunhistokjemisk farging ble utført ved hjelp av en Histofine SAB-PO Kit (Nichirei , Tokyo, Japan). Vevene ble seksjonert til en tykkelse på 4 um og ble inkubert med muse-monoklonalt anti-CD271 antistoff (1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) eller mus monoklonalt anti-α-SMA-antistoff (1:50; Dako, Glostrup , Danmark) over natten ved 4 ° C. Celler ble ansett å være positivt immunostained når membranen eller cytoplasma var farget. Vi identifiserte aktivert PSC avtaler basert på cellen morfologi (spindel-formet celler) og deres identitet ble bekreftet av α-SMA farging. Vi telles antallet celler i minst 10 felt avdeling ved 200 x forstørrelse. Å ta hensyn til heterogenitet i CD271 uttrykk, ble fordelingen av CD271 farging evaluert som prosenter av fargede celler og scoret som følger: 0, 0%; 1, al, 25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; eller 4, 76-100%. Tilsvarende ble den fargeintensitet gitt poeng som følger: 0 = ingen farging; 1, svak flekker; 2, moderat farging; eller 3, sterk farging. Til slutt, vi beregnet fargingen poengsum ved å multiplisere prosent poengsum av intensiteten poengsum. I kreft i bukspyttkjertelen celler, fordelt vi prøvene i høy farging 3 og lav farging 2 grupper. Alle lysbildene ble evaluert uavhengig av to etterforskere uten noen kunnskap om de kliniske funksjonene i hvert enkelt tilfelle.
Cells og kulturforhold
Menneskelige PSC avtaler ble isolert fra friske bukspyttkjertelen kirurgiske prøver ved hjelp av utvekst metoden i vår laboratorium [5], [20]. PSC celletype ble bekreftet ved morfologi (stellignende eller spindelformede celler) og ved immunofluorescens farging for α-SMA og vimentin [10], [13], [20]. PSC1 og PSC3-9 ble isolert fra kreft i bukspyttkjertelen. PSC2 og PSC10 ble isolert fra godartet cyste i bukspyttkjertel. PSC11 og PSC12 ble isolert fra normal bukspyttkjertelen område av kreft i bukspyttkjertelen vev. I tillegg vurderte vi to bukspyttkjertelkreft cellelinjer, SUIT-2 (Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japan) og CAPAN-2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). SK-N-MC, en human neuroepithelioma cellelinje (American Type Culture Collection) ble innkjøpt som en positiv kontroll for CD271 ekspresjon. Celler ved passasjene 3 til 8 ble anvendt for analyser. Cellene ble opprettholdt som tidligere beskrevet [21].
Immunofluorescence farging og laser-skanning mikroskopi konfokal
pscs (1 x 10
5) ble sådd ut på glassbunn retter (Matsunami , Osaka, Japan) og inkubert i 24 timer. I kulturer med supernatant, ble celler inkubert i 10% føtalt bovint serum (FBS) /DMEM med supernatant avledet fra kreft i bukspyttkjertelen celler i 72 timer. Cellene ble så fiksert med metanol, blokkert med 3% bovint serumalbumin i fosfat-bufret saltvannsløsning (PBS) og inkubert med et muse-monoklonalt anti-α-SMA-antistoff (1:50; Dako), et kanin monoklonalt anti- vimentin antistoff (1:50; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) og et monoklonalt anti-CD271 antistoff (1:50; Santa Cruz Biotechnology) over natten ved 4 ° C. Deretter ble cellene inkubert med Alexa 488-konjugert anti-mus IgG eller 546-konjugert anti-kanin-IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) i 1 time. Nukleær DNA ble motfarget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (0,05 ug /ml). En laser-scanning confocal fluorescerende mikroskop. (A1R; Nicon, Tokyo, Japan) ble brukt, og bildene ble administrert ved hjelp av NIS-Elements (Nikon)
Flowcytometri analyse
dyrkede celler var erholdt fra subsammenflytende monolagskulturer og inkubert med et fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert anti-CD271 antistoff (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Mus lgG1 K isotypekontroll FITC (Miltenyi Biotec) ble anvendt som en negativ kontroll. De merkede celler ble analysert ved flowcytometri ved hjelp av en FACS Calibur (Becton Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ).
Real-time kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved hjelp av en høy Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og DNase I (Roche Diagnostics). Real-time QRT-PCR ble utført ved hjelp av en QuantiTect SYBR Grønn Reverse Transcription-PCR Kit (Qiagen, Tokyo, Japan) og en Chromo4 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Primere for CD271 og β-aktin ble kjøpt fra Takara Bio Inc. (Tokyo, Japan). Sekvensen av oligonukleotidprimere anvendt i denne undersøkelsen var som følger: CD271, 5′-TCAGTGGCATGGCTCCAGTC-3 «(fremover) og 5′-GCAGTATCCAGTCTCAGCCCAAG-3′ (revers); p-aktin, 5»-TGGCACCCAGCACAATGAA-3 «(fremover) og 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3» (bakover). Hver reaksjonsblanding ble først inkubert ved 50 ° C i 30 min for å tillate revers transkripsjon. PCR-amplifikasjon ble deretter initiert ved inkubering ved 95 ° C i 15 min for å aktivere polymerase, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 20 s, og 72 ° C i 30 sek. Uttrykket nivåer av genene ble beregnet ved hjelp av en standardkurve konstruert ved hjelp av total RNA fra SK-N-MC celler. Uttrykket nivåer ble normalisert til den p-aktin-ekspresjonsnivåer som en intern kontroll, og uttrykt som forholdet mellom ekspresjon av målgenet som for β-aktin. Alle prøver ble kjørt i triplikat. Ingen påvisbare PCR produktene ble forsterket uten revers transkripsjon. Nøyaktigheten og integriteten av PCR produktene ble bekreftet ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, California).
In vitro coculture system
In vitro
cocultures ble utført ved hjelp av seks-brønns cellekultur sette følges plater og 3,0-mikrometer cellekulturinnsatser (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) som tidligere beskrevet [22]. Suit-2 og CAPAN-2-celler (5 x 10
5) ble sådd separat inn i de øvre kamrene i 24 timer etter utsåing to typer pscs (5 x 10
5) inn i de nedre kamre.
kultur med en kreftcelle-avledet supernatant
Suit-2 og CAPAN-2-celler ble dyrket under FBS frie betingelser i 48 timer. Deretter samles vi supernatantene fra kreftceller og justert dem til 10% FBS. Kreftcelle-avledede supernatanter ble deretter tilsatt til tidligere seeded pscs for etterfølgende kultur.
funksjonell separasjon av Matrigel invasjon assay
en seks-brønners cellekulturinnsats selskapsdyr plater og 8,0-um celledyrkningsinnsatser (Becton Dickinson Labware) ble belagt med Matrigel (150 ug /brønn; BD Biosciences, Bedford, MA). PSC avtaler (5 × 10
5 celler /2 ml) ble sådd i forkamrene. Tidligere har kreftceller (5 x 10
5) ble podet inn i de nedre kamre. Deretter ble cellene dyrket i 72 timer. Deretter fjernet vi cellene fra begge sider av det øvre kammer ved hjelp av trypsin. Etter to sentrifugeringer, ekstrahert vi mRNA fra cellene. Hvert eksperiment ble utført på triplikate brønner, og uavhengige eksperimenter ble gjentatt tre ganger.
In vivo forsøk
Suit-2 kreft i bukspyttkjertelen celler og to typer pscs ble anvendt for
i vivo
eksperimenter. Celler ble delt inn i tre grupper, bestående av Suit-2 celler alene, dress-2 celler med PSC1 celler, og dress-2-celler med PSC2 celler. Suit-2 celler (5 × 10
5) og PSC avtaler (5 × 10
5) suspendert i 100 mL PBS ble cotransplanted inn i bukspyttkjertelen halen av seks uker gamle kvinnelige SCID mus (Fox Chase SCID® CB-17 /LCR-SCID /scidJcl; Clea Japan Inc., Tokyo, Japan). Seks mus ble benyttet i hver gruppe. Tumorene ble resektert på dagene 8, 15 og 22 etter implanteringen. Vevene ble fiksert i 10% nøytral buffret formalin og innstøpt i parafin. Fire um vevssnitt ble farget med et musemonoklonalt anti-α-SMA-antistoff (Dako) og en kanin monoklonalt anti-CD271 antistoff (Millipore, Billerica, Massachusetts).
Statistisk analyse
Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Sammenligninger mellom to grupper ble utført ved hjelp av Student
t
-test. Statistisk signifikans ble definert som verdiene for p 0,05. En χ
2 test ble benyttet for å analysere sammenhenger mellom CD271 uttrykk og clinicopathologic egenskaper observert i immunhistokjemiske analyser. Overlevelsesanalyser ble foretatt ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og kurvene ble sammenlignet med log-rank test. For å evaluere uavhengige prognostiske faktorer assosiert med overlevelse, ble en multivariat Cox proporsjonal farer regresjonsanalyse brukt, med CD271 uttrykk, PT kategori, lymfeknutemetastase, UICC scenen, perilymphatic invasjon, perivaskulær invasjon, og patologisk margin som kovariater. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av JMP 8.0 programvare (SAS Institute, Cary, NC).
Resultater
stromale celler uttrykker CD271 i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC)
For å evaluere CD271 uttrykk i bukspyttkjertelen vev, utførte vi immunhistokjemi for CD271. I samsvar med en tidligere rapport [23], observerte vi sterk farging av nerver som en positiv kontroll. Epitelceller normale bukspyttkjertel kanaler viste ingen uttrykk for CD271, og PDAC celler var unstained. Ved normal bukspyttkjertel (NP), ble stromale celler over hele bukspyttkjertelen kanalen sjelden farget (figur 1A-a). Men observerte vi at stromale celler ble sterkt farget rundt bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi (Panin) (figur 1A-b) og intraductal papillær mucinous svulst (IPMN) (figur 1A-c). I PDAC svulster, ble stromale celler rundt kreft i bukspyttkjertelen celler delvis farget. Men CD271
+ stromale celler var ikke ved siden av kreftceller i PDAC, og var sterkt farget på kanten i stedet for sentrum av svulstene (figur 1A-d). CD271 høy flekker i stromale celler var til stede i 6,5% (2/31) av NP, 30,0% (3/10) av Panin, 27,6% (29/105) av PDAC og 84,6% (33/39) av IPMN. De CD271 høy farve ratene var signifikant høyere i stromale celler av IPMN (p 0,0001). Og PDAC (p = 0,0069) enn de i stromale celler av NP (tabell 1)
(A) Immunohistokjemisk farging for CD271 i bukspyttkjertelen vev. (A-a) I normal bukspyttkjertelen (NP), stromale celler sjelden beis positivt for CD271. (A-b, -c) stromale celler er sterkt farget rundt bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi (Panin) (b) og intraductal papillær mucinous svulst (IPMN) (c). (A-D) I pankreatiske ductal adenokarsinomer (PDAC), er stromaceller delvis farget, og CD271
+ stromale celler ikke er tilstøtende til kreft i bukspyttkjertelen celler. Svart pilspisser og piler indikerer CD271
+ celler og nerver som positiv kontroll i seriesnitt. (A-E) α-glattmuskel aktin (SMA) uttrykkes mest stromale celler rundt kreftceller og neoplastiske tubuli. Hvite pilspisser indikerer a-SMA celler i seriesnitt. Original forstørrelse: 200 ×, innfellinger: 600 ×. (B) Kaplan-Meier overlevelsesanalyse for CD271 høyt uttrykk i stroma av PDAC. Stromal CD271 høy uttrykket er assosiert med en god prognose (p = 0,0040).
stromal CD271 uttrykk uavhengig korrelert med god prognose
Vi har evaluert sammenhenger mellom stromal CD271 uttrykk og de clinicopathologic faktorer av PDAC. Selv om forskjellene ikke statistisk signifikans, PT1 /pT2, ingen lymfeknutemetastase, UICC scenen jeg, ingen perilymphatic invasjon, ingen perivaskulær invasjon, og patologisk margin /negativ ble observert oftere i stromal CD271high flekker gruppen enn i stromal CD271 lav farging gruppe (tabell 2). Interessant nok var stromal CD271 uttrykk i forbindelse med en god prognose i bukspyttkjertelkreft (p = 0,0040) (figur 1B). Median overlevelse ganger for CD271 høy farging og CD271 lav flekker pasientene var 62 og 18,5 måneder, henholdsvis. Deretter utførte vi en multivariat overlevelsesanalyse basert på Cox proporsjonal risikomodell for alle parametre funnet å være av betydning ved univariate analyser, inkludert stromal CD271 uttrykk, PT kategori, lymfeknutemetastase, UICC scenen, perilymphatic invasjon, perivaskulær invasjon, og patologisk margin positivitet (tabell S2). Stromal CD271 uttrykk ble funnet å være en uavhengig prognostisk markør i bukspyttkjertelen kreftpasienter, og den relative risikoen for stromal CD271 uttrykk var 0,495 (tabell 3).
CD271 stromale celler er en undergruppe aktiverte PSC avtaler
for å karakterisere CD271
+ stromale celler, utførte vi immunhistokjemi for α-SMA, en markør for aktiverte PSC avtaler, på serie PDAC seksjoner. Vi fant at α-SMA ble uttrykt i de fleste stromale celler rundt kreftceller og neoplastiske rørelementene (figur 1A-E). CD271
+ stromale celler ble begrenset til områder med sterk α-SMA uttrykk. Disse funnene tyder på at CD271
+ stromale celler er en undergruppe av aktiverte PSC avtaler.
CD271 uttrykk i menneskelige pscs
Vi isolert fem primærkulturer av PSC avtaler fra friske menneskelige bukspyttkjertelen vev, og deres identitet ble bekreftet ved immunfluorescens farging. PSC avtaler var stellignende eller spindel-formet og uttrykt α-SMA og vimentin (figur 2A). I disse immunfluorescens analyser, kan vi ikke påvise CD271 uttrykk i PSC avtaler (data ikke vist). Deretter evalueres vi CD271 uttrykk i 12 primærkulturer av humane PSC avtaler ved hjelp av flowcytometri, og fant CD271-positive priser på 0,0 til 2,1% i PSC avtaler (figur 2B).
(A) Representant mikro av immunfluorescens farging for a-glatt muskulatur aktin (SMA) (grønn) og vimentin (rød) i PSC avtaler. Kjerner ble motfarget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (blå). PSC avtaler viser en stellignende eller spindel-formet morfologi og uttrykke α-SMA. Original forstørrelse: 200 ×. (B) De positive tallene for CD271 uttrykk i PSC avtaler er 0,0 til 2,1% av flowcytometrisk analyse. Representative strømningscytometriske bilder av CD271 i aktiverte PSC avtaler er også vist (til høyre).
CD271
+ PSC avtaler er økt gjennom kreft-stroma interaksjoner
Vi undersøkte effekten av PSC avtaler på fenotypen av kreftceller ved anvendelse av en coculture system. Vi brukte to bukspyttkjertelkreft cellelinjer, dress-2 og CAPAN-2, og to primærkulturer av humane pscs isolert fra PDAC og godartede bukspyttkjertelen cyster. Etter monokultur eller coculture med kreft i bukspyttkjertelen celler i 72 timer, evaluert vi CD271 uttrykk i PSC avtaler ved hjelp av flowcytometri og real-time QRT-PCR. Ved strømningscytometri analyser, observerte vi at andelen av CD271
+ -celler var høyere i coculture enn i monokultur (0,7% mot 0,1%) (Figur 3A). Ved sanntid QRT-PCR-analyser, nivået av CD271 mRNA uttrykk i to kulturer av PSC avtaler var signifikant høyere i coculture med kreft i bukspyttkjertelen celler enn i monokultur (p 0,001) (figur 3B). Deretter samles vi supernatant fra SUIT-2 bukspyttkjertelkreftceller, og lagt den til to primære kulturer av PSC avtaler. Vi sammenlignet med nivåene av CD271 mRNA-ekspresjon hos monokulturer, kulturer med kreftcelle-avledet supernatant, og cocultures med kreft i bukspyttkjertelen celler i 72 timer. Nivået på CD271 mRNA uttrykk var høyest i cocultures med kreft i bukspyttkjertelen celler. I tillegg var nivået av CD271 mRNA-ekspresjon var høyere i kulturer med kreftcelle-avledet supernatant enn i monokulturer (p = 0,0053) (figur 3C). Ved immunfluorescens analyser, vi har oppdaget CD271 uttrykk i PSC avtaler ble noe økt i kultur med kreftcellen-avledet supernatant i motsetning til monokulturer (Figur 3D).
(A) I flowcytometri analyser, prosentandelen av CD271
+ -celler er høyere i coculture enn i monokultur (0,7-0,8% vs. 0,1%). (B) Nivåene av CD271 mRNA uttrykk i to kulturer av PSC avtaler er betydelig høyere i cocultures med kreft i bukspyttkjertelen celler enn i monokulturer (p 0,001). (C) Nivået av CD271 mRNA-ekspresjon er høyere i kulturer med en kreftcelle-avledet supernatant enn i monokulturer (p = 0,0053). (D) Representative mikrofotografi av immunofluorescens farging for CD271 (grønn) og α-glattmuskel aktin (SMA) (rød) i pscs. Kjerner ble motfarget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (blå). CD271 i PSC avtaler ble svakt uttrykt i kulturer med kreftcelle-avledet supernatant, selv om det var vanskelig å oppdage CD271 ekspresjon i monokulturer. Original forstørrelse: 200 ×. * P 0,01; ** P. 0,001
CD271 uttrykk reduseres etter forbigående økning i uttrykk når cocultured med kreft i bukspyttkjertelen celler
Vi brukte coculture system bestående av to bukspyttkjertelkreft cellelinjer, SUIT -2 og CAPAN-2, og to primærkulturer av humane pscs å vurdere tidsavhengige endringer i CD271 mRNA uttrykk. Etter monokultur eller coculture av PSC avtaler med kreft i bukspyttkjertelen celler for 1 til 5 dager, vurderte vi nivået CD271 mRNA uttrykk i PSC avtaler. I monokulturer, gjorde uttrykk for CD271 mRNA i PSC avtaler ikke endres. Men i cocultures med kreft i bukspyttkjertelen celler, nivået av CD271 mRNA-ekspresjon øket på dag 3 (p = 0,0249), og nådde en topp på dag 4 (p 0,0001). Interessant, nivåene av CD271-mRNA-ekspresjon ble redusert dagen etter peak uttrykket (p 0,0001) (figur 4A). Deretter samles vi supernatant fra CAPAN-2 kreft i bukspyttkjertelen celler, lagt det til to primære kulturer av PSC avtaler og evaluert de tidsavhengige endringer i CD271 mRNA uttrykk. I kulturer med supernatant, nivået av CD271 mRNA-ekspresjon øket på dag 2 (p 0,0001), og deretter redusert på dag 4 (p 0,0001) (figur 4B). I likhet med coculture med kreft i bukspyttkjertelen celler, redusert CD271 uttrykk etter at forbigående økning i uttrykk når cocultured med overstående.
(A) Real-time QRT-PCR-analyser viste at nivåene av CD271 mRNA uttrykk i PSC avtaler i coculture med kreft i bukspyttkjertelen celler begynner å øke på dag 3 (p = 0,0249), er høyest på dag 4 (p 0,0001), og deretter redusere den påfølgende dagen etter toppen uttrykk (p 0,0001). (B) I kulturer med tilsetning av kreftcelle-avledet supernatant, nivået av CD271 mRNA-ekspresjon startet å øke på dag 2 (p 0,0001), og deretter redusert på dag 4 (p 0,0001). (C) Evaluering av forskjellene i CD271 uttrykk avhengig av hvilken funksjon av PSC avtaler med real-time QRT-PCR. Nivået på CD271 mRNA uttrykk i øverste side avledet PSC avtaler, som ikke beveger seg mot kreftceller gjennom Matrigel og fortsatte saler, er lavere enn det som i bunn side avledet PSC avtaler, som fikk bevege seg mot kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom Matrigel (p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ikke signifikant.
CD271 uttrykk er redusert i PSC avtaler migrere gjennom Matrigel mot kreft i bukspyttkjertelen celler
Deretter evalueres vi CD271 uttrykk i PSC avtaler etter funksjonell separasjon ved hjelp av Matrigel invasjonen assay. I denne kulturen system som involverer forkamrene belagt med Matrigel, evaluert vi SUIT-2 kreft i bukspyttkjertelen celler og to primærkulturer av humane PSC avtaler. PSC avtaler i forkamrene ble inkubert i 72 timer i kultur med kreft i bukspyttkjertelen celler i hjertekamrene, eller som kontroller uten kreft i bukspyttkjertelen celler i hjertekamrene. PSC avtaler ble samlet inn fra de øvre og nedre sider av forkamrene separat. Den øverste side avledet pscs var celler som ikke vandrer mot kreftcellene gjennom Matrigel og forble i forkamrene. De nederste side avledet PSC avtaler ble cellene som migrerte mot kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom Matrigel og samlet på undersiden av forkamrene. Vi deretter analysert CD271 mRNA uttrykk nivåer i de øverste eller nederste side avledet PSC avtaler for å evaluere funksjonelle forskjeller mellom CD271
+ og CD271
– PSC avtaler. Nivået på CD271 mRNA uttrykk var høyest i toppside avledet PSC avtaler etter kultur med kreft i bukspyttkjertelen celler (p 0,001). Interessant, nivået av CD271 mRNA-ekspresjon i bunnside-avledede pscs migrerer mot kreft i bukspyttkjertelen celler var lavere enn det i den øverste side-avledede pscs som ikke bevege seg mot kreftceller (p 0,01). I kontrollene, var det ingen forskjeller i CD271 mRNA uttrykk nivåer mellom øvre og nedre side-avledet PSC avtaler, og disse nivåene var lave sammenlignet med nivåene av CD271 mRNA uttrykk i kulturer med kreft i bukspyttkjertelen celler (Figur 4C).
CD271
+ PSC avtaler er til stede i tumor marginene /periferi og er fraværende i svulsten kjernen
for å vurdere lokalisering av CD271
+ pscs
in vivo
, transplantert vi SUIT -2 kreft i bukspyttkjertelen celler i bukspyttkjertelen halen av SCID-mus eller cotransplanted dem med to primærkulturer av humane PSC avtaler. Vi avlives musene på dag 8, 15 eller 22, og evaluert for lokalisering av CD271
+ pscs i xenograft tumorer. Stromal CD271 ekspresjon ble påvist ved alle dager etter transplantasjon, uavhengig av transplantasjon eller cotransplantation. Stromal CD271 høy farve ratene var 50% (3/6), 60% (3/5), og 67% (4/6) på dagene 8, 15 og 22, respektivt. I alle tilfeller, vi har oppdaget CD271 uttrykk på nervebunter som en positiv kontroll, og funnet ut at kreft i bukspyttkjertelen celler aldri uttrykt CD271. Vi bekreftet tilstedeværelsen av aktiverte pscs ved en spindelformet morfologi og ved α-SMA-farging. Aktivert PSC avtaler eksisterte i xenografttumorer og normal pancreatic områdene rundt tumorer (figur 5A). Men CD271
+ pscs bare eksistert i normal bukspyttkjertelen områdene rundt xenografttumorer, og var fraværende i svulsten kjernen (figur 5B).
(A) α-SMA
+ stromale celler , som aktiverte PSC avtaler, finnes i xenograft tumor og normal bukspyttkjertelen (NP) områder (venstre side) rundt svulsten (høyre side). (B) Et par CD271
+ stromale celler var tilstede i NP området (venstre side) rundt xenograft tumor, og var fraværende i svulsten kjernen (høyre side). Original forstørrelse. 200 ×
Diskusjoner
Tidligere Trim et al, [18] rapporterte at CD271 ble uttrykt i PSC avtaler.. Haas et al., [19] også rapportert at CD271 ble svakt uttrykt i pscs og at nivået av CD271 mRNA-ekspresjon raskt redusert i primær rotte pscs under kultur. Vi fant ut at CD271
+ pscs eksistert i kirurgiske bukspyttkjertelen vev ved hjelp av immunhistokjemi. Imidlertid QRT-PCR og flowcytometri analyser avslørte at CD271-ekspresjon i pscs isolert fra pankreas vev var meget svak. Disse funnene tyder på at CD271 uttrykk i primære humane PSC avtaler også raskt redusert i løpet av kultur.
Vi fant at CD271 mRNA uttrykk ble midlertidig økt hos PSC avtaler cocultured med kreft i bukspyttkjertelen celler, noe som tyder på at kreft i bukspyttkjertelen celler forbedre CD271 uttrykk i PSC avtaler. Men dagens immunhistokjemiske analyser viste at CD271
+ PSC avtaler også fantes rundt Panin og IPMN, forstadier til kreft. Videre Trim et al., [18] rapporterte at CD271
+ PSC avtaler ble funnet i vev fra kronisk pankreatitt pasienter. Disse observasjonene tyder på utseendet CD271
+ PSC avtaler er ikke spesifikke for ondartede sykdommer, og er relatert til desmoplasia.
