Abstract
retinoider, naturlige eller syntetiske derivater av vitamin A (retinol), er avgjørende for normal utvikling av prostata og er blitt vist å modulere prostatakreft progresjon in vivo, så vel som å modulere veksten av flere prostata cancer-cellelinjer. 9-cis-retinsyre og all-trans-retinsyre er de to mest viktige metabolitter av retinol. Gap veikryss, dannet av proteiner som kalles connexins, er ensembler av inter kanaler som tillater utveksling av små vekst regulatoriske molekyler mellom tilstøtende celler. Gap junctional kommunikasjon er instrumental i kontroll av cellevekst. Vi undersøkt effekten av 9-cis-retinsyre og all-trans retinsyre på dannelse og nedbrytning av gap junctions så vel som på junctional kommunikasjon i en androgen responsiv prostatakreft-cellelinje, LNCaP, som uttrykte retroviralt innført connexin32, en connexin uttrykt av luminal celler og godt differensierte celler av prostatakreft. Våre resultater viste at 9-cis-retinsyre og all-trans retinsyre forbedret montering av connexin32 inn i gap veikryss. Våre resultater viste videre at 9-cis-retinsyre og all-trans-retinsyre forhindret androgen-regulert nedbrytning av gap junctions, post-translasjonelt, uavhengig av androgen-reseptor-mediert signalisering. Til slutt, våre funn viste at dannelsen av gap junctions sensibiliserte connexin32-uttrykk LNCaP-celler til vekstmodifiserende effekt av 9-cis-retinsyre, all-trans-retinsyre og androgener. Således kan virkningene av retinoider og androgener på vekst og dannelse og nedbrytning av gap junctions og deres funksjon være relatert til deres evne til å modulere prostatavekst og kreft
relasjon:. Kelsey L, Katoch P, Johnson KE , Batra SK, Mehta PP (2012) Retinoider Reguler Dannelse og Nedbrytning av gap veikryss i androgen-Responsive menneskelige prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (4): e32846. doi: 10,1371 /journal.pone.0032846
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 19 oktober 2011; Godkjent: 31 januar 2012; Publisert: 13 april 2012
Copyright: © 2012 Kelsey et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av NIH CA113903, DOD PCRP (Department of Defense Prostate Cancer Research Program) 081 198, og Nebraska State Grant LB506 (PPM). Vi erkjenner takknemlig støtte fra Nebraska Senter for Cellular alarm og NCI trening fellesskap til Kristen Johnson. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Retinoider, naturlige eller syntetiske derivater av vitamin A, regulerer ikke bare embryoutvikling, men også organogeneseperioden hos voksne vev [1]. Et behov for vitamin A for proliferasjon, differensiering har blitt vist i mange studier hvor en mangel på dette vitamin resulterte i flere utviklingsdefekter [1] – [3]. All-trans-retinsyre (ATRA) og 9-cis-retinoinsyre (9-CRA) er de to mest viktige metabolitter av vitamin A (retinol) med ulike fysiologiske funksjoner [1]. Retinoider er medlemmer av atom reseptor superfamily av transkripsjonsfaktorer og utøve sine mitogen effekt ved å regulere uttrykket av flere målgener [3] – [5]. Det er seks retinoid-reseptorer, nemlig RAR-α, p, y, som binder til ATRA og 9-CRA og RXR α, p, γ, som bindes bare til 9-CRA. Retinoid initiert signale regulerer flere homeostatiske kontrollmekanismer under embryonal utvikling og i voksent vev, og en slik styremekanisme sannsynlig skal reguleres er den direkte celle-celle-kommunikasjon formidles av en spesiell klasse av celler knutepunkter som kalles gap junctions (GJS) [6] – [ ,,,0],8]. Gap veikryss er ensembler av inter kanaler som signaliserer ved å tillate direkte utveksling av små molekyler (≤1500 Da) mellom tilstøtende celler. Bestanddels proteiner av GJS, kalt connexins (CXS), er kodet av 21 gener, som er blitt utpekt i henhold til deres molekylmasse [9]. Celle-celle-kanaler er bicellular strukturer dannet av samarbeid mellom to celler. For å danne et GJ celle-celle-kanal, CXS første oligomerisere som heksamer, kalt connexons, hvilken dokk med connexons vist på tilstøtende celler [10]. Flere linjer av bevis gir tilslutning til den oppfatningen at gapet junctional kommunikasjon er en viktig homeostatic kontroll mekanisme for å regulere cellevekst og differensiering. For eksempel, svekket Cx uttrykk, eller tap av funksjon, har vært innblandet i patogenesen av flere typer kreft, og mutasjoner i flere Cx gener har blitt påvist i genetiske lidelser kjennetegnet ved avvikende cellulær proliferasjon og differensiering [8], [10] – [12]
Våre tidligere studier har vist at prostata luminal cellene uttrykte Cx32 og dens uttrykk falt sammen med oppkjøpet av den differensierte tilstand av disse cellene [13], [14]. Vi viste at utviklingen av prostatakreft (PCA) fra en androgen-avhengige tilstand til en invasiv, androgen-uavhengig stat var preget av svikt i Cx32 å montere inn GJS [14], [15]. Vi har videre vist at gjeninnføring av Cx32 inn androgen-responsive human PCA cellelinje, LNCaP, forsinker cellevekst
in vivo Hotell og
in vitro product: [14], [16]. Deretter demonstrerte vi at androgener regulert dannelse og nedbrytning av GJS ved å endre nivået av ekspresjon Cx32, posttranslationally. I fravær av androgener, ble en vesentlig fraksjon av Cx32 degradert ved endoplasmatisk retikulum tilhørende degradering (erad), mens i deres nærvær denne fraksjon ble reddet fra degradering [17]. Betydningen av disse funnene understrekes av det faktum at androgener spille en viktig rolle i overlevelse og vedlikehold av sekretorisk (differensiering-relatert) funksjon av luminal epitelceller normal prostata samt tumorceller som androgen ablasjon induserer apoptose eller dedifferentiation av disse celler [18], [19]
som androgener, retinoider er også avgjørende for normal utvikling av prostata og modulere PCA progresjon i visse musemodeller samt undertrykke veksten av androgen-avhengige og – uavhengige menneskerettighets PCA cellelinjer. Plateepitel metaplasi av prostata ble observert blant avkom av vitamin A-mangel [20] og RARy knock out mus [21]. Videre vev-spesifikk inaktivering av RARα i prostata resulterte i multi-fokal intraepitelial hyperplasi [22]. Epidemiologiske studier har vist at redusert vitamin A serumnivåer øker PCA forekomst og progresjon, og at restaurering av retinoid nivåer kan ha en rolle i reversering av ondartede fenotype [23], [24]. Flere studier, inkludert våre, har vist at evnen til retinoider for å undertrykke tumorcellevekst og indusere differensiering er betinget av deres evne til å øke gapet junctional kommunikasjon [25] – [28]. Fordi Cx32 er uttrykt ved luminale epitel-celler i normal prostata hvor det er satt sammen til GJS og av epitelceller prostatatumorer i hvilket det er ineffektivt satt sammen til GJS [13] – [15] og fordi dannelsen av GJS har vært implisert i å opprettholde polarisert og differensiert tilstand av epitelceller [29], vi tenkte at chemopreventive, veksthemmende og pro-differensierende effekter av 9-CRA og Atrå kan skyldes deres evne til å kontrollere dannelse og nedbrytning av GJS. Derfor undersøkte vi om dannelse og nedbrytning av GJS sammensatt av Cx32 ble regulert av 9-CRA og Atrå i menneskelige PCA celler. Fordi retinoider har blitt vist å øke ekspresjonen av androgenreseptoren (AR) på androgen-responsive humane PCA-cellelinjer [30], rasjonalisert vi at de kan modulere androgen-regulert dannelse og nedbrytning av GJS og påvirke veksten av androgen-responsive PCA-celler som uttrykker Cx32. Ved hjelp av androgen-responsive LNCaP-celler som uttrykker retroviralt innført Cx32 hvis degradering er androgen-regulert [17], viser vi at 9-CRA og ATRA, som androgener, forbedre ekspresjonen av Cx32 og dens etterfølgende montering til GJS. Videre har vi videre viser her at det i dette cellekulturmodell, ATRA og 9-CRA forhindre androgen-regulert nedbrytning av GJS, uavhengig av AR-mediert signalisering. Til slutt, våre funn viser at uttrykket av Cx32 og dannelse av GJS sensitizes disse cellene til vekst modifisere effektene av 9-CRA, Atrå og androgener.
Materialer og metoder
Cell Culture
androgen-responsive LNCaP celler var en gave fra Dr. Lin [31]. En av flere kloner av LNCaP-celler som uttrykker retroviralt transdusert rotte Cx32, heretter referert til som LNCaP-32-celler, og en av de flere kontroll kloner ble valgt i G418 etter infeksjon med kontroll retrovirus, heretter referert til som LNCaP-N-celler, ble isolert som beskrevet [17] og ble anvendt i denne studien sammen med foreldre LNCaP-celler, heretter kalt LNCaP-P-celler. LNCaP-P-celler ble dyrket i RPMI inneholdende 5% føtalt bovint serum i en atmosfære av 5% CO2 /95% luft og stamkulturer ble opprettholdt ukentlig som tidligere beskrevet. LNCaP-N og LNCaP-32-celler ble holdt i RPMI inneholdende 5% føtalt bovint serum og G418 ved 200 ug /ml som beskrevet [17]. I løpet av disse undersøkelser brukte vi to separate masse føtalt bovint serum erholdt fra Sigma og HyClone Laboratories, med nesten tilsvarende effekt på veksten av LNCaP-celler. Steroid-utarmet (trekull-strippet) serum ble erholdt fra HyClone Laboratories (Salt Lake City, UT, USA). Vi brukte også fenol rød fri RPMI for eksperimenter der trekull-strippet serum ble brukt [17].
Antistoffer og Farging
hybrid M12.13 (en gave fra Dr. Dan Enough, Harvard university) er blitt beskrevet tidligere [14], [16], [17], [32], [33]. Mouse anti-occludin (klone OC-3F10) var fra Zymed Laboratories Inc. (South San Francisco, California). Kanin anti-α-catenin, kanin anti-β-catenin, kanin anti-Cx32, og mus anti-β-aktin (klon C-15) var fra Sigma (St. Louis, MO). Mouse anti-E-cadherin, mus anti-α-catenin, mus anti-β-catenin antistoffer ble sjenerøst gitt av legene. Johnson og Wheelock (Eppley Institute), og har blitt beskrevet [17], [32], [33]. En kanin polyklonale anti-AR-reseptor-antistoff var fra Santa Cruz Biotech (sc-13062, San Diego, California). Celler ble immunfarget etter fiksering med 2% para-formaldehyd i 15 min som tidligere beskrevet [17], [32], [33]. I korthet ble celler (1,5 x 10
5), sådd ut i seks brønn klyngene som inneholder glass dekkglass og tillatt å vokse til omtrent 50-70% konfluens, ble immunfarget ved romtemperatur med forskjellige antistoffer på hensiktsmessig kalibrert fortynninger. Sekundære antistoffer (kanin eller mus) konjugert med Alexa 488 og Alexa 594 ble brukt som passer. Bilder av immunostained celler ble kjøpt med Leica DMRIE mikroskop (Leica Microsystems, Wetzler, Tyskland) utstyrt med Hamamatsu ORCA-ER CCD-kamera (Hamamatsu-City, Japan). For samlokalisering studier, serie z-seksjoner (0,5 mikrometer) ble samlet og analysert ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (Volocity, Impro, Inc; Perkin Elmer).
Stock Solutions
Stamløsninger av forskjellige reagenser ble fremstilt som følger: 9-CRA og ATRA (BIOMOL, Plymouth, PA) ble fremstilt i etanol ved 3 mM av hver og lagret i alikvoter ved -80 ° C beskyttet mot lys. Alle eksperimenter som angår 9-CRA og ATRA ble utført i gult lys, som beskrevet [26], [27]. Stamløsninger av en syntetisk androgen, Mibolerone (MB), (BIOMOL), og av en naturlig androgen, dihydro-testosteron (DHT), ble fremstilt ved 1 mM i etanol og lagret ved -20 ° C i små aliquoter beskyttet mot lys. De ble passende fortynnet med mediet på tidspunktet for behandlingen.
Androgen Nedbrytning og andre behandlinger
Cellene ble utsådd i seks brønn klyngene som inneholder glass dekkglass (1,5 x 10
5-celler per brønn) og i 6-cm (2 x 10
5 celler pr tallerken) eller in10-cm skåler (3,5 x 10
5 celler pr tallerken) i 2, 4 og 10 ml komplett kultur medium, respektivt. Celler ble behandlet ved omtrent 50% konfluent, ved etterfylling av friskt medium inneholdende forskjellige reagenser ved den ønskede konsentrasjon tilsatt fra stamløsninger, slik at sluttkonsentrasjonen av løsningsmidlet ikke overskred 0,3%. For å dyrke celler under androgen-utarmet medium, ble normale cellekulturmediet erstattet med androgen-fratatte cellekulturmedium (fenolrødt-fritt RPMI inneholdende 5% trekull-strippet serum). Kontrollene fikk friskt medium inneholdende normalt serum.
Western Blot analyse og vaskemiddel Løselighet av Connexin32
cellelyse, oppløselighet vaskemiddel analysen med 1% Triton X-100 (TX-100) og uttrykket nivået av Cx32 ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse, som beskrevet [17], [32], [33]. I korthet, 5 x 10
5 LNCaP-P, LNCaP-N og LNCaP-32-celler ble sådd ut pr 10 cm plate i 10 ml fullstendig medium og dyrket til konfluens, hvoretter cellene ble lysert i buffer SSK (10 mM Tris , 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 10 mM NEM, 10 mM Na
2VO
4, 10 mM jodacetamid, 0,5% TX-100, pH 7,4) supplert med protease inhibitor cocktail (Sigma , St. Louis, MO). Total, vaskemiddel-oppløselige og -insoluble ekstrakter ble separert ved ultrasentrifugering ved 100.000 x g i 60 min (35 000 rpm i analytisk ultrasentrifuge Beckman, modell 17-65 ved hjelp av en SW50.1 rotor). De detergent-uløselig pellet ble oppløst i buffer C (70 mM Tris /HCl, pH 6,8, 8 M urea, 10 mM NEM, 10 mM jodacetamid, 2,5% SDS, og 0,1 M DTT). Etter normalisering basert på celle nummer, vil den totale, TX-100-løselige og -insoluble fraksjoner ble blandet med 4 x SDS-ladningsbuffer til en endelig konsentrasjon på 1 x og inkubert ved romtemperatur i 1 time (for Cx32) før SDS- PAGE analyse
kommunikasjons analyser
Gap junctional kommunikasjon ble analysert ved microinjecting følgende fluorescerende sporstoff. Lucifer Yellow (MW 443 Da; Lithium salt); Alexa Fluor 488 (MW 570 Da; A-10436), og Alexa Fluor 594 (MW 760 Da; A-10438). Stamløsninger av Alexa fargestoffer, framstilt som hydrazide natrium salter fra Molecular Probes (Carlsbad, California), ble utarbeidet i vann ved 10 mm. Lucifer gul ble microinjected som 2,5% vandig stamløsning. Eppendorf InjectMan og FemtoJet mikroinjeksjon systemer (modeller 5271 og 5242, Brinkmann Instrument, Inc. Westbury, NY), montert på Leica DMIRE2 mikroskop som beskrevet tidligere, ble brukt til å microinject fluorescerende sporstoff. Bildene av microinjected celler ble fanget ved hjelp av CCD-kamera (Retiga 2000R, FAST 1394) bruker QCapture (British Columbia, Canada) og lagret som TIFF-filer. Junctional overføring av fluoriserende sporstoff ble kvantifisert ved å utføre antallet fluorescerende celler (med unntak av den injiserte ene) fra de fangede TIFF-bilder enten ved 1 min (Lucifer gult), 3 minutter (Alexa 488) og 15 min (Alexa 594) etter mikroinjeksjon inn i testcellen som er beskrevet [14], [17], [32], [34].
kolonidannelse og Cell Growth Assays
celle~~POS=TRUNC veksten~~POS=HEADCOMP ble bestemt enten ved kolonidannende analyse eller ved telling celler som beskrevet [14], [34]. For kolonidannende analyse, 2 x 10
3-celler ble sådd ut i 6 cm skåler i tre eksemplarer i 3 ml dyrkningsmedium. Etter 24 timer, en ml medium inneholdende MB, 9-CRA og ATRA ble tilsatt til retter for å gi den ønskede sluttkonsentrasjon. Celler ble dyrket i 3-4 uker (med en utskiftning av medium hver 4-5 dager inneholdende den passende konsentrasjon av MB, DHT, 9-CRA og ATRA) når de er dannet synlige kolonier. Kolonier i rettene ble fiksert med 3,7% bufret formaldehyd, farget med 0,025% løsning av krystallfiolett i PBS, og fotograferte. For måling av cellevekst, 5 x 10
4 celler ble sådd ut i 6 cm skåler i replikat og behandlet med MB, 9-CRA og ATRA, enten alene eller i kombinasjon, som beskrevet ovenfor. Cellene fikk vokse i 9-11 dager med et medium endring på dagen 5. Cellene ble trypsinert og telt i en hemocytometer.
Resultater
Retinoider Forbedre Cx32 Expression nivå
Vi brukte LNCaP-32 celler som uttrykker retroviralt omsatte rotte Cx32 [17] fordi foreldre LNCaP-P og LNCaP-N cellene er blottet for detekterbare nivåer av kjent CXS og danner ikke funksjonelle GJS (Se Materialer og metoder). Tidligere studier viste at i LNCaP-celler 32 androgener regulert dannelse og nedbrytning av GJS ved regulering av ekspresjonsnivået av Cx32 posttranslationally, ved å redde sitt erad-mediert degradering [17]. Bakgrunnen er beskrevet ovenfor (se innledningen) og på vår erfaring med andre cellelinjer [26], [27], LNCaP-32 celler ble behandlet med 9-CRA og Atrå i 48 timer for å undersøke om de påvirker Cx32 uttrykk nivå. Vi har funnet at 9-CRA og ATRA øket Cx32 ekspresjonsnivået i en doseavhengig måte (figur 1 A). Signifikant forbedring ble imidlertid observert bare ved en konsentrasjon på 1 uM eller høyere. Som vurdert av kolonidannelse analysen, høyere konsentrasjoner enn 1 mikrometer var giftig for disse cellene (data ikke vist) og dermed valgte vi 1fiM av 9-CRA og Atrå for senere studier. Tidsforløpsstudier viste at forbedringen med begge retinoider fant sted så tidlig som 24 timer etter behandling og nådde et platå etter 72 timer (figur 1, B). Effekten av 9-CRA og ATRA på Cx32 ekspresjonsnivået var sammenlignbar med den som ble observert med en syntetisk androgen, Mibolerone (MB), og ble ikke observert med RAR-spesifikke ligander, 13-CRA og tetrahydrotetramethyl-nepthalenylpropanylbenzoic syre (TTNPB), eller med 4-hydroksy-phenretinamide (4-HPR) (figur 1C). Vi undersøkte også om 9-CRA og Atrå økt uttrykket nivået av andre cellekoblings forbundet proteiner. Vi har funnet at både 9-CRA og ATRA hadde ingen signifikant effekt på ekspresjonsnivået av adherens koplingsproteiner E-cadherin og α- og p-catenins, men ekspresjonsnivået av tett junction tilknyttet protein, occludin, ble forbedret i noen grad (figur 1D). Dessuten, 9-CRA og ATRA hverken indusert ekspresjon av endogene Cx32 i paren LNCaP-celler og heller ikke forandret ekspresjonsnivået av retroviralt transkribert Cx32 mRNA i LNCaP-32-celler som målt ved semi-kvantitativ RT-PCR-analyse (data ikke vist).
Cx32-uttrykker LNCaP-32 celler ble behandlet med 9-CRA, Atrå, MB og andre retinoider som angitt. A. Doseavhengig forsterkning av Cx32 ekspresjonsnivået ved 9-CRA og ATRA behandling i 48 timer. Legg merke til at betydelig forbedring er kun observert ved konsentrasjoner over 0,5 mikrometer. B. Kinetikk for økning av Cx32 ekspresjonsnivået ved behandling med 9-CRA og ATRA (1 uM) i de angitte tidsrom. Merk at ekstrautstyret er observert så tidlig som 24 timer. C. Kun 9-CRA og Atrå og MB øke Cx32 uttrykk nivå. Vær oppmerksom på at RAR-spesifikke retinoider, TTNPB (tetrahydrotetramethyl-nepthalenylpropanylbenzoic syre), og 13-CRA (13-cis-retinsyre), og den andre ikke-relaterte retinoid, 4-HPR, er ineffektive. Legg merke til at MB (2,5 nM) i det minste 300-500 ganger mer potent enn 9-CRA og ATRA på ekvimolar basis. D. Effekt av 9-CRA og Atrå på adherens og stramme koblings assosiert proteiner. Ekspresjon av adherens knutepunkt assosierte proteiner E-cadherin og a- og p-catenins, og stram junction tilknyttet protein, occludin, ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse av totalt cellelysat (5 ug). Merk at bare uttrykk for occludin ser ut til å endre merkbart.
Retinoider Forbedre Gap Junction Montering og junctional Kommunikasjon
Vi neste undersøkt effekten av 9-CRA og Atrå på montering av Cx32 inn GJS og på junctional kommunikasjon. Samtidig med en økning i ekspresjonsnivået av Cx32, 9-CRA og ATRA øket GJ sammenstilling som vurderes immunocytochemically (figur 2 A) og biokjemisk ved Western blot-analyse av total og Triton X (TX) -100-uløselige ekstrakter [16], [17], [35] fremstilt ved forskjellige tidspunkter etter behandling (figur 2 B). Dessuten, som vist i tabell 1, forbedring av GJ sammenstillingen ble fulgt av parallell økning i junctional kommunikasjon målt ved junctional overføring av tre GJ gjennomtrengelig fluoriserende sporstoff, Lucifer gult (MW 443), Alexa 488 (molekylvekt 570), og Alexa 594 (MW 760). For eksempel, 9-CRA og ATRA økt junctional overføring av Alexa 594 (MW 760) 2-3 folder sammenlignet med kontroller (tabell 1). Fordi E-cadherin har vist seg å lette monteringen av CXS inn i GJS [32], [33], og Cx uttrykk har vist seg å lette monteringen av tett veikryss [29], også undersøkte vi hvorvidt 9-CRA og ATRA øket uttrykket nivået av Cx32 og dens enheten i GJS indirekte ved å legge til rette for montering av andre celle veikryss som vurderes av vaskemiddel-insolubility av beskaffenhet og tilhørende proteiner. Vi har funnet at både 9-CRA og ATRA hadde ingen signifikant effekt på ekspresjonsnivået av adherens knutepunkt protein E-cadherin, men monteringen av tett junction protein, occludin, men ikke dens tilknyttet protein ZO-1, syntes å ha blitt forbedret (figur 2 B). Tatt sammen tyder disse data på at 9-CRA og ATRA, som androgener, øke ekspresjonsnivået av Cx32, og dens etterfølgende montering til GJS, uten vesentlig å endre ekspresjon av E-cadherin, som har vist seg å modulere montering av GJS [32], [33], [36], [37]. Som ble observert i våre tidligere studier med androgener, montering av Cx32 og occludin inn celle veikryss, eller vice versa, ser ut til å være regulert coordinately [17], [29], [38], [39].
A. LNCaP-32 celler, dyrket enten i seks brønn klynger eller 10 cm retter, ble behandlet med 9-CRA og Atrå for ulike tider. Montering av Cx32 (grønn) i GJS ble vurdert immunocytochemically. E-cadherin er vist i rødt. Merk at GJ formasjonen ble forbedret med 9-CRA og Atrå og MB behandling. B. Montering av Cx32 inn GJS, med stramme krysset assosiert protein, occludin og ZO-en, og adherens krysset protein, E-cadherin, ble vurdert biokjemisk ved TX100 insolubility analyse som beskrevet i materialer og metoder. Legg også merke til at både det totale nivå og detergent-uoppløselige fraksjon av Cx32 økt betydelig. Merk også at vaskemiddel-løseligheten av adherens junction assosierte proteiner, E-cadherin, ikke er vesentlig påvirket mens den for stramt krysset assosiert protein, occludin blir marginalt forbedret. In (A), er kjernen (blå) farget med DAPI.
Retinoider modulere Androgen-regulert Dannelse og Nedbrytning av gap veikryss
Våre tidligere studier viste at Cx32 ble degradert ved androgen uttømming av erad, og at androgener forbedret GJ formasjon ved å re-ruting erad målrettede pool av Cx32 til celleoverflaten [17]. Tilskyndet av dataene som er vist i figurene 1 og 2, vi neste undersøkte ekspresjonsnivået av Cx32 og dens junctional og ikke-junctional skjebne på androgen uttømming i nærvær og fravær av 9-CRA og ATRA. For disse studiene ble cellene dyrket i androgen-utarmet (trekull-strippet), fenol rød-fritt celledyrkningsmedium. I samsvar med tidligere studier [17], fant vi at androgen uttømming redusert Cx32 uttrykk nivå, som ble forhindret ved tilsetning av MB og DHT (figur 3 A). Men fant vi at nedgangen i uttrykket nivået av Cx32 ble også hindret når androgen-fattig medium ble fylt opp med 9-CRA og Atrå (figur 3 A). Dessuten, kombinert behandling med MB og 9-CRA eller ATRA var hverken synergistisk eller additiv med hensyn til Cx32 uttrykksnivå (figur 3 A). For å underbygge ovennevnte data, vurdert vi dannelsen av GJS immunocytochemically (figur 3 B), biokjemisk av vaskemiddel insolubility analysen (figur 3 C), og funksjonelt ved å måle junctional overføring av Lucifer Yellow (MW 443 Da), Alexa 488 (MW 570 Da), og Alexa 594 (MW 760 Da) (tabell 2). Som vist i figur 3B, androgen uttømming redusert antall GJS drastisk som Cx32-spesifikk immunfarging ble sjelden observert ved celle-celle-kontaktområder, mens GJS lett ble påvist i cellene når androgen-utarmet medium ble supplert med 9-CRA og ATRA og med MB og DHT (figur 3 B). I samsvar med den immunocytokjemisk data, junctional Overføringen av Lucifer gult redusert betraktelig på androgen uttømming, som ble forhindret ved påfylling av androgen-utarmet medium med MB, ATRA og 9-CRA (tabell 2). Vaskemiddelet insolubility analysen ytterligere bekreftet den immunocytokjemisk og synaptiske overføre data (figur 3 C). Som ble observert i våre tidligere studier, uttømming av androgener hadde ingen signifikant effekt på vaskemidlet oppløseligheten av E-cadherin og β-catenin og tett junction tilknyttet protein, ZO-1 (figur 3C). Som en kontroll, uttømming eller tillegg av androgener, 9-CRA og Atrå til foreldre LNCaP-P og G418-resistente LNCaP-N celler verken indusert GJ montering heller ikke hadde noen effekt på junctional overføring (data ikke vist). Samlet tyder disse dataene at 9-CRA og Atrå hindre androgen-regulert nedbrytning av Cx32 og forbedre GJ formasjonen i LNCaP-32 celler. Fordi kombinert behandling med androgener og retinoider var verken synergistisk eller additiv, dataene videre foreslå at GJ dannelse er forbedret ved å redde den samme pool av Cx32 som er målrettet for erad på androgen uttømming.
LNCaP-32 celler, dyrket 70% samløpet enten i seks brønn klynger eller 10 cm retter, ble byttet til kull-strippet, androgen-utarmet (Strip) medium. Ekspresjonsnivået av Cx32 og dannelse av GJS ble analysert ved hjelp av Western blot (A) og immuncytokjemisk analyse (B) etter 48 timer i nærvær og fravær av 9-CRA og ATRA (1 uM) og MB (2,5 nM) og DHT (10 nM). C. Dannelse av GJS ble også analysert ved hjelp av Western blot-analyse av total, vaskemiddel-oppløselige og -insoluble fraksjoner, som beskrevet i Materialer og Metoder. Merk at Cx32 og GJS blir degradert i androgen-fattig medium og degradering blokkert ved etterfylling med 9-CRA, Atrå, MB og DHT. Legg også merke til at bare ekspresjonsnivået av Cx32 og dets løselighet vaskemiddel betydelig endret mens den for E-cadhiern (E-CAD), β-catenin (β-katt) og ZO-1 ble ikke signifikant påvirket. I (B), ble kjernene (grønne) farget med DAPI. I A, 10 mikrogram total protein ble analysert.
Retinoider Forbedre Gap Junction Dannelse Uavhengig av androgen Receptor Funksjon
Behandling av LNCaP celler med 9-CRA har vist for å forbedre AR ekspresjonsnivået [30]. For å teste om 9-CRA og ATRA forbedret AR-ekspresjon i normalt og androgen-utarmet medium, vokste vi LNCaP-32 celler i kontrollen, androgen-utarmet, og androgen-utarmet pluss 9-cra, ATRA og MB inneholdende medium i 48 timer. Som vurdert ved Western blot-analyse, har vi funnet at androgen uttømming redusert både uttrykket nivået av AR og Cx32, som ble forhindret ved etterfylling med MB, DHT, 9-CRA og ATRA (figur 4 A). Disse dataene hevet muligheten for at 9-CRA og Atrå forbedret GJ montering i en AR-avhengig måte – og ikke uavhengig av hverandre. For å teste dette begrepet, behandlet vi LNCaP-32-celler med Casodex (Bicalutamide), som blokkerer androgen virkning ved å konkurrere med androgener, for binding til AR og inhibere funksjon [40], [41], og undersøkt ekspresjonsnivået av Cx32 og GJ dannelse ved behandling med 9-cra, ATRA og MB i nærvær og fravær av Casodex i normal og androgen-utarmet medium. I samsvar med tidligere undersøkelser, har vi funnet at behandling med Casodex forårsaket degradering av AR (figur 4 B), så vel som opphevet virkningen av MB og DHT på Cx32 ekspresjon som ble observert i våre tidligere studier [17]. Imidlertid degradering av AR ble også observert med Casodex i nærvær av 9-CRA og ATRA både i androgen-utarmet og normal medium. Til tross for robust mink AR uttrykk nivå, fant vi at Casodex hadde ingen effekt på 9-kan tas ut og Atrå-mediert forbedring av Cx32 uttrykk nivå. For å sannsynliggjøre at reduksjon og økning i Cx32 uttrykk ble ledsaget av parallelle endringer i GJ formasjon, undersøkte vi dannelsen av GJS immunocytochemically i Casodx-behandlede celler i nærvær og fravær av MB, 9-CRA og Atrå. GJS ble ikke dannet når cellene ble behandlet med Casodex i normalt serum eller i androgen-utarmet medium inneholdende MB eller DHT (figur 5). På den annen side har vi funnet at GJS var rikelig når cellene ble behandlet med Casodex sammen med 9-CRA eller ATRA (Figur 5). Disse dataene tyder på at mekanismen ved hvilken 9-CRA og ATRA forhindre degradering av Cx32 og forbedre GJ dannelse på androgen uttømming er uavhengig av AR ekspresjonsnivået og /eller funksjon eller begge deler.
A. LNCaP-32 celler ble dyrket til 70-80% konfluens i 6 cm retter. Celler ble byttet til trekull-strippet, androgen-utarmet medium (ST) inneholdende 9-CRA og ATRA (1 uM) og MB (2,5 nM) og DHT (10 nM) i 24 timer. Celler i androgen-inneholdende medium (NS) eller androgen-utarmet medium (ST) ble anvendt som kontroller. Ekspresjonsnivået av Cx32 og AR ble analysert ved Western blotting. Merk at uttrykket nivået av både Cx32 og AR synker på androgen utarming og nedgangen er blokkert ved behandling med 9-CRA, Atrå, MB og DHT. B. LNCaP-32 celler, seeded som ovenfor, ble behandlet med 9-CRA og ATRA (1 uM) og MB (2,5 nM) og DHT (10 nM) i nærvær og fravær av Casodex (10 uM) i normal og androgen-fattig medium. Expression nivå av Cx32 og AR ble undersøkt etter Western blotting. Merk at i Casodex inneholdende medium, betyr uttrykket nivå Cx32 ikke reduseres i nærvær av 9-CRA og ATRA (1 uM) på trekull-strippet medium til tross for lavt nivå av AR uttrykk. Dette er ikke observert med MB og DHT.
LNCaP-32 celler, seeded i seks brønnklynger som inneholder glass dekkglass, fikk lov til å vokse til 70% samløpet. Cellene ble deretter dyrket i ytterligere 24 timer i normal medium (NS), på trekull-strippet, androgen-utarmet medium alene (ST) i normalt serum inneholdende Casodex (NS + CDX), og i androgen-utarmet medium supplert med MB ( ST + MB), med MB og Casodex (ST + MB + CDX), med 9-CRA (ST + CRA), 9-CRA og CDX (ST + CRA + CDX), med ATRA (ST + ATRA), og med ATRA og CDX (ST + Atrå + CDX). Nedbrytning og subcellulær lokalisering av Cx32 ble analysert immunocytochemically som beskrevet i Materialer og Metoder. Legg merke til at GJS (grønn) ikke blir nedbrutt i celler behandlet med 9-CRA og ATRA både i nærvær og fravær av Casodex, mens de blir nedbrutt i normalt serum og androgen-utarmet men MB supplementert medium inneholdende Casodex.
Se artikkel
PubMed /NCBI
Google Scholar
to.
