Abstract
Magekreft er den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis, og mangler svært effektiv behandling ved avansert sykdom. Fakke-paclitaxel er en roman microtubule-hemmende cytotoksisk middel som ikke har blitt testet i magekreft som foreløpig. I denne studien ble menneskelige mage kreft cellelinjer AGS, NCI-N87 og SNU16 studert. Nab-paclitaxel hemmet celleproliferasjon med en IC50 på 5 nM i SNU16, 23 nM i AGS og 49 nM i NCI-N87-celler etter 72 timers behandling, noe som var lavere enn den til oxaliplatin (1,05 uM til 1.51 uM) og epirubicin ( 0,12 mikrometer til 0,25 mikrometer). Nab-paclitaxel behandling øket ekspresjon av den mitotiske spindel-assosiert fosfo-stathmin uavhengig av grunnlinjen total eller fosforylert stathmin nivå, og induserte mitotisk celledød som bekreftet gjennom økt ekspresjon av spaltet-PARP og caspase-3. Etter en to-ukers nab-paclitaxel, oksaliplatin eller epirubicin behandling, den gjennomsnittlige in vivo lokale tumorvekstinhibitering hastighet var 77, 17,2 og 21,4 prosent, henholdsvis (p = 0,002). Effekter av terapi på tumor proliferative og apoptotiske indekser korresponderte med tumorvekstinhibitering data, mens uttrykk for fosfor-stathmin også økt i vev. Det var en økning i median dyr overlevelse etter nab-paclitaxel behandling (93 dager) sammenlignet med kontroller (31 dager, p = 0,0007), oksaliplatin (40 dager, p = 0,0007) eller til docetaxel terapi (81 dager, p = 0,0416) . Den sterke antitumor aktivitet av NAB-paclitaxel i eksperimentell magekreft støtter en slik microtubule-hemmende strategi for klinisk anvendelse. Fakke-paclitaxel fordelene ble observert uavhengig av fosforylert stathmin uttrykk ved baseline, setter spørsmålstegn ved behandlingen av NAB-paclitaxel bruk i magekreft basert på denne antatte biomarkør
Citation. Zhang C, Awasthi N, Schwarz MA, Hinz S, Schwarz RE (2013) Superior Antitumor aktivitet av partikler albuminbundet paclitaxel i eksperimentell Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10,1371 /journal.pone.0058037
Redaktør: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, Storbritannia
mottatt: 20 november 2012; Godkjent: 29 januar 2013; Publisert: 27 februar 2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde mest utbredt. kreft og den nest hyppigste årsak til kreft-relaterte dødsfall over hele verden [1] – [3]. De fleste pasienter har avansert eller metastatisk sykdom ved tidspunktet for diagnose [4], [5]. Kombinasjonen av oksaliplatin og 5-fluorouracil, med og uten epirubicin, har blitt den mest brukte regime i førstelinje kjemoterapi for avansert magekreft [6], [7]. Imidlertid har denne kombinasjonsbehandlingen potensialet for betydelige bivirkninger, og fremdeles bærer begrenset effekt, mens pasientens prognose forblir sturen med en median overlevelsestid på rundt 10 måneder [8] – [11]. I et forsøk på å bedre overlevelse og for å redusere toksisitet, er molekylært målrettet terapi blir aktivt undersøkt for behandling av magekreft [12].
mikrotubuli har lenge vært ansett som et mål av interesse for noen kreft narkotika på grunn av deres universelle rolle i prolifererende celler og deres viktige rolle i mitosen [13] – [15]. Paclitaxel og docetaxel er klassiske mikrotubulidynamikk hemmere som utøver sin virksomhet ved å fremme tubulinpolymerisering og stabilisering av mikrotubuli som resulterer i G2-M fasen arrest og mitotisk celledød [15]. Mitotiske celledød er en modus for celledød som oppstår spesielt i løpet av mitotiske faser indusert ved DNA-ødeleggende midler og spindelgifter /mitotiske inhibitorer [16], [17]; det er hovedsakelig caspase avhengig, men under sjeldne tilfeller kan også caspase uavhengig [18]. Paclitaxel har blitt testet for avanserte og tilbakevendende magekreft med en svarprosent på 43% i kombinasjon med 5-fluorouracil og folinsyre [9], [19]. Sammenlignet med den svarprosent på 38~45% gitt ved en kombinasjon av oksaliplatin med 5-fluorouracil og folinsyre, paclitaxel førte ikke til overlegen overlevelse men forårsaket flere bivirkninger, spesielt hos eldre pasienter [9], [20] – [ ,,,0],22]. Paclitaxel nødvendig emulgering med løsemidler for å tillate intravenøs administrasjon som har resultert i hypersensitivitetsreaksjoner og potensielt dramatiske bivirkninger hos pasienter [23], [24]. Nanopartikkel albuminbundet (NAB) paclitaxel er en ny albumin-stabilisert, Cremophor-fri og vannoppløselig nanopartikkel formulering av paclitaxel. Det er godt tolerert uten overfølsomhetsreaksjoner etter intravenøs infusjon [25]. Kliniske og eksperimentelle studier viser at sammenlignet med oppløsningsmiddelbasert paclitaxel, NAB-paclitaxel hadde høyere tumor retensjon, lavere toksisitet [23], [26], og mer potente antitumoreffekter på brystcancer, ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC), pankreatisk kreft, melanom, og hode- og halskreft [27] – [31]. Imidlertid er den potensielle rolle nab-paclitaxel i magekreftceller ikke testet som av ennå
Stathmin, en microtubule-destabiliserende phosphoprotein, er en viktig regulator av microtubule polymerisasjon og dynamikk [32] -. [34] , og ble funnet å være relatert til taksan motstand i visse tumortyper gjennom å endre medikament binding og forsinke G2-M-fase overgang [33], [35]. Stathmin hemming hadde en synergistisk antiangiogen og antitumor aktivitet med taxol [36]. Stathmin ekspresjon har blitt funnet å være til stede i et bredt spekter av humane kreftformer, inkludert magekreft, og kan derfor representere et attraktivt mål for cancerterapi [34], [37], [38]. Jeon et al. fant at stathmin kan tjene som en prognostisk markør og en potensiell terapeutisk mål for magekreft [37]. Fosforylering av stathmin reduserer sine mikrotubulidynamikk destabiliserende effekter, et fenomen som også har blitt tilskrevet taxan aktivitet [34].
Denne studien evaluerte antitumor aktivitetene til NAB-paclitaxel i menneskelige mage kreftceller in vitro og in vivo. Vi sammenlignet antitumor effekt av nab-paclitaxel til andre cytotoksiske midler på lokal tumorvekst og dyr overlevelse. Vi målte også uttrykk for total stathmin og fosfor-stathmin in vitro og in vivo for å vurdere sin rolle som prediktive markører i nab-paclitaxel antitumor respons.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
den menneskelige mage kreft cellelinjer AGS, NCI-N87 og SNU16 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og dyrket i RPMI 1640 medium (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Nab-paclitaxel ble kjøpt fra Abraxis BioScience (Los Angeles, California). Oksaliplatin ble kjøpt fra Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ). Docetaxel, epirubicin og 5-fluoruracil ble erholdt fra et lokalt apotek. Den celleproliferasjon reagent WST-en ble kjøpt fra Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble evaluert av kolo WST-1-analysen. Målingen er basert på evnen av levedyktige celler til å spalte den sulfonerte tetrazoliumsalt WST-1 (4- [3- (4-jodfenyl) -2- (4-nitrofenyl) -2H-5-tetrazolio] -1, 3- benzen disulfonat) av mitokondrie dehydrogenases [39]. Gastrisk kreft celler (5000 celler per brønn) ble sådd ut i en 96-brønns plate i regelmessig vekstmedium og ble behandlet med nab-paclitaxel, 5-fluorouracil, oksaliplatin og epirubicin etter 16 timer inkubasjon. Det konsentrasjonsområde som brukes (1 nM til 10 uM) var sammenlignbare med deres klinisk oppnåelige konsentrasjoner. Etter ytterligere inkubering i 72 timer ble 10 ul WST-1-reagens tilsatt i hver brønn, fulgt av inkubering i 2 timer. Absorbansen ved 450 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser.
cellesyklusanalyse
cellesyklusanalyse ble utført ved strømningscytometri med fluorescerende propidiumjodid (PI) farging. Celler ble dyrket og behandlet med NAB-paclitaxel, oksaliplatin, epirubicin og docetaxel i 8 til 24 timer. Cellene ble deretter samlet opp og fiksert i 75% etanol-PBS over natten ved -20 ° C. Cellene ble sentrifugert i 5 minutter ved 2000 x g. Cellepelleten ble resuspendert og inkubert i 0,05 mg /ml PI, 0,1% Triton X-100, og 1 mg /ml RNase A i PBS i 45 minutter ved romtemperatur. Suspensjonen ble deretter analysert på en Becton Dickinson FACScan. Forholdet mellom celler i sub-G1, G1, S og G2-M-fasene av cellesyklusen ble bestemt ved deres DNA-innhold.
immunocytokjemisk analyse
magecancer-celler (1 x 10
5 celler pr kammer) ble sådd ut i en fire-kammer lysbilde i vanlige vekstmedium. Etter 24 timer ble cellene behandlet med NAB-paclitaxel i 16 timer og deretter fiksert i 4% paraformaldehyd. Celler ble inkubert med CAS blokkeringsbuffer, etterfulgt av 1 times inkubering med fosfo-stathmin antistoff (1:100) og 40 minutters inkubering med Cy3 (1:200 fortynning) sekundært antistoff. Objektglassene ble montert ved hjelp av monteringsløsning inneholdende 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fluorescens mikroskopi ble brukt til å oppdage fluorescerende signaler ved hjelp av IX81 Olympus mikroskop utstyrt med en Hamamatsu Orca digitalkamera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ).
Western blot analyse
Under konfluente monolag av celler ble behandlet med nab-paclitaxel, oksaliplatin og epirubicin. Cellelysater og tumor lysater ble oppnådd som tidligere beskrevet [40]. Supernatanter ble utvunnet ved sentrifugering ved 13 000 rpm, proteinkonsentrasjoner ble målt og like mengder av totalt protein ble separert ved SDS-PAGE. Proteiner ble overført til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA) og membranene ble blokkert i en time i TBS-T. Membranene ble inkubert over natten ved 4 ° C med følgende antistoffer: total stathmin, fosfo-stathmin (ser38), spaltet poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), spaltet caspase-3 (alt fra Cell Signaling Technology , Beverly, MA), α-tubulin og β-aktin (begge fra Sigma, St. Louis, MO). Membranene ble deretter inkubert med de tilsvarende HRP-konjugert sekundært antistoff (Pierce Bioteknologi, Santa Cruz, CA) i en time. Spesifikke bånd ble påvist ved hjelp av den forbedrede chemoilluminescence reagens (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) på autoradiografisk film.
Subkutan tumorvekst studie
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med de retningslinjer og godkjente protokoller ved University of Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Institutional Animal Care og bruk Committee (Permit Number 2012-0081). Dyrene ble overvåket daglig gjennom hele eksperimentet for eventuelle tegn på nød. Hunn SCID-mus (6 til 8 uker), ble anvendt for sammenliknende modellering av subkutan tumorvekst. Gastric kreftceller (10 × 10
6 NCI-N87 eller 20 × 10
6 SNU16 celler) ble subkutant injisert i hver mus. Musene ble veid to ganger i uken. Fjorten dager etter tumorcelle-injeksjon, alle musene hadde målbar tumor (et gjennomsnittlig tumorstørrelse på 100 til 150 mm
3). Mus ble deretter tilfeldig gruppert (n = 6~8 pr gruppe) og behandlet intraperitonealt med PBS (kontroll), fakke-paclitaxel (10 mg /kg i 100 ul PBS, 2 ganger i uken), oksaliplatin (5 mg /kg i 100 ul PBS, 2 ganger i uken), og epirubicin (1 mg /kg i 100 ul PBS, 2 ganger i uken) i 14 dager. Den tumorstørrelse ble målt to ganger ukentlig via skyvelære, og tumorvolum (V) ble beregnet ved hjelp av formelen V = ½ [L x (W)
2], L = lengde og W = bredde. Relativ tumorvolum (RTV) ble bestemt i henhold til formelen RTV = V
n /V
0 hvor V
0 og V
1 representerer tumorvolumet på dag 0 og etterfølgende måling dag, henholdsvis. Den tumorvekstinhibitering hastigheten ble beregnet ved hjelp av formelen (1-RTVt /RTVc) x 100% hvor t og c representerer behandlingsgruppen og kontrollgruppen. Etter fullførelse av behandlingen ble alle musene avlivet med CO2, tumorer ble fjernet, veiet, dissekert og bearbeidet for histologisk, immunohistokjemisk og Western blot-analyse.
Immunhistokjemisk analyse
tumorvev prøver ble fiksert i 4% paraformaldehyde og dyppet i parafin. Intratumoral spredning ble målt ved Ki67 kjernekraft antigen flekker som per produsentens protokoll (Abcam, Cambridge, MA). Parafininnstøpte vevssnitt ble kuttet (5 mikrometer), deparaffinized, rehydrert og antigen hentes. De vevssnitt ble inkubert med CAS blokkeringsbuffer etterfulgt av en times inkubasjon med 1:200 fortynning av primær Ki67 eller fosfor-stathmin antistoff (1:200) og 40 minutter inkubasjon med Cy3 (1:200 fortynning) sekundært antistoff. Lysbilder ble montert ved hjelp av monteringsløsning som inneholder 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) (Invitrogen). Intratumoral proliferativ indeks og stathmin aktivitet ble evaluert ved å beregne positive celler fra fem forskjellige kraftige felt (HPF) i en blindet måte. Intratumoral apoptotisk aktivitet ble evaluert ved farging vevssnitt med «Apoptag apoptose Detection Kit» i henhold til produsentens (Millipore) instruksjoner. Fluorescens mikroskopi ble brukt til å oppdage fluorescerende signaler ved hjelp av IX81 Olympus mikroskop utstyrt med en Hamamatsu Orca digitalkamera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) og en DSU spinne konfokal enheten med Slidebook programvare (Intelligent Imaging Innovations, Philadelphia, PA).
Animal overlevelsesanalyse
Dyreoverlevelsesstudier ble gjennomført med 6- til 8-ukers gamle kvinnelige SCID-mus [41]. Musene ble injisert intraperitonealt med SNU16 (40 x 10
6) celler og kroppsvekt ble målt to ganger i uken. Tre uker etter tumorcelle-injeksjon ble musene tilfeldig gruppert (n = 6 til 8 per gruppe).
I den første studien overlevelse, ble musene behandlet intraperitonealt med PBS (kontroll), fakke-paclitaxel (10 mg /kg i 100 mL PBS, 2 ganger i uken), og oksaliplatin (5 mg /kg i 100 mL PBS, 2 ganger i uken) i 2 uker. I den andre overlevelse undersøkelsen ble musene behandlet intraperitonealt med PBS (kontroll), fakke-paclitaxel (10 mg /kg i 100 ul PBS, 2 ganger i uken), docetaxel (3 mg /kg i 100 ul PBS, 2 ganger i uken ) eller oksaliplatin (5 mg /kg i 100 mL PBS, 2 ganger i uken) i 2 uker. Dyrs lidelser ble redusert med euthanizing Når du slår døende i henhold til forhåndsdefinerte kriterier, inkludert raske vekttap eller gevinst ( 15%), unnlatelse av å spise eller drikke, slapphet, manglende evne til å holde seg oppreist og mangel på styrke. Animal overlevelse ble evaluert fra den første dagen av behandlingen inntil døden.
Statistisk analyse
Survival analyse ble evaluert med GraphPad Prism 5 programvare (GraphPad Software, San Diego, California). In vitro celle-spredningsdata er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Statistisk analyse ble utført ved ANOVA for multiple gruppe sammenligning og t-test for den enkelte gruppe sammenligning. Survival gruppe sammenligning ble utført via log-rank test innen en Kaplan-Meier typen analyse. Verdier av p 0,05 ble ansett å representere statistisk signifikante gruppeforskjeller
Resultater
Stathmin uttrykk i magekreftceller
Analyse av menneskelige mage kreftceller AGS, NCI-. N87 og SNU16 viste at alle tre linjer uttrykt stathmin. Ingen forskjell i total stathmin ekspresjon ble funnet blant disse tre cellelinjer. Uttrykk av fosfor-stathmin varierte mellom cellelinjer, i følgende rekkefølge: SNU16 AGS NCI-N87-celler (figur 1A).
(A) Totale celleekstrakter av magekreftceller ble analysert ved immunblotting for ekspresjon av stathmin og fosfo-stathmin. (B-D) humant gastrisk kreft celler SNU16 (B), NCI-N87 (C) og AGS (D) ble sådd ut på 96-brønners plater og behandlet med 1 nM til 1000 nM konsentrasjoner av NAB-paclitaxel, 5-fluorouracil, oksaliplatin og epirubicin. Etter 72 timer ble 10 ul WST-1-reagens tilsatt i hver brønn og inkubert i 2 ytterligere timer. Absorbansen ved 450 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser. Den resulterende Antall levedyktige celler ble beregnet ved å måle absorbansen av farve i hver brønn. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre bestemmelser.
Nab-paclitaxel hemmer magekreft celleproliferasjon
Nab-paclitaxel hemmet magekreft celleproliferasjon på en doseavhengig måte, og hemming i celle spredning syntes å følge samme rekkefølge som uttrykk for fosfor-stathmin (figur 1B). Ved 100 nM konsentrasjon hemming i celleproliferasjon var 94,5, 66,7 og 41,8 prosent i henholdsvis SNU16, AGS og NCI-N87 celler. Nab-paclitaxel viste den høyeste antiproliferative potens med laveste effektive dose funnet i alle 3 cellelinjer testet i forhold til 5-fluouracil, oksaliplatin og epirubicin. IC
50 av nab-paclitaxel var 5 nM i SNU16, 23 nM i AGS og 49 nM i NCI-N87 celler, som var mindre enn 5-fluouracil (6,46 mikrometer i SNU16, 10 mikrometer i AGS og 10,2 mikrometer i NCI-N87 celler), oxaliplatin (1,51 mikrometer i SNU16, 1,64 mikrometer i AGS og 1,05 mikrometer i NCI-N87 celler) eller epirubicin (0,12 mikrometer i SNU16, 0,16 mikrometer i AGS og 0,25 mikrometer i NCI-N87 celler) ( Figur 1C).
Nab-paclitaxel induserer G2 arrest og mitotisk celledød in vitro
for å vurdere den underliggende mekanismen for veksthemming ved NAB-paclitaxel, cellesyklus profilen ble analysert. Som vist i figur 2A, NAB-paclitaxel (100 nM) resulterte i G2-M cellesyklusarrest i SNU16 celler. Prosentandelen av propidiumjodid-positive celler i G2-M-fase økte 35,6 til 71,6 etter 100 nM NAB-paclitaxel behandling i 12 timer. Tilsvarende endringer skjedde i AGS og NCI-N87 celler med nab-paclitaxel og docetaxel behandling, men ikke med oksaliplatin og epirubicin behandling (Tall S1 og S2).
(A) SNU16 celler ble dyrket i 24 timer og deretter behandlet med 100 nM nab-paclitaxel i 12 timer. Cellesyklusanalyse ble utført ved strømningscytometri. Resultatene som vises er representative for to uavhengige eksperimenter. (B-D) Ekspresjon av fosfo-stathmin og mitotisk celledød ble evaluert i SNU16 (B), NCI -N87 (C), og AGS (C) celler. Dyrkede celler ble behandlet med nab-paclitaxel (10 mm) og viste økt mitotisk arrest konfigurasjon og fosfor-stathmin uttrykk ved immunocytokjemisk farging. Mitotiske arrestert ble påvist i nærvær av fosfo-stathmin uttrykk. (D) en undersammenflytende monolag av humane magecancerceller AGS, ble NCI-N87 og SNU16 behandlet med NAB-paclitaxel (10 uM) for 3, 6 og 9 timer og analysert ved immunblotting for fosfo-stathmin og total stathmin. (E) human magekreftcellen var behandlet med NAB-paclitaxel (10 uM), oksaliplatin (10 uM), og epirubicin (10 uM) i 16 timer og analysert for spaltede PARP-1 og caspase-3. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Effekt av nab-paclitaxel på mitotisk celledød, uttrykk for fosfor-stathmin og apoptose relaterte proteiner ble målt ved immunocystochemistry og Western blot. Nab-paclitaxel behandling forårsaket microtubule avbrudd og mitotiske arrestasjoner i mage kreftceller som observert av kjernen fragmentering og karyopyknosis (figur 2B). Uttrykk av fosfor-stathmin ble økt etter nab-paclitaxel behandling, og høyere uttrykk av fosfor-stathmin var assosiert med en større grad av mitotiske arrestasjoner, nucleus fragmentering eller karyopyknosis, og celledød (figur 2B og 2C). Nuclear fragmentering og karyopyknosis forekom hos 16,7% av celler med lav ekspresjon av fosfo-stathmin men i 95,7% av celler med høy ekspresjon av fosfo-stathmin (r = 0,672, p 0,001). Det var også bevis for tidsavhengig øket ekspresjon av fosfo-stathmin ved NAB-paclitaxel-behandling (figur 2D).
Vi undersøkte om den mitotiske celledød indusert av NAB-paclitaxel kan delvis være korrelert med induksjonen av apoptose . Evaluering av PARP-1-spaltningssetet og caspase-3-spalting som markører for induksjon i apoptose viste at i magekreftceller nab-paclitaxel, oksaliplatin og epirubicin behandling forårsaket en økning i ekspresjon av både spaltet PARP-1 og caspase-3. Dette uttrykket av apoptose relaterte proteiner dukket høyere etter nab-paclitaxel behandling sammenlignet med oksaliplatin eller epirubicin behandlinger (figur 2E).
Nab-paclitaxel hemmer veksten av magekreft xenografter
In vivo antitumor effekter av NAB-paclitaxel ble evaluert i en murine xenograft modell ved hjelp SNU16 celler. Fakke-paklitakselbehandling på 10 mg /kg to ganger i uken i to uker ble godt tolerert uten åpenbare tegn på toksisitet som bedømmes av mus vekt og daglig vurdering. Etter en to ukers behandling, NAB-paclitaxel behandling resulterte i statistisk signifikant tumorvekst inhibering (p = 0,0004), som var større enn de av oxaliplatin (p = 0,0361) og epirubicin (p = 0,032) sammenlignet med vehikkel-kontroll, respektivt (figur 3A). Den tumorvekstinhibitering hastighet etter en to ukers behandling med nab-paclitaxel, oksaliplatin og epirubicin var 77, 17,2 og 21,4 prosent (p = 0,002), henholdsvis. Bare NAB-paclitaxel behandling opprettet en størrelse reduksjon av subkutane lesjoner i forhold til deres forut bestemt tumor størrelse. Det midlere tumorvekt ble signifikant redusert ved NAB-paclitaxel-behandling (0,154 ± 0,075 g sammenlignet med 0,756 ± 0,232 g, p = 0,037), men ikke av oxaliplatin (0,408 ± 0,12 g) eller epirubicin (0,46 ± 0,172 g) behandling sammenlignet med vehikkel kontroll, respektivt (figur 3A). Vi vurderte også antitumor effektene av nab-paclitaxel på NCI-N87 xenograft mus lokale svulster. Etter to ukers behandling, NAB-paclitaxel behandling resulterte i signifikant inhibering tumorvolum (p = 0,0023) (figur 3B), og den tumorveksthemming hastigheten var 72,8 prosent. Gjennomsnittlig tumorvekt i NAB-paclitaxel behandlingsgruppe var signifikant lavere enn det i bærergruppen (0,093 ± 0,026 g sammenlignet med 0,288 ± 0,02 g, p = 0,0054) (figur 3B). Ingen betydelig endring i mus kroppsvekt ble observert i noen av de nab-paclitaxel, oksaliplatin eller epirubicin terapigrupper.
(A) SCID-mus ble subkutant injisert med SNU16 celler (20 x 10
6) og behandlet med nab-paclitaxel, oksaliplatin og epirubicin i 2 uker. (B) SCID-mus ble subkutant injisert med NCI-N87-celler (10 x 10
6) og behandlet med NAB-paclitaxel på 2 uker. Relativ tumorvolum og tumorvekten på den siste dagen ble vurdert. Dataene er representative for middelverdier ± standardavvik 6-8 mus pr gruppe. Symbol * indikerer signifikant forskjell (p 0,05) og symbol ** representerer signifikante forskjeller (p 0,001) sammenlignet med bærerkontroller; ns = ikke signifikant forskjell.
Nab-paclitaxel induserer mitotisk celledød in vivo
Mekanismer av in vivo antitumor aktivitet av nab-paclitaxel ble videre undersøkt i tumorvev hentet fra SNU16 og NCI-N87 xenografter. En betydelig økning i ekspresjonen av fosfo-stathmin ble observert i SNU16 (figur 4A), og NCI-N87 (figur 4B) xenograft tumorer med behandling av NAB-paclitaxel ved både immunhistokjemi og Western blot-analyser.
SCID mus ble injisert subkutant SNU16-celler (20 x 10
6) eller NCI-N87-celler (10 x 10
6) og behandlet med NAB-paclitaxel på 2 uker. Intratumoral ekspresjon av fosfo-stathmin ble målt i SNU16 (A) eller NCI-N87 (B) tumorvev etter farging vevssnitt for fosfo-stathmin (ser38) antigen og fotografert under et fluorescerende mikroskop. Tumor lysatene ble preparert fra tumor vevsprøver hentet fra SNU16 (A) eller NCI-N87 (B) svulst bærende SCID mus etter nab-paklitakselbehandling og deretter analysert ved immunoblotting for fosfor-stathmin og total stathmin.
tumorvev fra NAB-paclitaxel-behandlede mus viste en redusert tumorcelleproliferasjon hastighet. En Ki67 uttrykk basert intratumoral proliferativ indeksen ble redusert med 90,7% (p = 0,001) sammenlignet med kontroller i NAB-paclitaxel-behandlede gruppe, i motsetning til 72,6% (p = 0,004) i oksaliplatin behandlede gruppen, og 67,7% (p = 0,003 ) i den behandlede gruppe epirubicin (figur 5A). Nab-paclitaxel forårsaket en sterkere inhibering effekt på tumorcelleformering enn oksaliplatin og epirubicin.
SCID-mus ble injisert subkutant SNU16-celler (20 x 10
6) og behandlet med NAB-paclitaxel på 2 uker. (A) intratumorale spredning ble målt ved farging vevssnitt med Ki67 atom antigen fulgt av fluorescerende mikroskop fotografering. Ki67-positive celler ble talt opp i fem høy effekt felt per prøve. Fold endring i proliferativ indeksen ble standardisert til kontroller (satt til 1) og andre prøvene er sammenlignet i forhold til dette utvalget. (B) intratumorale apoptose ble målt ved farging svulstvev seksjon med Tunel prosedyre og påfølgende fluorescerende mikroskop fotografering. Tünel-positive apoptotiske celler ble talt opp i fem høy effekt felt per prøve. For begge immunofarging eksperimenter, hvor hver gruppe hadde minst tre prøvene tellet og data er uttrykt som middelverdi ± standardavvik. Symbol * representerer vesentlig forskjell i forhold til kjøretøygruppe (p 0,05).
Undersøkelse av apoptose i tumorvevet avslørte at induksjon i apoptotiske indeksen var 7,9 ganger i nab-paclitaxel (p = 0,013), 5,7 ganger i oksaliplatin behandlede dyr (p = 0,024), og 5,2 ganger i epirubicin behandlede gruppen (p = 0,042) over grunnlinjen i kontrollgruppen (figur 5B).
Nab- paclitaxel øker dyr overlevelse
i den første overlevelse studien var median overlevelse av SCID-NOD mus var 24 dager i kontrollgruppen. Dette økte til 86 dager etter NAB-paclitaxel-behandling (p = 0,0004 i forhold til kontrollgruppen, p = 0,0005 vs. oksaliplatin gruppe) og til 37,5 dager etter oxaliplatin behandling (p = 0,0004 i forhold til kontrollgruppen). Gruppen overlevelse utvalg var også overlegen etter nab-paclitaxel behandling (område: 75 til 95 dager) sammenlignet med oksaliplatin behandling. (Range: 34 til 41 dager) (Figur 6A)
(A) Antitumoreffekt av nab -paclitaxel sammenlignet med oksaliplatin. SNU celler (40 × 10
6) ble injisert intraperitonealt i SCID mus, etterfulgt av behandling etter 2 uker med nab-paclitaxel (10 mg /kg, 2 ganger i uken) og oksaliplatin (5 mg /kg, 2 ganger uke) i 2 uker. (B) Antitumoreffekt av nab-paclitaxel sammenlignet med oksaliplatin og docetaxel. SNU-celler (40 x 10
6) ble injisert intraperitonealt i SCID-mus, etterfulgt av behandling etter 2 uker med NAB-paclitaxel (10 mg /kg, 2 ganger i uken), oksaliplatin (5 mg /kg, 2 ganger uke), eller docetaxel (3 mg /kg, 2 ganger i uken) i 2 uker. Kurven representerer dyret overlevelsestiden fra begynnelsen av behandlingen. Symbol * representerer signifikant forskjell sammenlignet med kjøretøy kontroll (p 0,05), symbol
§ representerer signifikante forskjeller sammenlignet med oxaliplatin (p 0,05), og symbolet
# representerer signifikante forskjeller sammenlignet med docetaxel (p 0,05).
i andre overlevelse studien, median overlevelse av SCID-NOD mus var 31 dager i kontrollgruppen. Dette økte til 93 dager etter nab-paclitaxel behandling (p = 0,0007 vs. kontroll og oksaliplatin gruppe, og p = 0,0416 vs docetaxel-gruppen), til 81 dager etter docetaxel behandling (p = 0,0007 vs kontroller) og til 40 dager etter oxaliplatin behandling (p = 0,038 vs kontrollgruppe). Gruppen overlevelse serien var 75 til 96 dager etter nab-paclitaxel behandling sammenlignet med docetaxel behandling (range: 74 til 93 dager) og oxaliplatin behandling (område: 35 til 45 dager). (Figur 6B)
Diskusjoner
Avansert magekreft er livstruende og representerer en formidabel behandling utfordring. Tradisjonelle doble eller triple cytotoksiske kjemoterapiregimer har begrenset effekt og kan forårsake bivirkninger og chemoresistance [42] – [44]. Denne studien viser klart at NAB-paclitaxel har betydelig sterkere antitumor effekt på gastrisk kreft-cellelinjer enn for tiden anvendte cytotoksiske midler oksaliplatin og epirubicin in vitro og in vivo, målt ved antiproliferative effekter, apoptose, mitotisk celledød, lokalisert antitumorrespons og overlevelses beslektet til tumorbyrde.
in vitro studie viste at fakke-paclitaxel er svært potent i å hemme celledeling for menneske mage cellelinjer enn oksaliplatin og epirubicin. SNU16 celler er mer følsomme for fakke-paclitaxel enn NCI-N87 celler. Noen studier har funnet at stathmin var korrelert med taxan motstand og stathmin knockdown kan øke følsomheten for taxan [33], [36]. Vi testet ekspresjonen av stathmin og fant ingen forskjell mellom disse tre cellelinjer. Interessant, når vi undersøkte ekspresjonen av fosfo-stathmin vi funnet at evnen til NAB-paclitaxel til å inhibere in vitro celle-proliferasjon var i samme rang rekkefølge som uttrykk for fosfo-stathmin i disse tre magekreftceller: SNU16 AGS NCI-N87. Det viste seg således i første omgang at fosfo-stathmin ekspresjon ble korrelert med NAB-paclitaxel effekt, utlån noen støtte til en hypotese om at fosfo-stathmin kan tjene som en potensiell biomarkør for å forutsi NAB-paclitaxel antitumorrespons i magekreft behandling.
Vi utførte en NCI-N87 xenograft studie for å evaluere antitumor effekt av nab-paclitaxel. Snarere uventet, NAB-paclitaxel betydelig hemmet NCI-N87 xenograft tumorvekst sammenlignet med kontrollgruppen. Disse noe avvikende resultater kan tyde på at den in vivo antitumor effekt av NAB-paclitaxel i magekreft kan være uavhengige fra baseline uttrykk for fosfor-stathmin eller total stathmin. Siden bare tre cellelinjer ble testet, kan vi ikke lage en klar konklusjon om forholdet mellom stathmin eller fosfor-stathmin og fakke-paclitaxel effekt på magekreft. Videre forskning med stathmin slått-outs bør være nyttig å ta opp dette spørsmålet, og undersøke hvilken rolle stathmin som biomarkør for nab-paclitaxel effekt.
I denne studien har vi deretter sammenlignet antitumor effekter av nab paclitaxel med oksaliplatin og epirubicin på SNU16 xenograft lokale svulster. Nab-paclitaxel viste sterkere antitumor effekt enn oksaliplatin og epirubicin som var i samsvar med in vitro celleproliferasjonsprosesser resultater og svulstvev celledeling og apoptose data. Zhou et al.
