Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er en av de vanligste kreftformene i utviklede land. Å identifisere molekylære nettverk og biologiske prosesser som er deregulert i CRC i forhold til normal colonic slimhinner, søkte vi Gene Set Enrichment Analyse to uavhengige transkriptom datasett, inkludert totalt 137 CRC og ti normale colonic slimhinnen prøver. Åttito gensettene som beskrevet av Kyoto Encyclopedia of gener og genomer database hadde signifikant endret genuttrykk i begge datasett. Disse inkluderte nettverkene forbundet med celledeling, DNA vedlikehold, og metabolisme. Blant signalveier med kjente endringer i viktige gener, den «phosphatidylinositol signale nettverk», som utgjør en del av PI3K veien, ble funnet deregulert. De downregulated gener i denne veien inkludert flere medlemmer av fosfolipase C-protein familie og redusert uttrykk for to av disse,
PLCD1 Hotell og
PLCE1
ble vellykket validert i CRC biopsier (n = 70) og cellelinjer (n = 19) av kvantitative analyser. Undertrykkelse av både gener ble funnet i forbindelse med
KRAS
mutasjoner (
P
= 0,005 og 0,006, henholdsvis), og vi har observert at mikro stabile karsinomer med redusert
PLCD1
uttrykk oftere hadde
TP53
mutasjoner (
P
= 0,002). Arrangøren metylering analyser av
PLCD1 Hotell og
PLCE1
utført i cellelinjer og tumor biopsier viste at metylering av
PLCD1
kan bidra til redusert uttrykk i 40% av mikro ustabil karsinom . Avslutningsvis har vi identifisert betydelig deregulerte baner i CRC, og validert undertrykkelse av
PLCD1 Hotell og
PLCE1
uttrykk. Dette illustrerer at GSEA tilnærmingen kan lede oppdagelsen av nye biomarkører i kreft
Citation. Danielsen SA, Cekaite L, Ågesen TH, Sveen A, Nesbakken A, Thiis-Evensen E et al. (2011) fosfolipase C isozymer Er deregulert i tykktarmskreft – Innsikt fått fra Gene Set Enrichment Analyse av transkriptom. PLoS ONE 6 (9): e24419. doi: 10,1371 /journal.pone.0024419
Redaktør: Baochuan Lin, Naval Research Laboratory, USA
mottatt: Mai 20, 2011; Godkjent: 10 august 2011; Publisert: 01.09.2011
Copyright: © 2011 Danielsen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert med tilskudd fra den Norske Kreftforening (https://www.kreftforeningen.no/english) (RAL: ingen PR-2006-0442, inkludert PhD-stipend til SAD og Tha gel:. PR-2008-0163; RIS : PR-2007-0166), av en bevilgning fra Forskningsrådet ved Rikshospitalet-Radiumhospitalet Helse Enterprise (RAL: inkludert en PhD stipend til AS), med støtte fra Helse Sør-Øst Norge RHF (http: //www .helse-sorost.no /omoss /engelsk /Sider /page.aspx) (RAL: PR-2009-093, inkludert postdoc stipend til LC), og stipend fra Norsk Stiftelsen Helse og rehabilitering (http: //www. extrastiftelsen.no/) gjennom ekstra midler (ETE: HF-52015/002). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC, MIM # 114500) er nummer tre i kreftforekomst på verdensbasis med anslagsvis 1,2 millioner nye tilfeller per år [1]. Ifølge American Joint Committee on Cancer (AJCC) 5-års overlevelse for pasienter diagnostisert med stadium I og stadium IV CRC, er 93% og 8% henholdsvis, og dermed pasientens prognose er svært avhengig av stadium ved diagnose [2 ]. CRC utvikles gjennom forskjellige histopatologiske stadier fra godartede forstadier til ondartede svulster, kjent som adenom-karsinom-sekvensen. Utviklingen er drevet av progressiv akkumulering av genetiske og epigenetiske endringer av spesifikke gener, og konservert signaliserer nettverk som utøver pleiotrope effekter på kreftcellene er ofte målrettet. Vanligvis er maligne tumorer, karakterisert ved at molekyl fenotyper mikrosatelitt ustabile (MSI), kromosomal ustabilitet (CIN) og CpG øy methylator fenotypen (CIMP) [3]. De mest forandret gener under CRC utvikling utgjør grunnlaget for disse fenotyper og involvere flere signalveier og nettverk (figur 1A).
A) Viktige gener målrettet i de ulike CRC fenotyper under utviklingen fra forstadier til karsinomer . Gener i fet skrift representerer MAPK, PI3K, og TP53 signale nettverk, og deres mutasjonsstatus har tidligere blitt bestemt [38]. B) Figuren viser hvordan en del av fosfatidylinositol nettverk kommuniserer med kanoniske PI3K veien. Gener som mutasjon statusdata brukes for foreningen analyser i dagens papir er farget i blått, rosa og brun. Forkortelser: GPCR, G-proteinkoblet reseptor; RTK, reseptor tyrosin kinase.
Messenger RNA (mRNA) uttrykk profilering studier har gitt økt forståelse av rollene til flere gener viktige i initiering og progresjon av kreft, inkludert CRC [4]. Til tross for økende kjennskap til uttrykk mønstre av enkeltgener, så vel som lovende gen signaturer har mindre innsikt er oppnådd på forandringer av molekylære nettverk og signalveier fra den store mengden av data som er generert i slike studier. Ved å anvende den statistiske tilnærmingen av Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) til genuttrykk data, i samspill gener hvis uttrykk nivåer coordinately endret kan utforskes [5]. Den GSEA metoden tar hensyn til uttrykket av alle genene i en annotert gen set /sti. Det finnes flere databaser og gen satt definisjoner knytte gener ved deres funksjonelle merknader. De mest brukte er databasen Gene ontologi (GO), som er basert på en kombinasjon av beregnings og manuell tilordning av gener å gå når det gjelder [6]. Men disse vilkårene ikke svarer direkte til kjente veier. Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) er en molekylær vei database med manuelt kuratert og hyppig oppdatert metabolske, regulatoriske og signalveier [7]. Ved hjelp av denne konservativt merket database, kan redundans i den nestede strukturen av genet foreninger representert av GO vilkår unngås. Sammenlignet med enkelte genekspresjon analyser, gir GSEA innsikt i koordinerte uttrykk endringer av gener innen trasé, dermed endret signalveier og gener her ikke er kjent for å være involvert i kreftutvikling kunne identifiseres.
Betydningen av den kanoniske phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) sti i kreft er etablert i en rekke publikasjoner i løpet av det siste tiåret [8]. Denne signaleringsnett har innvirkning på flere kreftkritiske fenotyper slik som celleproliferasjon, overlevelse, metabolisme, og tumorvekst [8]. En gren av nettverket overlapper med den fosfatidylinositol signaleringsnett, som medierer signaler via fosfolipase C (PLC) proteiner (figur 1B). Dette nettverket crosstalks sannsynligvis med MAPK og TP53 veier, viktige veier i CRC utvikling. PLS protein serien inneholder tretten isoenzymer delt inn i seks ulike subtyper, β, γ, δ, ε, ζ, og η, basert på struktur og regulatoriske aktiveringsmekanismer. PLS Isozymene inneholder flere vanlige domener, samt subtype bestemte domener, som kan gjøre dem i stand til å regulere lipase-uavhengige reaksjoner [9]. Videre, de er oppløselige og hovedsakelig lokalisert i cytosolen, men blir translokert til plasmamembranen som respons på reseptoraktivering [10]. Ved membran hydrolyserer de fosfatidylinositol (4,5) -fosfat (PIP
2) og generere det viktig andre budbringer diacylglycerol (DAG) og inositol 1,4,5-triphospate (IP
3). Ubalanse av phosphoinositide nivåer (PIP
2 og PIP
3) har vist seg å indusere defekter i kanalen aktivitet, trafficking, og normal celle polaritet [9]. Således riktig regulering av de phosphoinositides ved f.eks PLC enzymer er viktig og avvikende regulering bidrar til ulike menneskelige lidelser, inkludert kreft [9].
Ved å utforske genekspresjon av forhåndsdefinerte biologiske prosesser og molekylære kretser i to CRC og normale tarmslimhinnen datasett innhentet ved hjelp av ulike microarray plattformer, en liste over veier betydelig endret ved differensial genuttrykk i CRC ble identifisert. Vi valgte «phosphatidylinositol signaliserer nettverk» og to av de deregulerte komponenter der,
PLCD1 plakater (HGNC: 9060) og
PLCE1 plakater (HGNC: 17175), for detaljerte studier og sammenlignet resultatene med clinicopathological data og mutasjonsstatus av flere gener som er kjent for å bli endret i CRC.
Resultater
deregulert KEGG trasé i CRC
i alt 152 KEGG gensettene var til stede i begge genuttrykk datasett. Fra disse, GSEA avslørte 33 signifikant oppregulert og 49 nedregulert betydelig biologiske prosesser og baner i CRC sammenlignet med normal tykktarmsslimhinne (
P
≤0.05, figur 2). Elleve vesentlig endrede nettverk hadde motsatt berikelse score mellom datasettene, mens 44 ble funnet signifikant endret i bare ett av datasett. KEGG nettverk betydelig deregulerte i CRC i forhold til normal slimhinne i begge datasettene er oppført i tabell S1 (n = 82). Det faktum at disse banene ble funnet signifikant endret (
P
≤0.05) i to uavhengig analysert datasett, hentet fra ulike microarray plattformer, gir en risiko for bare 1/400 for hver vei for å bli inkludert som vesentlig endret bare tilfeldigvis. Derfor vil ingen ekstra korreksjon for multippel testing utført (dette også utgjør den øvre del av tabell 1). De 82 nettverk omfatter gensettene ansvarlig for generelle kreft celle egenskaper, ulike metabolske kretser så vel som mer kjente signalkaskader som TP53 og MAPK veier. Plott av genekspresjon nivåer i CRC prøvene
versus
normal tykktarmsslimhinne prøver for alle genene i de tre mest oppregulert og de tre mest downregulated nettverk i CRC er vist i figur S1, og deres statistisk differensielt uttrykte gener er oppført i Tabell S2.
diagrammet viser at resultatene av GSEA var svært reproduserbare med 33 og 49 baner i fellesskap opp- og downregulated tvers av de to datasett, henholdsvis.
den «phosphatidylinositol alarmsystemer»
«phosphatidylinositol signalsystemet» var en av de molekylære stier funnet å være nedregulert i CRC i forhold til normal slimhinne,
dvs.
ha mer downregulated enn oppregulert gener. Totalt 22/59 og 27/76 gener passerer kvalitetskriteriene ble betydelig deregulert i CRC i AB og HuEx datasett, henholdsvis (figur 3, tabell 1). Av de 11 genene som finnes deregulert i både serie, bestående inositol kinaser, diacylglycerol kinaser, og fosfolipaser, ble to signifikant oppregulert, mens ni ble nedregulert. Interessant, fant vi fire downregulated lipaser (
PLCD1
,
PLCD3
,
PLCE1
, og
PLCG2) Hotell som ble nært knyttet isoenzymer tilhører fosfolipase C (PLC) familie av proteiner.
PLCD1 Hotell og
PLCE1
, de to PLC gener i «phosphatidylinositol signalsystemet» mest signifikant nedregulert sammenlignet med normal slimhinne prøvene i HuEx og AB datasett, henholdsvis, ble valgt for ytterligere validering .
i alt 38 gener i «phosphatidylinositol signalsystemet» ble endret på en eller begge datasett, elleve gener ble funnet deregulert over begge datasett.
Validering av
PLCD1
og
PLCE1
mRNA uttrykk
Fra kvantitativ revers transkripsjon-PCR,
PLCD1 Hotell og
PLCE1
ble klart undertrykt i kreft vevsprøver sammenlignet med normal slimhinnen (
P
= 3 × 10
-16 og
P
= 4 × 10
-15), bekrefter downregulation funnet i microarray expression data (figur 4) . Alle de nitten analysert tykktarmskreft cellelinjer vises også betydelig undertrykkelse av de to genene i forhold til normal slimhinne (
P
= 2 × 10
-10 og
P
= 1 × 10
-8).
uttrykk nivåer av
PLCD1 Hotell og
PLCE1
i CRC og tykktarmskreft cellelinjer vurderes av RT-PCR ble signifikant nedregulert i forhold til normal colonic slimhinnen.
PLC
uttrykk verdier knyttet til genetiske og clinicopathological variabler
Interessant, var det sterke assosiasjoner mellom lav uttrykk for både
PLCD1
og
PLCE1 Hotell og
KRAS
mutasjoner i CRC prøver (tabell 2). Videre redusert uttrykk nivåer av
PLCD1
var signifikant assosiert med
TP53
mutasjoner og MSS fenotype. For begge PLC gener, ble uttrykket nivåer redusert i mer avanserte sykdomsstadier. Expression verdier av
PLCE1
ble redusert i stadium II (
P
= 0,06) og betydelig redusert i fase III svulster (
P
= 0.005), mot å iscenesette jeg svulster . Men dette var ikke tilfelle for fjernt metastatisk sykdom (stadium IV). Den samme trenden ble også sett for
PLCD1
, der uttrykk nivåer ble betydelig redusert i fase III sammenlignet med stadium I (
P
= 0,03). Ingen sammenhenger ble funnet mellom
PLCD1 Hotell og
PLCE1
uttrykk og mutasjoner i
BRAF
,
PIK3CA
, eller
PTEN
. For tabell 2 bør det bemerkes at på grunn av flere tester (n = 16), er det en risiko for falske signifikante sammenhenger.
Arrangøren metylering analyse av
PLCD1 Hotell og
PLCE1
PLCD1 Hotell og
PLCE1
kan være mål for arrangøren metylering siden deres uttrykk nivåer var lave i CRC sammenlignet med normal colonic slimhinnen prøver. Begge genene har CpG øyer i sine arrangører og deres uttrykk ble oppregulert i cellelinjer behandlet med epigenetiske reaktivere agenter (5-aza-2’deoxycytidine, AZA og Trichostatin A; TSA). Hel eller delvis metylering av
PLCD1
promoter ble funnet i 79% (15/19) av tykktarmskreft cellelinjer, oppdaget av både kvalitative og kvantitative metylering spesifikke polymerase chain reaction (MSP og qMSP henholdsvis ). De resterende fire cellelinjer var helt unmethylated. Metylering status for tykktarmskreft cellelinjer ble bekreftet ved bisulfite sekvensering ved hjelp av to ikke-overlappende sett av primerpar som dekker til sammen 69 CpG nettsteder. Det var ingen sammenheng mellom metylering og MSI-status av cellelinjene. For primær karsinom, bare ni av 70 (13%) prøver ble metylert, som vurdert av MSP og qMSP. Majoriteten av svulstene antas å være gunstige for metylering viste lave verdier PMR (median 5,69). Interessant, åtte av de ni metylerte tumorene var MSI, hvilket ga en metylering frekvens på 40% (8/20) i denne undergruppe. Videre alle denaturert MSI svulstene hadde mutasjoner i
BRAF
, mens metylert MSS svulsten var vill type. For
PLCE1, etter bare én av 19 tykktarmskreft cellelinjer viste promoter metylering. Dette ble bekreftet av bisulfite sekvensering som dekker 47 CpG nettsteder. På grunn av den lave
PLCE1
arrangøren metylering frekvens mellom cellelinjene, vevsprøver ble ikke utsatt for metylering analyser.
Diskusjoner
Ved å utforske genekspresjon innen forhåndsdefinerte molekylære stier i to uavhengige CRC transkriptom datasett, har vi identifisert flere molekylære nettverk og komponenter deri som er deregulert i CRC og kan bidra til kreftutvikling.
«Cellesyklus syklus~~POS=HEADCOMP» ble ikke overraskende den mest omfattende endret genet satt i våre analyser. Dens riktig regulering er nødvendig for å sikre korrekt overføring av genetisk informasjon fra en generasjon til den neste, og dermed deregulering av flere cellesyklusen er definert som kreft kjennetegn. Våre funn er i tråd med flere sammenlignbare studier av CRC hvor gensettene utelukkende begrenset til kreft-relaterte pathways [11] og flere elektroniske databaser som omfatter mer generelle trasé, har blitt utforsket [12] – [14]. CRC vises uttrykk endringer i en rekke metabolske veier,
dvs.
«oksidativ fosforylering» var den mest signifikant nedregulert metabolske nettverk på tvers av begge datasettene, mens metabolismen av puriner, pyrimidiner, og N-glykaner, i tillegg til «pentosefosfateveien bane «, ble oppregulert. Purin- og pyrimidin metabolisme ble nylig funnet å være oppregulert også i adenomer sammenlignet med normal slimhinne, noe som indikerer at forandringer av disse nettverkene er tidlige hendelser i tumorgenese [14]. Omprogrammering av energiomsetningen ble nylig lansert som en ny kjennetegn på kreft, og funnene er også i overensstemmelse med hva Otto Warburg beskrevet et halvt århundre siden, referert til som «Warburg effekten». Han identifiserte et skifte i glukosemetabolismen fra oksidativ fosforylering til aerob glykolyse i tumorceller [15]. Begrensning av metabolismen i stor grad til glykolyse tillater omdannelse av glykolytiske mellomprodukter til nukleosider og aminosyrer. Dette i sin tur muliggjør biosyntese av makromolekyler og organeller som kreves for den økte produksjon av nye celler. Biologiske prosesser som involverer DNA replikasjon og ulike former for DNA-reparasjonsmekanismer ble også funnet deregulert i våre datasett. Disse grunnleggende systemene er ofte satt ut av spill, ikke bare i kreft, men også ved andre sykdommer og syndromer, og understreker alvorligheten av ikke å kunne kopiere DNA eller reparere feil på en korrekt måte.
I tillegg til mer generelle kreft celle egenskaper, sentrale kretser i CRC som MAPK-, TP53-, og fosfatidylinositol signalanlegg, hvor vanligvis en eller noen få fremtredende spillere er rapportert å være ofte endres på DNA-nivå (på grunn av punktmutasjoner, presiseringer og /eller slettinger [8], [16]), ble funnet signifikant deregulert i våre analyser. Dette innebærer at endret genuttrykk av flere mindre «kjente» medlemmer i trasé også bidra i kolorektal kreftutvikling. I denne studien ble det observert at gener som
PIK3CA Hotell og
PTEN
ble uttrykt i tumorprøver, men ikke på signifikant forskjellig fra normalnivå kolon vev i begge datasett. Vi og andre har vist at disse genene ofte lider av endringer på DNA- eller proteinnivåer i stedet for ved endringer i mRNA-ekspresjon [8], [17] – [19]
For å kunne avdekke ytterligere gener i. den «phosphatidylinositol signalsystemet» involvert i tumordannelse, utforsket vi uttrykket nivået av alle komponentene som kommenterte i KEGG. Begge inositol fosfataser, diacylglycerol kinaser, og fosfolipaser ble funnet å ha forandret ekspresjon. Blant de fosfolipase enzymer, ble medlemmer av fosfolipase C familien godt representert, noe som indikerer en viktig rolle for denne familien i CRC. Dette ble understreket av RT-PCR analyser validere at uttrykket nivåer av
PLCD1 Hotell og
PLCE1
utstrakt grad ble nedregulert i CRC i forhold til normal colonic slimhinnene. Undertrykkelse av
PLCD1
er i samsvar med resultatene presentert av Nomoto og kolleger i 1995, der de rapporterer ikke målbare nivåer av PLCD1 protein i åtte tykktarmskreft cellelinjer og redusert nivå i tolv av tretten tykktarmskreft sammenlignet med deres paret normal slimhinne prøven [20]. Flere grupper har foreslått en rolle for PLCD1 i regulering av cellesyklusen G
1 /S-kontrollpunkt, derimot, er det motstridende resultater som om den har en onkogen eller tumorundertrykkende funksjon [21] – [23]. Basert på dagens funn, foreslår vi at sistnevnte funksjon av
PLCD1
i CRC. Lignende resultater har også blitt rapportert for esophageal plateepitelkarsinom (ESCC), mage og brystkreft [21], [24] – [26]. Interessant, lave nivåer av
PLCD1
var sterkt assosiert med mutasjoner i
TP53 Hotell og
KRAS
samt svulster i MSS fenotype; selv om den biologiske betydningen av disse foreningene gjenstår å fastslå.
Den observerte undertrykkelse av
PLCE1
, det andre genet undersøkt i detalj, er støttet av resultatene fra Sørli
et al
. som også viste signifikant redusert mRNA uttrykk nivåer i tykktarm og endetarm kreft prøver og tykktarm kreft cellelinjer, samt ved Wang og kolleger som rapporterte en frekvens på 36% tap av heterozygositet (LOH) av 10q23 der
PLCE1
ligger og nedregulering av PLCE1 i 21/50 kolorektal kreft prøvene sammenlignet med matchet normalt vev [27] – [29]. Videre observerte vi at uttrykket nivåer av
PLCE1
ble avtar med mer avanserte stadier, som indikerer at undertrykkelsen av dette genet er gunstig for progresjon av kreft. Spesielt synes nivået å stige når nå metastatisk sykdom (stadium IV), et fenomen som tidligere beskrevet for
PLCD1 Hotell og
PLCD3
i brystkreft [24]. Likevel forsiktighet bør gjøres ved tolkning av resultatene for nåværende stadium IV gruppe, som bare syv svulster er inkludert. Uttrykket nivåer av
PLCD1 Hotell og
PLCE1
ble korrelert, og som forventet ble redusert uttrykk av både gener assosiert til mer avanserte kreft stadier (data ikke vist). Men de enkelte ekspresjonsnivåene og uttrykket nivåer av begge gener kombin ble ikke korrelert med pasientoverlevelse (data ikke vist). Forbløffende nok som for
PLCD1
, lav uttrykk for
PLCE1
var sterkt assosiert med mutasjoner i
KRAS
. Siden PLCE1 er funnet å være både oppstrøms og nedstrøms effektor av Ras familie proteiner [30], korrelasjonen av muterte
KRAS
med redusert uttrykk nivåer spiller mest sannsynlig en avgjørende rolle i CRC tumorigenesis. Videre ble det nylig rapportert at overekspresjon av PLCE1 i en tykktarmskreft cellelinje hemmet tumorcelleformering, redusert antall kolonier dannet, redusert migrering og økt apoptose [29], som tyder på en tumorundertrykkende rolle for dette gen i CRC.
Vi deretter undersøkt om de reduserte uttrykk nivåer av
PLCD1 Hotell og
PLCE1
kan skyldes arrangøren hypermethylation. Dette er en vanlig måte å inaktivere tumorsuppressorgener, og begge phopholipases har blitt lagt frem som kandidater for arrangøren hypermethylation [27]. Dette har imidlertid så langt bare blitt bekreftet i
PLCD1
innenfor et område på 52-62% metylering i ESCC, mage og bryst kreft [21], [25], [26]. Våre resultater fra qMSP og bisulfite sekvensering kan ikke bekrefte
PLCE1
som et mål for denne type epigenetisk stanse, og til tross for høy frekvens av metylering i tykktarmskreft cellelinjer, metylering i
PLCD1
arrangøren kan bare forklare redusert uttrykk i en undergruppe av karsinomer. Interessant om, oppdaget vi at alle unntatt én av de denaturert svulstene var MSI, noe som gir en metylering frekvens på nesten førti prosent blant karsinom med defekt mismatch reparasjon. I tillegg ble denaturert MSI svulster lokalisert på høyre side av tarmen og hadde
BRAF
mutasjon, i tråd med CIMP fenotype [3].
Ved å utsette to CRC transkriptom datasett til GSEA vi har identifisert en rekke statistisk signifikante deregulerte gensettene i CRC, og vist at denne tilnærmingen kan lede oppdagelsen av nye molekylære mål og biomarkører for kreft. Verifisering analyser av utvalgte gener innenfor en av de identifiserte deregulerte signalveier,
PLCD1 Hotell og
PLCE1
, bekreftet reduserte nivåer av disse transkripsjonene i CRC sammenlignet med normal slimhinne prøver. Både en tumorundertrykkende og tumor fremme rollen til disse genene og proteinprodukter er blitt foreslått i forbindelse med kreftutvikling, avhengig av vev utstedt [9]. De foreliggende data støtter en svulst undertrykkende rolle
PLCD1 Hotell og
PLCE1
i CRC, som for
PLCD1
muligens kan forklares med en epigenetisk mekanisme i mikro ustabile karsinomer.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag inkludert. Alle prøver ble hentet fra forskningsbiobanker som en del av forskningsprosjektene som er godkjent i henhold til nasjonale etiske retningslinjer. Biobanken serien har blitt registrert i henhold til nasjonal lovgivning og er godkjent av Regional komité for medisinsk forskningsetikk (REK Sør-Øst S-09282c2009 /4958, Biobank 2781, REK Sør: 2003, S-02126, Biobank 296-2005-174211 ).
transkriptomet datasett
To uavhengige kolorektal vev transkriptom profilering datasett tidligere generert i vårt laboratorium ble brukt til dette GSEA studie [31], [32]. Rådata er tilgjengelig gjennom NCBI Gene Expression Omnibus offentlig register for microarray data (deponeringsnummer GSE25071 og GSE24550). Det første datasettet inneholder genuttrykk profiler fra 46 CRC og fire normale colonic slimhinnen prøver ved bruk av det Applied Biosystems 1700 plattform (Applied Biosystems av Life Technologies, Foster City, CA, USA, AB) [31]. Den andre genuttrykk datasettet inneholder 91 CRC og seks normale colonic slimhinnen prøver generert ved hjelp av Affymetrix Genechip Menneskelig Exon 1,0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA; HuEx) [32]. Det var ingen overlappprøver mellom de to microarray datasettene. En oppsummering av de kliniske data for pasienter inkludert i datasett kan finnes i tabell S3.
Vevsprøver og kreftcellelinjer
Pasienten prøvene inngår i mål verifisering analyser utgjorde en undergruppe av svulster som brukes i HuEx datasettet (n = 70), og 17 normale tarmslimhinnen prøver (inkludert seks fra HuEx datasettet). Alle prøver ble tatt fra pasienter som gjennomgår primær kirurgi for CRC ved Oslo universitetssykehus, Aker, Oslo, mellom 2005 og 2008. Den normale tykktarmslimhinnen ble tatt prøver fra sykdomsfrie områder i reseksjon margin på CRC prøver (≥ 10 cm fra svulsten). En clinicopathological beskrivelse finnes i tabell S4.
Nitten tykktarmskreft cellelinjer (Co115, Colo320, EB, fre, HCT15, HCT116, HT29, IS1, IS2, IS3, LoVo, LS1034, LS174T, RKO, SW48, SW480, TC7, TC71, og V9P) ble inkludert i studien, og er grundig beskrevet i [33]. Disse ble dyrket under standard betingelser som vil bli gitt på forespørsel. Seks av cellelinjer (HCT15, RKO, SW48, HT29, LS1034, og SW480) ble utsatt for epigenetisk behandling med demethylating stoffet AZA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; 1fiM i 72 timer), den histondeacetylase inhibitor TSA (Sigma-Aldrich, 0,5 mikrometer i 12 timer), og en kombinasjon av begge legemidler (1 mikrometer AZA i 72 timer og 0,5 mikrometer TSA lagt de siste 12 timene). Parallelt med de samme cellelinjene ble dyrket uten behandling i 72 timer. Alle kommersielt tilgjengelige cellelinjer ble autentisert bruker AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems).
Isolering av nukleinsyrer
DNA fra ferske frosne colonic vev og tykktarmskreft cellelinjer ble hentet av en standard fenol /kloroform-protokollen. RNA fra svulstvev ble ekstrahert ved hjelp av Qiagen AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland), mens RNA fra normale colonic slimhinnen prøver og tykktarmskreft cellelinjer ble isolert ved Ambion RiboPure ™ Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) og Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), henholdsvis. Alle prosedyrer ble utført i henhold til produsentens protokoller.
Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)
For GSEA gensettene definert i henhold til KEGG pathway samling (Homo sapiens (human) Slipp 53,0 ) [7]. Analysen ble utført med GSEABase pakken i Bioconductor /R versjon 2.9.2 [34]. De to microarray genuttrykk datasett av CRC
versus
normal tarmslimhinnen ble uavhengig utsatt for GSEA. Data forbehandling ble utført som tidligere beskrevet [31], [32]. Interkvartile område (IQR) ble anvendt som et mål på variasjon. Gener med IQR 0,5 ble ekskludert fra videre analyser med GSEA. For genene målrettet av flere transkripsjon klynger (HuEx) eller sonder (AB), ble reporteren med største variasjonen brukes. Gener ikke tildelt noen KEGG trasé ble også ekskludert fra analysen. Totalt 3,361 og 4,797 gener med en annotert rolle i 205 og 220 KEGG trasé ble evaluert for AB og HuEx datasett, henholdsvis. Pathways som inkluderte mindre enn 10 kommenterte gener ble fjernet fra videre analyse, slik at 167 og 185 baner i de respektive datasettene. Tosidig, ble to-klasse t-test forutsatt like variasjoner over CRC og normale prøver utføres for alle inkluderte gener. Et gen som angitt anrikning resultatet ble beregnet som summen av observerte t-statistikk for genene i settet, dividert med kvadratroten av antall gener i settet. Gene sett
P
-verdier ble beregnet basert på vektor av sannsynlighetene for t-statistikken over de inkluderte gener [35].
Validering av PLCD1 og PLCE1 uttrykk nivåer av kvantitativ Omvendt Transcription- PCR
Total RNA fra CRC vev og normal slimhinne prøvene ble omdannet til cDNA ved hjelp av High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). CDNA av to endogene kontroller,
ACTB plakater (Hs99999903_m1) og
GUSB plakater (Hs99999908_m1), samt cDNA av genene
PLCD1 plakater (Hs00979908_m1) og
PLCE1 product: (Hs00275279_m1) ble forsterket seg i 384 brønnplater som beskrevet av produsenten (Applied Biosystems). Genekspresjon ble målt i sanntid ved hjelp av 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Prøvene ble analysert i tre paralleller, og den midlere verdi ble anvendt for dataanalyse. En seriell fortynning av cDNA fra Universal Humant referanse RNA (Agilent, Santa Clara, CA, USA) ble anvendt for å generere standardkurven. Uttrykket nivåer av
PLCD1 Hotell og
PLCE1
var normalisert mot middelverdien av de endogene kontrollene.
Bisulfite behandling og formidler metylering analyse design
Før til kvalitativ og kvantitativ MSP og bisulfitt sekvense, 1,3 ug DNA fra hver prøve ble natriumbisulfitt behandles med det Epitect bisulfite Kit (Qiagen) ifølge produsentens protokoll.
