Abstract
Autophagy modulasjon er nå anerkjent som en potensiell terapeutisk tilnærming for kreft (inkludert tykktarmskreft), men de molekylære mekanismene som regulerer autofagi som svar på cellulært stress er fortsatt ikke godt forstått. MicroRNAs (mirnas) er blitt funnet å spille en viktig rolle i å kontrollere mange cellulære funksjoner, inkludert vekst, metabolisme og stressrespons. Den fysiologiske betydningen av miRNA-autofagi samtrafikk er bare begynner å bli belyst. MiRNA microarray teknologi muliggjør analyse av global miRNA uttrykket i visse situasjoner. I denne studien har vi utforsket uttrykket profilen miRNAs under responsen av menneskelige tykktarmskreftceller (HT29s) til 5-FU behandling og nærings sult ved hjelp av miRNA microarray analyse. Endringen av miRNA uttrykket viste samme mønster under begge forholdene ble ytterligere bekreftet fra QRT-PCR i tre human tykktarm kreft cellelinjer. I tillegg ble bioinformatiske prediksjon av målgener, pathway analyse og genet nettverksanalyse utført for å bedre forstå rollene til disse mirnas i reguleringen av autophagy. Vi identifiserte og valgt ut fire downregulated mirnas inkludert HSA-MIR-302a-3p og 27 oppregulert mirnas under disse to forholdene som har potensial til å målrette gener som er involvert i reguleringen av autophagy i menneskelige tykktarmskreftceller. De har potensial til å modulere autofagi i 5-FU-basert kjemoterapi ved kolorektalkreft
Citation. Hou N, Han J, Li J, Liu Y, Qin Y, Ni L, et al. (2014) mikroRNA Profilering i Human Colon kreft celler i løpet av 5-Fluorouracil-Induced Autophagy. PLoS ONE 9 (12): e114779. doi: 10,1371 /journal.pone.0114779
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 31 juli 2014; Godkjent: 13 november 2014; Publisert: 19.12.2014
Copyright: © 2014 Hou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (bevilgning nr 31100969) og Scientific Research Foundation for Returnerte Overseas kinesiske forskere, Statens utdanningsdepartementet (2013-09) til Dr. Hou. Det ble også støttet av en bevilgning fra Natural Science Foundation National of China (bevilgning nr 81172358) til Dr. Li. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesse eksisterer
Innledning
5-fluorouracil (5-FU) -basert adjuvant kjemoterapi har vært mye brukt som mainstream for behandling av tykktarmskreft (CRC). Men på grunn av den motstand mot 5-FU i mange pasienter, nye terapeutiske strategier blir undersøkt [1]. Autophagy er en evolusjonært konserverte eukaryote prosess som opprettholder intracellulær homeostase ved å fjerne unødvendige proteiner og skadede eller alderen organeller [2]. I de siste tiårene har akkumulere bevis vist at autofagi er i stor utstrekning i forbindelse med kreft [3]. Ved å opprettholde cellulære homeostase i friske celler, hindrer autofagi tumor transformasjon. Autophagy er også viktig for tumorprogresjon, slik at tumorceller for å overleve metabolsk stress eller anoikis, opprettholde deres tilpasning til omprogrammert metabolisme, som støtter tumorutvikling ved å indusere uvirksom og opprettholde overlevelse og selvfornyelse av kreft stamceller. Videre fordi autofagi spiller viktige roller i å bestemme hvordan kreftceller svare på terapi, er autofagi modulasjon anerkjent som en potensiell terapeutisk tilnærming i kreft [4], [5]. Autophagy synes å representere en gyldig mekanismen for resistens mot radio- og kjemoterapi. Våre tidligere undersøkelser har vist at inhibering av autophagy av 3-metyladenin (3-MA) eller liten interferens RNA målretting Atg7 (Atg7 siRNA) utvidet effektiviteten av 5-FU ved å forsterke apoptose i humane koloncancer [6], [7]. Autophagy er svært konservert og tett regulert. Imidlertid, de molekylære mekanismene som regulerer autophagy som reaksjon på cellulært stress er fortsatt ikke godt forstått.
microRNAs (mirnas), 18-25 nukleotider i lengde, er endogene små, ikke-kodende RNA som regulerer ekspresjonen av deres målgener ved å hemme oversettelse eller spalte messenger-RNA (mRNA), hovedsakelig gjennom interaksjon ved den 3 «ikke-translaterte regioner (UTR) av målet mRNAer [8]. Mirnas kan samtidig regulere en rekke mål og biologiske nettverk. Omvendt, kan flere forskjellige mirnas binde seg til og samvirkende styre en enkelt mRNA-mål. Mirnas har blitt funnet å spille en viktig rolle i å kontrollere mange cellulære funksjoner, inkludert vekst, differensiering, metabolisme og stressrespons og ga en klar fordel fra et klinisk synspunkt [9] – [11]. De siste årene har enkelte mirnas blitt studert som formidlere av autofagi regulering. MiRNA-30a kan sensitiv hepatomceller til cisplatin ved å målrette beclin-1-mediert autofagi [12]. MiRNA-101 har vist seg å være som en potent inhibitor av autophagy indusert av etoposid eller rapamycin i brystkreftceller [13]. Jegga et al. også foreslått at miRNA-130, miRNA-98, miRNA-124, miRNA-204 og miRNA-142 har potensielle regulatoriske funksjoner i autophagic prosess basert på matematisk analyse [14]. Den fysiologiske betydningen av miRNA-autofagi samtrafikk er bare begynner å bli belyst.
På grunn av det store antallet miRNAs, miRNA microarray teknologi har blitt mye brukt for å bestemme global miRNA uttrykket i visse situasjoner [15]. I denne studien har vi utforsket uttrykket profilen miRNAs i responsen av menneskelige tykktarmskreftceller (HT29s) til 5-FU behandling ved hjelp av miRNA microarray analyse. Å prioritere mirnas som korrelerte med autofagi, autofagi ble også indusert av et annet organ (nærings sult), og miRNA uttrykket ble også observert i den sammenheng. Den endret miRNA uttrykket viste samme mønster under begge forholdene ble ytterligere bekreftet fra QRT-PCR i tre human tykktarm kreft cellelinjer. I tillegg ble bioinformatikk prediksjon av målgener, pathway analyse og genet ontologi nettverksanalyse også utført for å bedre forstå rollene til disse mirnas i reguleringen av autophagy. Vi identifiserte og valgt ut fire downregulated mirnas og 27 oppregulert mirnas ved 5-FU behandling og sult i humane tykktarmskreftceller. Disse 31 mirnas har spådd målgener av reguleringen av autofagi, inkludert autofagi kjerne gener og autofagi regulatorer og har potensial til å modulere autofagi i 5-FU-basert kjemoterapi i CRC.
Materialer og metoder
Material
5-FU ble kjøpt fra Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). LC3 polyklonale antistoff ble kjøpt fra MBL (MBL, Nagoya, Japan). Anti-p62 og anti-β-aktin-antistoffer ble oppnådd fra Sigma, og den mTOR-antistoff var fra Cell Signaling Technology (Cell signale teknologi, Danvers, MA).
Cellekultur og behandling
HT29, HCT116 og DLD1 human kolorektal karsinom-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection, vennligst tilveiebrakt av prof Kuwano og dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2/95% luft med medium endres hver to dager. Celler i midt-log fase ble anvendt i denne studien. For 5-FU behandling ble HT29s behandlet med 5 uM av 5-FU i 24 timer. For nærings sult, ble HT29s inkubert i Krebs-Ringer-buffer [16] (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 24 mM NaHCO
3, 5,6 mM glukose, 2 mM CaCl
2, pH 7,6) ved 37 ° C i 7 timer.
Måling av celle levedyktighet og apoptose
celleviabilitet ble bestemt ved bruk av Cell Counting Kit 8 (CCK-8). Celler ble sådd ut i 96-brønners flatbunnede mikrotiterplater ved en tetthet på 1 x 10
3-celler per brønn. Etter behandling, ble 10 ul av CCK-8-løsning tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 1 time. Absorbansen til oppløsningen ble avlest spektrofotometrisk ved 450 nm med en referanse ved 650 nm ved hjelp av en mikrotiterplateleser (BIO-TEK ELX800). Cellelevedyktigheten ble beregnet i henhold til følgende formel: cellelevedyktighet (%) = A450 (prøve) /A450 (kontroll) x 100
celle apoptose ble analysert ved anvendelse av apoptose Detection Kit.. I korthet ble cellene høstet og farget med Annexin V-FITC (Annexin V) og propidiumjodid (PI). Apoptose ble definert av Annexin V
+ /PI
-. (Tidlig apoptose) og Annexin V
+ /PI
+ (sent apoptose) som bestemmes av FACScan (Becton Dickinson)
Analyse av autophagy
Analyse av autophagy ble utført hovedsakelig ved immunfluorescens og immunoblotting for mikrotubulus-assosiert protein 1B-lettkjede 3 (LC3) som beskrevet tidligere [7], [16]. For å bestemme immunfluorescens av LC3, ble cellene på kammeret lysbildet fiksert med 4% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,05% Triton X-100. Etter blokkering, ble celler inkubert med et anti-LC3 antistoff (1:500 fortynning) ved 4 ° C natten over, og inkubert med Alexa Fluor 488-konjugert anti-kanin-antistoff etter vask. Lysbilder ble montert og undersøkt ved hjelp av en fluorescens mikroskop (ECLIPSE TE2000-U, Nikon). Farging med 0,1 ug /ml 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ble utført for å identifisere kjerne. For immunoblotting av LC3, ble 20 ug av cellelysat separert på en 5-20% Tris-Tricine Klar Gel SDS-PAGE (Bio-Rad) for polyvinylidendifluorid (PVDF) membran blotting. Den utslettet membran ble blokkert og inkubert med anti-LC3 (1:1000 fortynning). De immunoreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av avansert kjemiluminescens hjelp av pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-antistoff (1:5000 fortynning). p62 og mTOR immunoblotting (1:1000 fortynninger begge) ble også utført for å evaluere autofagi staten.
RNA isolering og miRNA microarray
Total cellulær RNA ble høstet ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ) og en miRNeasy mini kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Exiqon LNA mikroRNA Menneskelig Array inkludert alle menneskelige modne mirnas (Database 18,0) ble brukt til å profilere miRNA uttrykk og fremført av Kangcheng Bio-Tech Inc. (Shanghai, Kina). Vi gjorde innlevering av våre microarray data til Gene Expression Omnibus, og aksesjonsnummer er GSE61943. I korte trekk, ble RNA prøver (1 mikrogram) merkes med en miRCURY Hy3 merking kit og hybridisert på miRCURY LNA Array (v.18.0). Etter vasking, ble platene skannet med en Axon GenePix 4000B microarray scanner, og den rå intensitet av bildet ble lest og analysert ved hjelp av GenePix pro 6.0-programvare (Axon). Fire replikert flekker av hver sonde på samme lysbilde ble i gjennomsnitt. Uttrykt miRNA data ble normalisert ved bruk av Median normalisering. Etter normalisering ble forskjellig uttrykt mirnas identifisert gjennom Fold Endre filtrering ( = 2)
Sanntids QRT-PCR-analyse for miRNA uttrykk
Kvantitativ revers transkripsjon polymerase chain reaction (qRT-. PCR) ble utført for å validere miRNA array-data. Modne mirnas ble reverstranskribert inn i cDNA ved stammesløyfe revers transkripsjon ved å bruke PrimeScript RT reagenssettet (Takara Bio, Shiga, Japan) og spesifikke stammesløyfe primere som vist i tabell 1. QRT-PCR for hver mirnas ble utført ved anvendelse Faststart Essential DNA Grønn Master (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) på en lightcycle96 maskin (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Primerne som benyttes er angitt i tabell 1. Hver prøve ble analysert i triplikat. De miRNA uttrykket nivåer ble normalisert til og kvantifisert ved U6 RNA. Relativ kvantifisering ble beregnet ved hjelp av to
(- ΔΔCt). Metoden
Target prediksjon og funksjonsanalyse
Målgenene av mirnas ble beregnet med skjæringspunktet mellom to store online miRNA mål prediksjon algoritmer, TargetScan (https://www.targetscan.org) [17] og PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de) [18], eller TargetScan og miRDB (http: //mirdb .org) [19] hvis det ikke var noen data for noen mirnas i PicTar.
DIANA-miRPath v2.0 (https://www.microrna.gr/miRPathv2) ble brukt til å analysere de viktigste funksjonene mirnas [20]. Vanligvis miRNA og sti-relatert informasjon er innhentet fra miRBase og Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) v58.1, henholdsvis. En ensidige Fishers eksakte test ble brukt for å identifisere de beriket KEGG trasé med målene for spesifikke mirnas, og den falske funnraten (FDR) ble beregnet til å rette opp p-verdi. Berikelse er et mål på betydningen av funksjon; som berikelse øker, er den tilsvarende funksjonen mer betydelig.
Gene ontologi (GO) nettverksanalyse ble også brukt til å analysere den viktigste funksjonen til de antatte målgener og avdekke miRNA-gennettverk på grunnlag av biologiske prosesser og molekylære funksjoner. Den CyTargetLinker plugin i Cytoscape (https://projects.bigcat.unimaas.nl/cytargetlinker) ble anvendt for å konstruere et integrerende nettverk av miRNA-target-interaksjoner for de seks mirnas identifisert i vår undersøkelse [21], [22]. De validerte mål for hver miRNA ble hentet fra mirTarBase, og de antatte målene ble hentet fra Targetscan.
Statistisk analyse
Alle data ble uttrykt som betyr ± standardavvik (SD). Alle statistiske analyser ble utført ved anvendelse av SPSS versjon 17,0 programvare. p. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
5-FU redusert levedyktighet HT29 menneskelige kolon kreftceller, etter
Effekten av hoved CRC kjemoterapi, 5-FU, i HT29 human kolon kreftceller ble bekreftet av en CCK-8-analyse. 5-FU (0~500 uM) ga en dose- og tidsavhengig inhibering av cellelevedyktighet som nådde 64,20% og 42,20% etter 5 uM 5-FU behandling for henholdsvis 24 timer og 48 timer (fig. 1). 5-FU kan ha mange virkninger på HT29-celler. Flowcytometri av Annexin V og PI farging ble anvendt for å detektere apoptose i vårt eksperiment. Det har liten apoptose i HT29-celler ved 5 uM 5-FU behandling i 24 timer (S1 fig.).
HT29-celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner (5 uM og 25 uM) av 5-FU til 12, 24, og 48 h. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av CCK-8-analyse. Data er vist som gjennomsnitt ± SD.
5-FU-indusert aktivering av autophagy i HT29-celler
Aktivering av autophagy av 5-FU i HT29-celler ble påvist ved LC3 immunofluorescens . I kontrollceller, fordelingen av LC3 viste et diffust mønster (cytoplasma, LC3- I). 5-FU behandling endret LC3 distribusjon til mange grove prikker og punktformet flekk (Fig. 2A), og ettersom tiden økt, prikkene ble mer intens. De LC3-positive punctuates (LC3-II) representerer autophagosomes. LC3 immunoblotting ble også brukt til å observere autofagi (Fig. 2C). LC3-II (16 kDa) ble indusert ved 5 uM 5-FU behandling i 24 timer. Som et karakteristisk mekanisme for å indusere autophagy induksjon, ble næringsstoffet sult også utføres (fig. 2B). Sult gjorde LC3 flekker mer intens, og i 7 timer, var det noen Punktum farging. I tillegg ble intensiteten av LC3 økes ved sult i 7 timer. Som indikator på autofagi forandring, ble p62 redusert både med 5-FU behandling og sult (Fig. 2C). Etter 5 uM 5-FU behandling i 24 timer ble cellelevedyktigheten av HT29-celler inhiberes, autophagy ble aktivert, og det var nesten ingen apoptose. Deretter utførte vi global ekspresjonsanalyse ved miRNA microarray analyser på begge HT29 cellene sultet i 7 timer og HT29-celler behandlet med 5 uM 5-FU i 24 timer.
HT29-celler ble behandlet med 5 uM av 5-FU eller ikke. Aktivering av autophagy ble observert ved LC3 immunofluorescens (A). HT29-celler ble sultet i Krebs-Ringer-buffer eller ikke. Aktivering av autophagy ble observert ved LC3 immunofluorescens (B). DAPI farging ble utført for å identifisere kjerne. LC3, p62 og mTOR immunblotting ble utført ved anvendelse av lysater av HT29-celler ble behandlet med 5 uM av 5-FU i 24 timer eller ikke, og sultet i 7 timer eller ikke (C). Dataene er representant for tre uavhengige eksperimenter. Bar, 20 mikrometer.
Identifikasjon av endret miRNA uttrykk med 5-FU og sult i HT29 celler
Etter microarray skanning og normalisering, 124 av 1900 modne menneskelige mirnas ble identifisert som oppregulert av sult i 7 timer i HT29 celler, og 56 mirnas ble nedregulert. Med 5 uM 5-FU behandling i 24 timer, var det 302 oppregulert mirnas og 86 nedregulert mirnas i HT29-celler. Å prioritere mirnas korrelerte med endringer i autofagi, de mirnas viser samme endret mønster i henhold til 5-FU behandling og sult (en andre standard måte å autofagi induksjon) ble ansett som mer sannsynlig å bli involvert i reguleringen av autophagy. De mirnas viser samme endret mønster under disse to forholdene var 94 oppregulert mirnas og 22 downregulated mirnas (S1 Table). Prediksjon av miRNA-regulert gen mål er et nødvendig skritt for å forstå funksjonene til en gitt miRNA. Skjæringspunktet mellom to forskjellige programmer (algoritmer) ble rapportert å øke følsomheten av prediksjon. TargetScan identifiserer mål med konservert komplementaritet til frø (nukleotider 2-7) av miRNA [23]. Vi brukte i skjæringspunktet mellom TargetScan og PicTar å forutsi målgener av endrede miRNAs. Dersom det ikke var noen data i PicTar, ble miRDB brukt i stedet for PicTar. Samlet vi identifisert og valgt ut fire downregulated mirnas, HSA-MIR-302a-3p, HSA-MIR-548ah-5p, HSA-MIR-133B og HSA-MIR-323a-3P, og 27 oppregulert mirnas, HSA-MIR-203a , HSA-MIR-99b-5 p, HSA-MIR-195-5p, HSA-la-7c-5p, HSA-MIR-320d, HSA-MIR-301 a-3p, vmiR-30e-5p, HSA-MIR-374c -5p, HSA-MIR-181a-5p, HSA-la-7g-5p, HSA-MIR-513b-5p, HSA-MIR-30b-5 p, HSA-MIR-19b-3p, HSA-MIR-19a-3p , HSA-MIR-15a-5p, HSA-MIR-106b-5p, HSA-MIR-330-3p, HSA-MIR-582-5p, HSA-MIR-16-5p, HSA-MIR-30a-5p, HSA -miR-23a-3p, HSA-MIR-26b-5 p, HSA-MIR-98-5p, HSA-MIR-186-5p, HSA-MIR-30D-5p, HSA-MIR-93-5p og HSA-MIR -320c, som å ha den anslåtte målgener involvert i reguleringen av autophagy, som inkluderer autofagi kjerne gener og autofagi regulatorer (tabell 2).
Validering av microarray data ved hjelp QRT-PCR i HT29, HCT11 og DLD1 celler
For å validere microarray data, utførte vi QRT-PCR på to nedregulert (HSA-MIR-302a-3p og har-MIR-548ah-5p) og fire oppregulert mirnas (HSA-speil 30a-5p, HSA-MIR-23a-3p, HSA-MIR-195-5p og HSA-la-7c-5p) i 5-FU behandlet eller sultet HT29 celler. Fordi tykktarmskreft er heterogene, ble den forandrede ekspresjonen av disse mirnas bestemmes også i andre to human tykktarmskreft-avledede cellelinjer, HCT116 og DLD1. Vi fant ut at i samsvar med resultatene fra miRNA microarray analyse uttrykket av disse miRNAs endret seg vesentlig basert på deres QRT-PCR målinger (Fig. 3).
Tre typer menneskelige tykktarmskreft cellelinjer, HT29 (A ), DLD1 (B) og HCT116 (C), ble behandlet som beskrevet i fig. 2. QRT-PCR ble utført for å validere endring av uttrykk for HSA-MIR-302a-3p, HSA-MIR-548ah-5p, HSA-MIR-30a-5p, HSA-MIR-23-3p, HSA-MIR -195a-5p og HSA-la-7c-5p underkant av 5-FU behandling (5-FU) og sult. Data er vist som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med reproduserbare resultater.
Pathway analyse og GO nettverksanalyse avslørte mirnas-autofagi samtrafikk
For å få innsikt i funksjonene til disse mirnas, DIANA-miRPath var brukes til å analysere KEGG trasé påvirket av disse 31 mirnas (Fig. 4). Som et resultat av de høye betydelig berikelse banene til de fire downregulated mirnas omfattet MAPK signalveien, som er rapportert å positivt delta i reguleringen av autophagy [24] (fig. 4A). Mer interessant, blant de høye betydelige berikelse veier av de 27 oppregulert mirnas, mTOR signalveien ble betydelig identifisert av disse mirnas (Fig. 4B, 4C og 4D). Konsekvent, ble proteinnivået av mTOR ble redusert under disse to betingelser (Fig. 2C). I tillegg miRNA-mRNA genet nettverksanalyse integrert disse mirnas og GOs ved å skissere de interaksjoner av miRNA og gå relaterte gener ved hjelp Cytoscape programvare (Fig. 5).
DIANA-miRPath v2.0 ble brukt til å analysere hovedfunksjonene til de utvalgte 31 mirnas (A, de fire downregulated mirnas, B, mirnas oppregulert mer enn firedoblet etter 5-FU behandling og sult, C, mirnas oppregulert mellom to og fire ganger under to forhold; D, mirnas oppregulert mer enn fire ganger og mellom to og fire ganger). Den vertikale aksen er KEGG sti kategorien, og den horisontale aksen er den negative logaritmen til
p
verdi (-log
p
), som representerer betydningen av trasé.
De integrerende nettverk ble opprettet ved hjelp Cytoscape programvare. Hvert nettverk har to typer noder, individuelle mirnas (røde sirkler) og deres spådd mRNA mål (rosa sekskant), hentet fra to forskjellige offentlige databaser (miRTarBase og Targetscan). Grafen viser at mRNA mål vises i to databaser, som er identifisert av fargen på forbindelses piler, miRTarBase (rød) og Targetscan (svart).
Diskusjoner
5 -FU-basert kjemoterapi er hovedstrømmen av adjuvant behandling av CRC. Autophagy modulering har vært ansett som en potensiell strategi for å implementere kjemoterapi i tumorterapi [4]. Mirnas spiller viktige roller i å kontrollere cellefunksjoner og har blitt rapportert å være involvert i reguleringen av autophagy i de senere år [25]. I vårt eksperiment, ble induksjon av autophagy bekreftet i HT29-celler av både 5-FU-behandling og nærings sult. Ved hjelp av miRNA microarray analyse, QRT-PCR, og bioinformatikk, vi identifisert og valgt ut fire downregulated mirnas inkludert HSA-MIR-302a-3p og 27 oppregulert mirnas inkludert HSA-MIR-30a-5p, HSA-MIR-23a-3p, hsa- MIR-195A-5p, HSA-MIR-99b-5p og HSA-la-7c-5p under disse to forholdene som har potensial til å målrette gener som er involvert i reguleringen av autophagy (tabell 2). Ytterligere funksjonelle analyser av disse mirnas må utføres.
Akkumulerende bevis tyder på at autofagi spiller viktige roller i tumorigenese og tumorterapi [3]. Det kan enten hemme eller fremme tumorigenesis avhengig av stadium av svulsten. Som til tumorterapi, synes autophagy å formidle virkningen av anti-cancermidler som inhiberingen av autophagy undertrykker deres terapeutiske effektivitet. Autophagy også kan aktiveres som en pro-overlevelse respons for å fremme terapeutisk motstand mot kjemoterapi. Og inhibering av autophagy forbedrer narkotika eller strålings-indusert celledød som vi har rapportert [6], [7]. Molekyler som er involvert i reguleringen av autophagic prosessen har dukket opp som lovende mål for innovative anticancer behandling [4].
Autophagy (hovedsakelig macroautophagy) er en strengt regulert, konservert katabolsk prosess. Etter induksjon, blir deler av cytoplasma sequestered inn karakteristiske dobbeltmembranblærer som kalles autophagosomes (vesikkel nucleation, vesikkel tøyelighet og gjenfinning). Deretter autophagosomes sikring med sene endosomer eller lysosomer, danner autolysosome (fusjon). Eksponering av det indre kammeret til lysosomale hydrolaser bevirker nedbrytning av det cytoplasmatiske last, og de resulterende nedbrytningsprodukter blir deretter sluppet ut i cytosol for resirkulering. Streng kontroll av autofagi er viktig for celle homeostase og respons på cellulært stress. En stor familie av kjerne autofagi regulatorer, den autofagi (ATG) -relaterte gener, tjener til å coordinately regulere trinnvis progresjon av autofagi fra autofagi induksjon til vesikkel kjernedannelse, vesikkel forlengelse, gjenfinning og fusion [26]. I tillegg er en mangfoldig og kompleks nettverk av oppstrøms signalveier bidra til autofagi regulering inkludert fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K), RAS-proto-onkogen og AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) veier, mange av dem sammen på pattedyr Målet rapamycin kompleks 1 (mTORC1), en nøkkel negativ regulator av autophagy signalering [27].
i vårt eksperiment, 27 mirnas som potensielt er rettet mot gener som regulerer autofagi ble funnet å være oppregulert etter 5-FU behandling eller sult. Pathway analyse antydet at mTOR signalveien ble betydelig identifisert av disse miRNAs. Det ble tidligere demonstrert i brystkreftceller som næringsstoff sult fører til en økning i autofagi gjennom hemming av mTOR [28]. Våre resultater også sterkt støttet denne effekten i løpet av 5-FU-indusert autofagi i tykktarm kreft celler. Blant disse mirnas, den anslåtte målgener av HSA-Mir-99b-5p inkludert mTOR. Og økningen av denne miRNA på to typer autofagi induksjon (5-FU behandling og sult) var signifikant, 5.624 og 6.243 ganger høyere enn kontrollen. Hsa-MIR-99b-5p garanterer videre etterforskning i reguleringen av autophagy i 5-FU behandling i menneskets tykktarm kreft. I tillegg til det mTOR-nettverket, ble beclin1 nettverket også rapportert å regulere autophagy i brystkreft [29]. Den BCL2 familie blokker sult-indusert autofagi ved å samhandle med BH3 domenet Beclin1 og er negative regulatorer av autofagi. I vårt eksperiment, HSA-la-7c-5p, HSA-MIR-195-5p, HSA-MIR-23a-3p, HSA-MIR-15a-5p, HSA-MIR-98-5p, og HSA-MIR-181a -5p er spådd til å målrette gener i BCL2 familien og også garanterer videre etterforskning. Selv om disse 27 mirnas viste oppregulert uttrykk under disse to metodene for autofagi induksjoner, de er spådd å målrette autofagi kjerne gener; HSA-MIR-30a-5p målretting av BECN1 og ATG5 har blitt vist i de tidligere rapportene [30]. Funksjonen til disse miRNAs må undersøkes nærmere. I tillegg var det bare fire downregulated mirnas med spådd mål involvert i autofagi regulering, mindre enn mengden av oppregulert miRNAs. Det viste også betydningen av mTOR signalveien i reguleringen av autophagy. Videre spådde målgener inkludert autofagi kjerne gener; HSA-MIR-302a-3p mål ULK1 og HSA-MIR-548ah-5p rettet ATG16L1, noe som tyder på at disse fire mirnas delta i autofagi prosessen i 5-FU behandling og har potensial til å bli brukt til å manipulere autofagi i 5-FU basert kjemoterapi i CRC.
rollene autofagi i kreft er avhengig av type kreft, sammenheng og stedet [4]. I denne studien har vi fokusert på 5-FU-indusert autofagi i menneskets tykktarm kreft basert på våre og andre tidligere rapporter. Det hadde 4 nedregulert mirnas inkludert HSA-MIR-302a-3p og HSA-MIR-548ah-5p; og 27 oppregulert mirnas inkludert HSA-la-7c-5p og HSA-MIR-30a-5p på 5-FU behandling og sult i menneskelige tykktarmskreftceller. Disse 31 mirnas har spådd målgener av reguleringen av autophagy, inkludert autofagi kjerne gener og autofagi regulatorer og er lovende mål for autofagi modulasjon i 5-FU-basert kjemoterapi i CRC. Disse dataene kan også kaste lys over mirnas-autofagi interaksjoner i andre krefttyper, samt gi en mekanisme for å potensielt regulere autofagi i klinisk praksis.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig.
5-FU induserer lite apoptose i HT29-celler. HT29-celler ble inkubert med 5-FU i 24 timer. Flowcytometri ved hjelp av Annexin V og PI ble utført for å påvise apoptose i vårt eksperiment. Det var lite apoptose av HT29 celler etter 5-FU behandling i 24 timer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0114779.s001 plakater (TIF)
S1 Table.
Differential miRNA uttrykket i sult (starv) vs. kontroll (Ctrl) og 5-FU vs. kontroll (DMSO) i HT29
doi:. 10,1371 /journal.pone.0114779.s002 plakater (DOC)
takk
Vi takker professor Kuwano H og Prof. Torii S (graduate school of Medicine, Gunma University, Maebashi, Japan) for deres type assistanse. Vi takker også Aiying Wang og Lin Yu for deres tekniske support.
