Abstract
Menneskemetastaseassosierte gen 1 (MTA1) er svært knyttet med metastase av prostatakreft; Men de molekylære funksjonene til MTA1 som forenkler metastase fortsatt uklare. I denne studien, viser vi at ved å stanse all MTA1 av siRNA behandlingsresultater i oppregulering av E-cadherin uttrykk ved fosforylering av AKT (p-AKT) og reduserer invasivitet av prostata kreft celler. Vi viser at MTA1 er uttrykt i over 90% av prostata kreftvev, spesielt metastatisk prostata kreft vev, sammenlignet med ikke-ekspresjon i normalt prostatavev. RT-PCR-analyse og Western blot analyse viste at MTA1 uttrykk er vesentlig høyere i svært metastatisk prostatakreft PC-3M-1E8 celler (1E8) enn i dårlig metastatisk prostatakreft PC-3M-2B4 celler (2B4). Dempe MTA1 uttrykk av siRNA behandling i 1E8 celler økte cellulære ondartede tegn, inkludert mobil limet evne, redusert celle invasiv evne og endret polariteten av mobilnettet cytoskjelettet. 1E8-celler overuttrykkende MTA1 hadde en redusert ekspresjon av E-cadherin, mens 1E8 celler behandlet med MTA1 siRNA hadde en høyere ekspresjon av E-cadherin. Ekspresjonen av fosforylert AKT (p-AKT) eller inhibering av p-AKT ved Wortmannin behandling (100 nM) betydelig endret funksjon MTA1 i reguleringen av E-cadherin uttrykk. Endringer i E-cadherin uttrykk endret seg rollen som p-AKT i cellulære ondartede tegn. Alle disse resultater viser at MTA1 spiller en viktig rolle i regulering av ondartet transformasjon av prostatacancerceller via p-AKT /E-cadherin pathway. Denne studien gir også en ny mekanistisk rolle for MTA1 i reguleringen av prostatakreft metastaser
Citation. Wang H, Fan L, Wei J, Weng Y, Zhou L, Shi Y, et al. (2012) Akt som megler metastase Associated Gene 1 (MTA1) Regulering av Expression of E-cadherin og fremme Invasivitet av prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (12): e46888. doi: 10,1371 /journal.pone.0046888
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: May 30, 2012; Godkjent: 06.09.2012; Publisert: 05.12.2012
Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Natural Science Foundation National of China (30973184) (www.nsfc.gov.cn). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de vanligste ondartet kreft og er den nest største årsaken til kreft dødsfall i amerikanske menn [1]. Behandlingssvikt oppstår for prostatakreft ofte på grunn av lymfeknute og /eller fjern organ metastaser. De molekylære mekanismer på prostatakreft metastase og invasjon er ikke godt klarlagt. Økende bevis har indikert at den menneskelige metastaseassosierte gen 1 (MTA1) er en nøkkelfaktor i metastase [2]. En studie som brukte en serologisk analyse av rekombinante cDNA-ekspresjonsbibliotek (Serex) fant at MTA1 er fortrinnsvis uttrykt i et panel av maligne prostatakarsinom-vev, sammenlignet med normale vev, noe som antyder at MTA1 kan være nødvendig for prostata carcinoma metastase [3] En annen studie fant at MTA1 ble selektivt over-uttrykt i metastatisk prostatakreft sammenlignet med klinisk lokalisert prostatakreft og godartet prostatavevet [4]. Disse studiene viste at MTA1 kan spille en viktig rolle i den metastasering av prostatakreft; derimot, er det mekanistiske rolle MTA1 i ferd med prostatakreft metastase fremdeles dårlig forstått.
MTA1 ble opprinnelig identifisert ved differensial-cDNA sikting ved bruk av svært metastatisk brystcancer-cellelinjer [5]. Den MTA1-genet koder for et nytt protein som inneholder en prolin-rik region (SH3-bindende motiv), en antatt sinkfingermotiv, et leucin zipper motiv og 5 kopier av SPXX DNA-bindingsmotivet [6]. Den MTA1 protein som er funnet i den nucleosome remodeling histon deacetylase (Nurd) kompleks, noe som er blitt vist å modifisere eller renovere kromosomer [7]. MTA1 fysisk samvirker med histon-deacetylase (HDAC), som spiller en viktig rolle i histon deacetylering og forandringen av transkripsjonen kontroll [8]. Som en viktig regulator av celle skjebne med en rolle i onkogenesen og progresjon av mange ondartede tumorer, har MTA1 tiltrukket seg stor oppmerksomhet [2].
(A-C) Typiske resultater for den MTA1 fargemønsteret bestemmes ved immunhistokjemi er vist i normal prostatavev (A), lokalisert prostata kreftvev (B), og metastatisk prostata kreftvev (C). Resultatene i B og C viste MTA1 uttrykk i begge kjerner og cytoplasma. Den opprinnelige forstørrelse for A-C er 200 ganger og detaljert med forstørret visning er 400 ganger. (D) En kvantitativ RT-PCR analyse av de MTA1 RNA-nivåer i 2B4 og 1E8 celler (øverst). En stjerne (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med 2B4-celler. (E) De protein uttrykk nivåer av MTA1 i 2B4 og 1E8 celler ble analysert ved Western blotting ved anvendelse av spesifikke antistoffer, og resultatene ble kvantifisert (øverst). En stjerne (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med 2B4-celler. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger.
For epitelceller for å utvikle seg til kreft celler, må det epiteliale mesenkymale overgangen (EMT) forekomme [9]. EMT fører epiteliale cellelagene å miste polaritet og celle-celle kontakter og utløser ombygging av mobilnettet cytoskjelettet [10], [11]. E-cadherin er å anse som en viktigste indikator på forekomsten av EMT [12]. E-cadherin spiller viktige roller i maligne fenotyper, inkludert celle adhesjon, cellulær differensiering, og cellestruktur. Den oppregulering av E-cadherin er blitt implisert i inaktivering av EMT [13], [14]. Derfor har E-cadherin blitt foreslått til å tjene som en sterk tumor suppressor i kreftutvikling [14], [15]. Histon deacetylering og /eller den hypermethylation av CPG øyene i E-cadherin har vist seg å være den viktigste mekanismer for E-cadherin stanse i tumorer [15], [16], [17]. MTA1 har vist seg å ha en rolle i histon deacetylering, endring av kromatinstruktur og transkripsjonskontroll [18], [19]. Disse resultatene antyder at MTA1 kan muligens regulere E-cadherin. Videre har MTA1 blitt vist å påvirke EMT fenotyper [20], [21]. Tidligere har vi vist at E-cadherin uttrykk er oppregulert i melanom og livmorhalskreftceller behandlet med MTA1 siRNA [22]. Men disse studiene ikke fokusere på mekanismen som regulerer endringer i E-cadherin genekspresjon av MTA1. Den fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT-reaksjonsveien er antatt å spille en viktig rolle i human cancer progresjon, inkludert utviklingen av prostatakreft [23], [24]. MTA1 har blitt funnet å regulere AKT uttrykk [25]. For å endre den maligne fenotype av kreftceller, kan MTA1 /AKT sti aktivere gener og motvirke gener som undertrykker spredning og /eller celle metastasering. Nylig har PI3K /AKT-reaksjonsveien er vist å være en sentral regulator av EMT [26], [27]. E-cadherin er også en viktig regulator av EMT og en inhibitor for kreftutvikling som kan reguleres av PI3K /AKT sti [28]. I denne studien viser vi at MTA1 endrer den ondartede fenotypen av prostata kreftceller og regulerer ekspresjon av E-cadherin med en AKT-fosforylering-avhengig mekanisme. Denne preklinisk studie gir en bedre forståelse av rollene til MTA1 og danner grunnlag for videre kliniske studier av MTA1 som et mål genet.
(A) Behandling med MTA1 siRNA redusert MTA1 uttrykk effektivt og forbedret E-cadherin uttrykk . De proteinnivåer ble analysert ved hjelp av Western blotting og ble normalisert til p-aktin. Kvantifisering av bandet intensiteter er vist (øverst). En stjerne (*) eller diamant (◊) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) i de MTA1 eller E-cadherin nivåer henholdsvis, sammenlignet med de ubehandlede celler og de negative kontroll siRNA-transfekterte celler, n = 3. (B) den klebende hastigheten~~POS=HEADCOMP ble kvantifisert ved MTT-analyse, og et representativt eksperiment er vist. Evnen som celler til å overholde en fast overflate var signifikant oppregulert i de cellene som var blitt behandlet med MTA1 siRNA. En stjerne (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med de ubehandlede celler og negativ-kontroll siRNA-transfekterte celler. (C, D, og E) ved hjelp av en Matrigel
TM-belagte transwellsystem, invasiv evne til celler behandlet MTA1 siRNA ble testet. Kvantifisering av antall invasive celler fra bunnen av transwellinnsatser er vist i det nedre panel. En stjerne (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med de ubehandlede celler og negativ-kontroll siRNA-transfekterte celler. (F, G og H) Endringene i cytoskjelettet struktur ble påvist ved konfokal mikroskopi: rød farging betegner α-tubulin. Blåfarging representerer kjerner. The «føtter» ble forkortet, og polariseringen ble svekket i celler behandlet med MTA1 siRNA. Disse endringene indikerer en redusert evne til å bevege seg (400 ganger). Et representativt resultat fra tre uavhengige forsøk er vist for alle data.
Materialer og metoder
Antistoffer og fargestoffer
Alle reagenser i denne studien var av analytisk kvalitet og er kommersielt tilgjengelige. De primære antistoffer som brukes i denne studien ble kjøpt fra følgende selskaper: den MTA1 antistoffet var fra Santa Cruz Biotech, USA; E-cadherin antistoff var fra Epitomics Inc, USA; den α-tubulin og p-aktin-antistoffer var fra Sigma, Tyskland, og den p-AKT (ser473) antistoff var fra Cell Signaling Technology, USA. De alkalisk fosfatase-konjugert anti-kanin anti-mus eller anti-geite-IgG ble også anskaffet fra Sigma. De FITC- og Cy3-konjugerte IgG ble kjøpt fra PTG lab, USA. DAPI (4, 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid, (2 ug /ml metanol)) ble kjøpt fra Taufkirchen, Tyskland. Wortmannin ble også kjøpt fra Sigma.
(A) Western blotting Resultatene viste at behandling med MTA1 siRNA økte E-cadherin uttrykk etter 48 timer. En stjerne (*) eller diamant (◊) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) i de MTA1 eller E-cadherin nivåer henholdsvis, sammenlignet med negativ-kontroll siRNA-transfekterte celler. (B) En Western blot-analyse viste også at transient transfeksjon med et plasmid som kodet for full-lengde MTA1 redusert E-cadherin ekspresjon etter 48 timer. En stjerne (*) eller diamant (◊) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) i de MTA1 eller E-cadherin nivåer henholdsvis, sammenlignet med celler transfektert med tom vektor. Endringene ble kvantifisert (øverst). Alle forsøkene ble gjentatt tre ganger.
Vevsprøver og cellelinjer
vev prøver av normal prostata, prostatakreft og metastatisk prostatakreft ble hentet fra Avdeling for patologi av Tongji Hospital, som er tilknyttet Huazhong University of Science and Technology. Alle de metastatisk prostatakreft vev ble tatt fra pasienter som hadde dokumentert metastatisk sykdom og gjennomgikk en transuretral reseksjon av prostata (TURP) for å avlaste en urinveisobstruksjon (fjernmetastaser og positiv bein scan, M1 i tumor-node-metastaser TNM staging) . Denne studien ble godkjent av lokale forskningsetisk komité (REC) ved Tongji Hospital of Huazhong University of Science and Technology i samsvar med prinsippet om Helsinki-deklarasjonen II. Alle skriftlig informert samtykke dokumenter fra hver deltaker ble innhentet under innmelding fase. Den dårlig metastatisk menneskelige prostata adenokarsinom PC-3M-2B4 cellelinje (2B4) og den svært metastatisk menneskelige prostata adenokarsinom PC-3M-1E8 cellelinje (1E8) ble kjøpt fra professor Zhengjie (Beijing University, Kina). Cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco-BRL, USA) med 10% (v /v) føtalt bovint serum (Si Jiqing, Hang Kina).
(A) En Western blot-analyse viste at behandling med MTA1 siRNA kan hemme AKT fosforylering etter en 48 timer siRNA behandling. En stjerne (*) og diamant (◊) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) i de MTA1 og E-cadherin nivåer henholdsvis, sammenlignet med negativ-kontroll siRNA-transfekterte celler. (B) Cellene ble inkubert med enten p-AKT-inhibitor Wortmannin (100 nM) eller DMSO i forskjellige tidsrom fra 24 timer til 48 timer, og de cellulære proteiner ekstraheres. Et Western blot-analyse viste at Wortmannin behandling fremmet ekspresjon av E-cadherin og inhiberte ekspresjon av MTA1 etter 24 timer. En stjerne (*), diamant (◊), eller trekant (Δ) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) i MTA1, E-cadherin eller p-AKT nivåer henholdsvis, sammenlignet med DMSO-behandlede celler. (C) Den tvungne over uttrykk for p-AKT ved transient transfeksjon av myr-AKT plasmid redusert ekspresjon av E-cadherin og økt ekspresjon av MTA1 etter 24 timer. Kvantifiseringen av båndene er vist (øverst). (D) Cellene ble transfektert med MTA1 siRNA i nærvær eller fravær av myr-AKT plasmid eller Wortmannin i 48 timer. Et Western blot-analyse ble brukt for å evaluere endringer i E-cadherin uttrykk. En stjerne (*), diamant (◊), eller trekant (Δ) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) i de MTA1, E-cadherin eller p-AKT-nivåer henholdsvis, sammenlignet med den negative kontroll siRNA-transfekterte celler. Kvantifisering av bandene intensiteter er vist (øverst). Alle forsøk ble gjentatt tre ganger.
Immunhistokjemi
En immunohistokjemisk analyse av MTA1 ble utført ved anvendelse av avidin-biotin-peroksidasekompleks metode. Avvoksede og seksjonene rehydratiserte vev ble inkubert over natten ved 4 ° C med et muse-monoklonalt anti-humant MTA1 antistoff ved en fortynning 1:100 og deretter vasket med PBS. Biotinylert geite-anti-kanin-immunglobulin (DAKO, Kyoto, Japan) ble deretter tilsatt til de seksjoner i 30 minutter ved romtemperatur. Etter at delene ble vasket med PBS, ble peroksydase-konjugert avidin (DAKO) og deretter påført. Peroksidase-aktivitet ble detektert ved å utsette delene for en oppløsning av 0,05% 3, 3-diaminobenzidin og 0,01% H
2o
2 i Tris-HCl-buffer (3, 3-diaminobenzidin løsning) i 3 til 6 minutter ved romtemperatur. Snittene ble motfarget med hematoksylin.
(A) Cellene ble behandlet med den myr-AKT plasmid eller tom vektor i 48 timer i nærvær eller fravær av E-cadherin siRNA. Den klebende egenskaper ble testet ved anvendelse av MTT-analysen, og et typisk resultat fra forsøk er vist. En stjerne (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med celler transfektert med tom vektor. En trekant (Δ) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med celler transfektert med den myr-AKT-kodende plasmid i fravær av E-cadherin siRNA. (B) Cellene ble inkubert med Wortmannin (100 nM) eller DMSO i 24 timer og deretter behandlet med og uten E-cadherin siRNA i 48 timer. Ved anvendelse av MTT-analysen, ble det klebende evne til celler testet. En stjerne (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med DMSO-behandlede celler. En trekant (Δ) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med de Wortmannin-behandlede celler i fravær av E-cadherin siRNA. (C, D, og E) Cellene ble behandlet med den myr-AKT plasmid eller en tom vektor i 48 timer i nærvær eller fravær av E-cadherin plasmid. En Matrigel
TM-belagt transwellsystemet ble brukt til å analysere invasive egenskapene til cellene. Kvantifisering av antall invasive celler fra bunnen av transwellinnsatser er vist (høyre panel). En stjerne (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med celler transfektert med tom vektor. En trekant (Δ) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med celler transfektert med en myr-AKT-kodende plasmid i fravær av E-cadherin siRNA. (F, G og H) Cellene ble behandlet med den myr-AKT plasmid eller en tom vektor i 48 timer i nærvær eller fravær av E-cadherin plasmid. Endringene i den cellulære cytoskjelettet ble overvåket ved konfokal mikroskopi. Rød farging representerer α-tubulin, og blåfarging representerer kjerner (400-ganger). (I, J og K) Cellene ble behandlet med Wortmannin (100 nM) eller DMSO i 24 timer og deretter behandlet med og uten E-cadherin siRNA i 48 timer. En Matrigel
TM-belagte transwellsystem ble anvendt for å måle endringer i den cellulære invasive evne. Kvantifisering av antall invasive celler fra bunnen av transwell innsatsen er vist (høyre panel). En stjerne (*) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med DMSO-behandlede celler. En trekant (Δ) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p 0,05) sammenlignet med de Wortmannin-behandlede celler i fravær av E-cadherin siRNA. (L, M og N) Cellene ble behandlet med Wortmannin (100 nM) eller DMSO i 24 timer og deretter behandlet med og uten E-cadherin siRNA i 48 timer. Endringene i den cellulære cytoskjelettet ble overvåket ved konfokal mikroskopi. Rød farging representerer α-tubulin, og blåfarging representerer kjerner (400-ganger). Et representativt resultat fra tre eksperimenter er vist for alle data.
RT-PCR og immunoblotting
For RT-PCR-analyse, ble totalt RNA isolert fra cellelinjer ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike), og cDNA ble syntetisert med M-MLV revers transkriptase (Promega, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. PCR ble utført ved anvendelse av en PCR-forsterkningssystem (Biometra, USA). Primerne ble utformet ved hjelp Oligo 6 programvare, identifisert av Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) og kjøpt fra Invitrogen. De MTA1 primer sekvensene var som følger: Spiss: 5’CTCTGCGCATCTTGTTGGACATA -3 «og bakover: 5′-TCAGCTTCGTCGTGTGCAGATAG -3». For en intern standard, p-aktin primer sekvenser var som følger: Spiss: 5’GCACCACACCTTCTACAATG -3 «og omvendt: 5’TGCTTGCTGATCCACATC TG -3».
For Western blot analyser, cellene ble lysert i RIPA-buffer (50 mM Tris /HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, og 0,5% (vekt /volum) natriumdeoksycholat). Ekvivalente mengder av celle-ekstrakter (150 pg) ble separert på en 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) og overført til en membran polyvinylidendifluorid (PVDF). Membranene ble blokkert i 25 mM Tris (pH 8,0) inneholdende 125 mM NaCl, 0,1% Tween 20 og 5% skummet melk i en time og deretter inkubert med de fortynnede primære antistoffer (MTA1: 1:200, E-cadherin og p -AKT: 1:2000 og β-actin: 1:1000) ved 4 ° C over natten. Etter inkubasjon med de primære antistoffer ble de sekundære antistoffer tilsatt i en 1:1000 fortynning. De immunreaktive bånd ble visualisert med alkalisk fosfatase og BCIP /NBT farging.
Kvantitativ Real-time PCR
For kvantitativ real-time PCR, ble totalt RNA isolert fra cellelinjer i Trizol reagens (Invitrogen , Cergy Pontoise, Frankrike). Første-tråd cDNA-syntese ble utført ved anvendelse av et cDNA-syntesesett (Amersham Bioscience, NJ). Kvantitativ real-time PCR ble utført på en ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA) ved hjelp av en QuantiTect SYBR Grønn kit (Qiagen, CA). Primerne ble utformet ved hjelp Primer Express 3.0-programvaren, identifisert av Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) og kjøpt fra Invitrogen. Hver prøve ble kjørt i triplikat. Betingelser for kvantitativ PCR reaksjonen var som følger, en syklus på 50 ° C i 15 minutter, en syklus på 94 ° C i 2 minutter, 40 sykluser ved 94 ° C i 15 s, 56 ° C i 20 s, og 70 ° C i 20 s. Ved slutten av PCR-reaksjonen, ble prøver underkastet en smelting analyse for å bekrefte spesifisiteten av amplikonet. De MTA1 primer sekvenser var: Spiss: 5’GCAGCTGAAGCTGAGAGCAAGTTA-3 «; Omvendt: 5»-CCTTGACGTTGTTGACGCTGA -3 «. De E-cadherin primer sekvenser var: Spiss: 5’TACACTGCCCAGGAGCCAGA -3 «; Omvendt: 5 «TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3′; For intern standard, GAPDH primersekvensene var: Videre: 5»- CCACTCCTCCACCTTTGAC-3 «; Omvendt:. 5’ACCCTGTTGCTGTAGCCA -3 «
Cell transfeksjon
Cellelinjene ble dyrket i 6-brønners vevskulturplater eller kolber ved 37 ° C med 5% CO2 i en fuktet inkubator (Heraeus, Tyskland). For siRNA transfeksjon ble cellene transfektert med 200 pmol /ml siRNA tosidig anvendelse av 5 ul Lipofektamin
TM 2000 (Invitrogen) når cellene var 20% konfluent ifølge produsentens protokoll. Kontrollene inkludert ikke-transfekterte celler og celler som hadde blitt transfektert med en egge negativ kontroll siRNA (Ruibo, Kina). For plasmidet transfeksjon, 4 x 10
5-celler ble sådd ut i en 6-brønns plate og transfektert ved anvendelse av 4 ug av plasmid og 10 ul av Lipofectamine
TM 2000 per brønn. The full-lengde MTA1 plasmid (PEGFP-C1 /MTA1) ble vennlig levert av professor Min Mahoney (Thomas Jefferson University), og den tomme vektor (PEGFP-C1) ble bevart ved vårt laboratorium. Den pCMV-SPORT6 E-cadherin plasmid ble kjøpt fra YRBIO (Kina), og E-cadherin genet ble subklonet inn i pcDNA vektor ved vårt laboratorium. Den pcDNA myr-HA-akt2 (myr-AKT) plasmid ble kjøpt fra Addgene (https://www.addgene.org/; Addgene plasmid 9016), og den tomme vektor pcDNA ble også bevart i vårt laboratorium. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon, og proteinnivåer ble målt ved Western blot. De MTA1 siRNA sekvenser var som følger: Spiss: 5 «CCCUGUCAGUCUGCUAUAA dTdT 3» og bakover: 3 «DTDTGGGACAGUCAGACGAUAUU 5». De E-cadherin siRNA sekvenser var som følger: Spiss: 5’CAGACAAAGACCAGGACUA dTdT 3 «og bakover: 3» dTdT GUCUGUUUCUGGUCCUGAU 5 «
Invasjonen analysen
For invasjonen analysen, 5 ×. 10
3-celler ble sådd ut i 100 pl RPMI 1640 medium på toppen av polyetylentereftalat (PET) membraner belagt med Matrigel
TM (1,5 mg /ml, BD Biosciences) innen Transwell cellekulturinnsatser (24-brønners innsatser , 8 mikrometer porestørrelse, Corning Life Sciences, Corning, New York). Den nederste kammeret ble fylt med 600 ul RPMI-1640 medium inneholdende 20% FBS, og supernatanten fra NIH3T3-celler (mus embryoniske fibroblast-cellelinje) for å virke som et kjemotaktisk faktor (KF). Cellene ble inkubert i 48 timer ved 37 ° C med 5% CO
2. Deretter ble cellene fiksert i 2,5% (v /v) glutaraldehyd og farget med krystallfiolett. De invaderende celler på gelen bunnen ble visualisert under et mikroskop (Leica, Tyskland) og kvantifisert ved å telle antallet celler i tre tilfeldig valgte felt ved en 100-gangers forstørrelse.
Den faste fase adhesjonsassayet
adhesjonen analysen ble utført ved bruk av tetrazolium-basert kolorimetrisk analyse (MTT). Like antall celler (4 x 10
4 celler per brønn) ble sådd ut på 96-brønners plater som var blitt forbelagt med 1 pg /ml fibronektin (FN) (Sigma, Tyskland). Som en sammenligning ble et likt antall celler også utsådd på plater belagt med bovint serumalbumin (1% w /v). Etter 1 time ble platene nedsenket i PBS inneholdende 1 mM MgCl
2 for å fjerne ikke-adherente celler. Deretter ble antallet adherente celler målt med MTT-analysen og avlest ved 490 nm. OD-verdier som reflekteres andelen av celler som klebet til FN-belagte 96-brønns plate. Frekvensen av adhesjonen ble beregnet ved den følgende ligning: verdien av OD av eksperimentet /verdien av OD av kontroll x 100%
Konfokalmikroskopi avbildning
For immunfluorescens farging. , 1 x 10
4-celler ble sådd ut på dekkglass (13 mm diameter). Etter at cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS, ble cellemembraner permeabilisert med 0,2% (v /v) Triton X-100 i PBS, og ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert med 5% BSA (w /v) i PBS. Det første antistoffet ble påført objektglassene ved 4 ° C over natten (α-tubulin: 01:50, MTA1: 01:20, og E-cadherin: 1:100). Etter inkubasjon med det første antistoff, ble cellene vasket tre ganger med kald PBS og inkubert med FITC- eller Cy3-konjugert IgG ved en 1:50 fortynning i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. Kjernene ble farget i 5 minutter ved romtemperatur med DAPI. Cellene ble skylt med PBS og observert ved hjelp av en konfokal mikroskop (Olympus, Japan).
Co-immunoprecipitation (Co-IP)
1E8 cellene vokste i 10 cm retter deretter ble høstet i ikke -denaturing lysis buffer (20 mM Tris ,, pH 8, 135 mM NaCl, 10% glyserol, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 2 mM EDTA, Roche komplett mini protease cocktail-hemmere. Alle de følgende prosedyrer var utført på is. Lysis buffer-oppløselige lysater, oppsamlet etter ekstraksjon i 4 timer og sentrifugering ved 12.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. i et rør 1mg cellelysat ble tilsatt med 40 ul MTA1 antistoff, og inkubert over natten ved 4 ° C . den neste dag, cellelysat inneholdende antistoff ble anvendt på protein G-koblede sepharose-kuler (Abcam) i 4 timer ved 4 ° C. perlene ble vasket 3 ganger i lyseringsbuffer. Endelig, supernatanten ble tilsatt til 25 ul 2 x ladningsbuffer . Western blotting ble utført etter separering protein og perler med koking.
Statistisk analyse
dataene ble analysert ved en ANOVA. Den statistiske analysere ble utført ved hjelp av SPSS versjon 13.0 programvare.
Resultater
Uttrykket av MTA1 i prostata carcinom
For å bekrefte uttrykk for MTA1 i menneskelig prostata kreft, en immunhistokjemisk farging analyse for MTA1 ble utført på normal prostata, prostatakreft og metastatisk prostatakreft prøvene vev (ressursene og kriterier for vev betegnelser er beskrevet i materialer og metoder avsnitt). Resultatene viste at i normal prostata prøver, MTA1 ekspresjon var knapt synlig (figur 1A). Men i de lokaliserte prostatakreft prøvene, ble positiv farging for MTA1 observert i kjerner av 6 av de 15 undersøkte vev (figur 1B). I tillegg, i 27 av de 30 tumormetastatisk prostata kreftvev, ble et høyt nivå av MTA1 farging observert både i cytoplasma og kjerner av kreftceller (figur 1C). En kvantitativ analyse for den positive farging av MTA1 i figur 1A-C er vist i figur S1. En RT-PCR og Western blot-analyse ble utført for å måle ekspresjonen av MTA1 RNA og proteinnivåer, henholdsvis, i PC-3M-1E8 (1E8) og PC-3M-2B4 (2B4) celler [29], [30]. Resultatene fra disse analysene er vist i figur 1D og E, noe som viser at MTA1 RNA og proteinnivåene var tilstede i begge cellelinjer, men ved forskjellige ekspresjonsnivåer. De mRNA ekspresjonsnivåer av MTA1 var 0,38 ± 0,01 og 0,83 ± 0,02 for 2B4 og 1E8 celler, henholdsvis, og de protein ekspresjonsnivåene i 2B4 og 1E8 celler var 0,58 ± 0,04 og 0,83 ± 0,02 henholdsvis (p 0,05, n = 3 for hver). Vi fant at 1E8 cellene uttrykte omtrent to ganger høyere nivåer av MTA1 RNA og 1,5 ganger høyere MTA1 protein nivåer sammenlignet med 2B4 celler. Derfor ble 1E8 cellelinje valgt å undersøke de biologiske egenskapene til MTA1 i prostata carcinoma in vitro.
Påvirkningen av MTA1 stanse på malign fenotype av 1E8 celler
Vi brukte siRNA til ned -regulate ekspresjonen av MTA1 i 1E8 celler. Tre par sirnas mot MTA1 ble utformet. Vi bekreftet effektiviteten av siRNA ved Western blotting (fig S2). Minst 60% knockdown av MTA en proteinnivå ble innhentet ved hjelp av siRNA-3 #, så vi valgte dette paret for vår videre studier (figur 2A). Vi har også over-uttrykt MTA1 i bakgrunnen av MTA1 siRNA, som bekreftet effekten brakt av siRNA-3 # i celler (Figur S3). SiRNA-transfekterte celler ble også analysert for ekspresjon av E-cadherin protein. Et Western blot analyse viste at ekspresjonsnivået av E-cadherin var høyere i MTA1 siRNA-behandlede celler (48 timer etter transfeksjon), noe som indikerte at MTA1 kan spille en rolle i den negative regulering av E-cadherin. Deretter analyserte vi adhesjonen evne MTA1 siRNA-behandlede 1E8-celler ved anvendelse av en fastfase-analyse kombinert med MTT-analysen (se materialer og metoder avsnitt). For den samme overflatebelagt konsentrasjon av FN, adhesjonen evne MTA1 siRNA-behandlede celler var signifikant høyere enn kontrollcellene. En representant bilde vises. Limet Satsene for ubehandlede, negativ kontroll siRNA-behandlede og MTA1 siRNA-behandlede celler var 40,07 ± 6,23, 50,22 ± 4,99 og 99,62 ± 9,62, henholdsvis (p 0,05, n = 3, figur 2B). Vi studerte også effekten av MTA1 på invasivitet av 1E8 cellene ved hjelp av en Matrigel
TM-belagt transwell modell. Mengdene av celler på bunnen av membranen, noe som reflekterte invasivitet av cellene var 597 ± 6,24 590 ± 5.77 og 201 ± 2,40 for de ubehandlede, negativ kontroll siRNA-behandlede og MTA1 siRNA-behandlede celler, respektivt (p 0,05, n = 3 Figur 2C-E). Endringer i den cellulære cytoskjelettet organisasjon og polariteten er også involvert i tumorceller metastase [31] Derfor undersøkte vi cytoskjelettet strukturer av MTA1 siRNA-behandlede celler ved konfokalmikroskopi og fant at føtter «av MTA1 siRNA-behandlede celler forkortet og at den cellulære polariteten ble svekket sammenlignet med kontrollceller (figur 2F-H MTA1: red; kjerner: blå). Disse resultatene antyder videre at MTA1 kan være involvert i de ondartede fenotyper av kreftceller, inkludert heft, invasivitet, cytoskeletal struktur og celle polaritet.
MTA1 regulerer uttrykket av E-cadherin
For å bekrefte rollen MTA1 i reguleringen av E-cadherin uttrykk, behandlet vi 1E8 celler med MTA1 siRNA og en full-lengde MTA1 plasmid for ulike tider fra 24 til 48 timer (translasjonsforskning nivå).
