Abstract
Endring i genekspresjon assosiert med kreft i bukspyttkjertelen kunne tilskrives variasjon i histone posttranslational modifikasjoner fører til påfølgende ombygging av kromatin malen under transkripsjon. Imidlertid forblir innbyrdes forbundet nettverk av molekyler som er involvert i regulering av slike prosesser unnvikende. hPaf1 /PD2, en subenhet av human PAF-kompleks, er involvert i reguleringen av transkripsjonen forlengelse har onkogene potensial. Vår studie undersøker muligheten for at reguleringen av histon metylering av hPaf1 kan bidra til endring i genekspresjon etter nukleosomale omorganisering. Her viser vi at knockdown av hPaf1 /PD2 fører til redusert di- og tri-metylering på histon H3 lysin 4 rester i kreft i bukspyttkjertelen celler. Interessant, colocalizes hPaf1 /PD2 med MLL1 (Mixed Lineage Leukemi 1), en histon metyltransferase som methylates H3K4 rester. Også en reduksjon i hPaf1 nivået resulterte i redusert MLL1 uttrykk og en tilsvarende reduksjon i nivået av CHD1 (Chromohelicase DNA-bindende protein 1), en ATPase avhengig kromatin remodelle enzym som spesifikt bindes til H3K4 di og trimetylsilyl merker. hPaf1 /PD2 ble også funnet å samhandle og colocalize med CHD1 både cytoplasmatiske og kjernefysiske ekstrakter av kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre kan redusert nivå av CHD1 lokalisering i kjernen i hPaf1 /PD2 Knockdown celler bli reddet av ektopisk ekspresjon av hPaf1 /PD2. Micrococcal nuklease fordøyelse viste en endret kromatinstruktur i hPaf1 /PD2-KD celler. Totalt sett, våre resultater tyder på at hPaf1 /PD2 i forbindelse med MLL1 regulerer metylering av H3K4 rester, samt samhandler og regulerer kjernekraftskyt av kromatin remodelle protein CHD1, tilrettelegge sin funksjon i kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation. Dey P, Ponnusamy MP, Deb S, Batra SK (2011) Menneskelig RNA Polymerase II-foreningen Factor 1 (hPaf1 /PD2) Regulerer Histone Metylering og Chromatin Ombygging i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 6 (10): e26926. doi: 10,1371 /journal.pone.0026926
Redaktør: Mary Bryk, Texas A M University, USA
mottatt: 04.09.2011; Godkjent: 05.10.2011; Publisert: 27 oktober 2011
Copyright: © 2011 Dey et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne på dette arbeidet er støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (CA78590, CA111294, CA127297, CA133774 og CA131944) og Department of Defense (BC073541). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Post-translasjonell modifikasjoner av grunnleggende histonproteinene som fosforylering, metylering, acetylering, ubiquitylation eller sumoylation, spille en viktig rolle i regulering av genuttrykk. En måte som slike histonmodifikasjonene funksjon er ved rekruttering av nedstrøms effektor proteiner som utfører bestemte uavhengige funksjoner på kromatin malen. Disse inkluderer kromatin remodeling proteiner som «lese» modifiserte histon merker og bruke ATP energi for å endre posisjonen av nukleosomer på DNA. Som et resultat, er det kromatin malen enten blokkert eller gjort tilgjengelig for transkripsjon maskineri, således regulere nedstrøms genekspresjon. Histon metylering, nærmere bestemt histon H3-lysin-4-rester mono-, di- og trimethylation, er for det meste assosiert med 5 «regioner av aktivt transkriberte gener [1]. Men en fersk undersøkelse viser at i områder av DNA-skade, ING proteiner rekruttere HDAC komplekser til taushet transkripsjon av celleproliferasjonsprosesser gener gjennom anerkjennelse av trimetylert H3K4 rester av sine PHD domener [2]. Dette er den første rapporten bindings K4 trimethylation aktivt fortrengte gener i tillegg.
I pattedyr er metylering ved H3K4 residuet utført av histon metyltransferase MLL1, en SET-domene inneholdende protein som forblir i et kompleks med andre subenhet proteiner WDR5, RbBP5 og ASH2 [3]. Gjæren homolog av MLL1, Set1, er en del av et makromolekylært kompleks kalt KOMPASS (kompleks av proteiner forbundet med Set1) som samvirker med gjær PAF kompleks for histon metylering [4]. Det har blitt hevdet at noen konserverte gener, fra Drosophila til mennesker, ha dette metylering mark eksklusivt og uttrykket av disse genene er regulert av Pol II generelle forlengelse faktorer [1]. De H3K4 histone metylering merker kan bli ytterligere kjennes av spesifikke proteiner, noe som resulterer i rekruttering og påfølgende enzymatisk eller fysiologisk aktivitet på stedet av rekruttering. CHD1 (Chromodomain helicase DNA-bindende protein 1) er et protein som tilhører familien av ATPase avhengige kromatin remodeling faktorer som spesifikt forbinder med dimethylated og trimetylert H3K4 [5], [6]. Den menneskelige CHD1 binder seg til metylert histone H3K4 rest gjennom begge sine tandem chromodomains, mens gjær Chd1 ikke klarer å binde denaturert H3K4 rester [7].
Kreft utvikling og progresjon skyldes feilregulert genekspresjon som kanskje ofte relateres til enten feil epigenetisk aktivering eller stanse av gener [8]. Endrede histone modifisering mønstre forårsake Feilmålretting av kromatin remodeling enzymer som kan føre til ukontrollert genekspresjon og dermed føre normale celler til å bli forvandlet til kreftceller. Kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft med en svært dårlig prognose og fem års overlevelse på mindre enn 5%. I likhet med andre former for kreft, kreft i bukspyttkjertelen er også korrelert til epigenetiske endringer slik som DNA-metylering og histonmodifikasjonene, som fører til en endret genekspresjon [9].
PD2 er den humane homolog av gjær RNA-polymerase II- assosiert faktor 1 (yPaf1) som utgjør kjernen subenheten av den humane RNA-polymerase II-assosiert faktor (hPAF) kompleks. I likhet med dets motstykke gjær, er det hPAF komplekset består av fire andre underenheter, nemlig hLeo1, hCtr9, hSki8 og parafibromin [10] – [12]. De viktigste funksjonene til hPAF komplekset omfatter transkripsjonen forlengelse, mRNA-prosessering og modning, lik som den gjær PAF-komplekset [12]. Kromatin modifikasjon og remodellering er også noen av karakteristikkene av transkripsjonsfaktorer. Øyensynlig, en rekke histonmodifikasjonene har vært knyttet til den PAF-komplekset og transkripsjon forlengelse samt [4], [13]. Både gjær og det humane PAF-komplekset er funnet å være nødvendig for Rad6 /Bre1 avhengig ubiquitylation av histon H2B [14]. Den monoubiquitylation av H2B ved hPAF fjerner nukleosomale barrieren, noe som er en forutsetning for effektiv transkripsjon forlengelse på kromatin ved RNA-Pol II [14]. Tilstedeværelsen av ubiquitylated H2B utløser ytterligere H3K4 di og tri-metylering. I gjær, er det Paf1C funksjon i H3K4-Me3 formasjon gitt ved Rtf1 underenheten ved å rekruttere det SET1 histon-metyltransferase-komplekset [15], som er homologt med det humane MLL-komplekset [16]. Gjær studier viser også at Paf1 komplekse kreves for rekruttering av COMPASS metyltransferase komplisert å RNA polymerase II gjennom subenhet interaksjon. I humane celler, synes hCdc73 å være nødvendig for fullstendig nivåer av H3K36-Me3 [17], men ikke H3K4-Me3, mens i gjær Cdc73 er nødvendig for begge modifikasjoner [18]. Derfor har rollen som PAF kompleks i transkripsjon forlengelse vært nært korrelert til histonmodifikasjonene.
I tillegg til sin rolle i transkripsjon regulering, de menneskelige PAF komplekse subenheter har også vært knyttet til en ondartet fenotype. Parafibromin (hCdc73) er funnet å være mutert i parathyroid tumorer og forsterkes i leveren og brystkreft. Leo1, til stede på 15q21 locus, forsterkes i tykktarmskreft og malignt fibrøst histiocytoma av bein, mens
Ctr9
genet locus er funnet å bli slettet i bukspyttkjertelkreft. Den hPaf1 subenheten av den humane PAF kompleks, også kjent som PD2, forsterkes og overuttrykt i kreft i bukspyttkjertelen og dens mulige rolle i tumorgenese indikeres ved induksjon av en transformert fenotype på overekspresjon [19]. I denne studien identifiserer vi en rolle hPaf1 /PD2 i regulering histone metylering ved H3K4 rester i bukspyttkjertelen kreftceller ved interaksjon med histone metyltransferase MLL1. Det ble også funnet å regulere uttrykk for kromatin remodelle faktor, CHD1 som spesifikt binder seg til di og trimetylert H3K4 og tilrettelegge sitt atom import, sannsynligvis gjennom direkte samhandling. Videre micrococcal Nukleasefordøyelse analyser viser at knockdown av PD2 fører til endret nukleosomale posisjonering i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer Panc1 og MiaPaca ble oppnådd fra ATCC. Cellene ble kultur i DMEM medium (Sigma) supplementert med 10% føtalt bovint serum (Sigma) og 1% penicillin-streptamycin-oppløsning (Sigma). Kultur medium ble endret hver 2 dager, og cellene ble dyrket av trypsin-EDTA behandling.
RNA Isolation og QRT-PCR
Total cellulær RNA ble ekstrahert fra Panc1 celler ved hjelp av RNAeasy kit (Qiagen) og bearbeidet for revers transkripsjon. Den første PCR-aktiveringstrinnet var ved 94 ° C i fire minutter, etterfulgt av denaturering trinn ved 94 ° C i ett minutt, primer-glødetrinn ved 58 ° C i 30 sekunder, forlengelsestrinn ved 72 ° C i ett minutt, og den endelige forlengelsestrinn ved 72 ° C i ti minutter. PCR-reaksjonsprodukter ble så separert ved elektroforese ved anvendelse av en 2% agarosegel. Gelene ble farvet ved anvendelse av 0,5 ug /ml etidiumbromid, belyst med UV-lys. Totalt celle RNA ble revers-transkribert og analysert ved hjelp av kvantitativ real-time PCR ved hjelp SYBR Grønn innlemmelse. Uttrykket av alle genene ble normalisert til den av intern kontroll β-aktin og uttrykt i forhold til den angitte referanseprøven (gjennomsnitt ± standardavvik av tredoble reaksjoner). Uttrykk for avstamning spesifikke gener ble sammenlignet mellom egge og PD2 knockdown Panc1 celler ved den tosidige t-test. En p-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
RNA interferens
Regionen Paf1 /PD2 var målrettet med spesifikke siRNA (sekvensen 5’AACAGGUUCGUCCAGUACAAA-3). «. Syntetisk sense og antisense oligonukleotider (Dharmacon, Lafayette, CO) ble glødet i 100 mM kaliumacetat, 30 mM HEPES-KOH (pH 7,4), og 2 mM magnesiumacetat i ett minutt ved 90 ° C og en time ved 37 ° C, og frosset. Oligonukleotider ble transfektert inn i celler med
Trans
IT-TKO (Mirus, Madison, WI) i henhold til leverandørens anbefalinger.
Immun analysen
Panc1 og MiaPaCa cellelinjer var bearbeidet for proteinekstraksjon og Western blotting ved anvendelse av standardprosedyrer. I korthet ble cellene vasket to ganger i PBS og lysert i RIPA-buffer (100 mM Tris, 5 mM EDTA, 5% NP40; pH 8,0) inneholdende proteaseinhibitorer (1 mM fenyl-metyl-sulfonyl-fluorid, 1 ug /ml aprotinin, 1 pg /ml leupeptin) og holdt ved 4 ° C og supernatantene ble samlet. Tyve ug protein lysater ble løst i 10% SDS-PAGE. Løst proteiner ble overført til PVDF-membran. Etter kort vasking i PBST (Fosfatbufret saltvann og 0,1% Tween 20), ble membranene blokkert i 5% fettfri tørrmelk i PBS i minst 2 timer og deretter inkubert med primære antistoffer (anti-Paf1 /PD2, anti-Leo1, anti-CDC anti-Ski8, anti- Oct3 /4, anti-SOX2, anti-β-aktin) (fortynnet i 3% BSA i PBS) over natten ved 4 ° C. Membranen ble deretter vasket (3 x 10 min) i PBST ved romtemperatur og probet med 1:2000 fortynnet pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus eller anti-kanin sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur og vasket 5 x 10 min med PBST . Signalet ble påvist med en ECL-kjemiluminescens-settet (Amersham Bioscience, UK). Alle de vestlige blotter ble kvantifisert ved hjelp av ChemiImager 4400-programvaren. Grafene generert viser feilfelt representerer standard feil som beregnet ut fra tre uavhengige eksperimentelle replikater. Forskjellen i hvert protein nivå mellom kryptert og PD2 knockdown celler blir analysert ved Studenter t-test med en p-verdi på mindre enn 0,05 blir vurdert som statistisk signifikant.
Konfokalmikroskopi
Celler ble sådd på sterile runde dekkglass (CIR 18-1 Fisher splitter 12-545-10) og dyrket i 12-brønners plater i 24 timer. Celler ble fiksert i iskald metanol (på forhånd avkjølt til -20 ° C) og permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i PBS. Deretter ble cellene vasket i PBS og blokkert ved bruk av 10% geiteserum i 30 minutter. Etter blokkering, ble det inkubert med primær (PD2 mus monoklonalt, CHD1 kanin polyklonale) antistoff i en time og fluoriserende merkede sekundære antistoff (FITC geit anti-mus, Texas Rødt-geite-anti-kanin) i 30 minutter ved romtemperatur. Antistoffer ble fortynnet i 5% geiteserum. Til slutt, etter sekundært antistoff inkubasjon ble cellene vasket med TBST tre ganger, og dekkglass ble montert med Vectashield innehold DAPI (vektor).
Isolering av cytoplasmisk og kjerneekstrakt
Protokollen for cytoplasmiske og kjerneekstrakt preparat ble tilpasset fra tidligere publiserte prosedyrer. Cellene ble skylt to ganger i iskald PBS og inkubert på is i 30 minutter i hypoton cytoplasmiske ekstraksjonsbuffer (10 mM Hepes, pH 7,4, 10 mM KCl, 0,2% NP-40, 0,1 mM EDTA, 10% glycerol, 1,5 mM MgCl
2, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 mM Na
3VO
4, 5 mM NaF), supplert med fullstendig proteasehemmer cocktail [Roche]. Celleødeleggelse ble oppnådd ved flere passasjer gjennom en 25G nål. Cellekjernene ble oppsamlet ved sentrifugering ved 16 000 g, og supernatanten ble ytterligere sentrifugert ved 16 000 g for å gi den endelige cytoplasmisk ekstrakt. Nukleære pellet ble vasket to ganger med iskald PBS, etterfulgt av inkubering i hypertone atom ekstraksjonsbuffer (20 mM Hepes, [pH 7,6], 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glyserol, 1,5 mM MgCl
2, 1 mM DTT , 1 mM PMSF, 5 mM Na
3VO
4, 5 mM NaF), supplert med fullstendig proteasehemmer cocktail [Roche]. Oppløsningen ble ytterligere ultralydbehandlet ved 60% amplitude to ganger i 10 sekunder hver. Uløselig materiale ble utfelt ved sentrifugering. Supernatanten ble oppsamlet og anvendt som kjerneekstrakt.
Immunoutfellingsanalyse
Like mengder protein A + G-Sepharose-kuler (Oncogene Research, Boston, MA) ble inkubert over natten med anti-PD2 (kanin polyklonale) og anti-CHD1 (kanin polyklonale) antistoff i en 1 ml total volum. Den ble deretter vasket to ganger for å fjerne ubundet antistoff og 1,5 mg protein-lysat ble tilsatt til vulsten-antistoffblanding og inkubert på en roterende plattform i 5 timer ved 4 ° C. Etter inkuberingsperioden, ble blandingen vasket fem ganger med lyseringsbuffer. Immunopresipitatene eller de totale cellelysatene ble elektrofore løst på SDS-PAGE (10%). Løst proteiner ble overført til PVDF-membran. Etter kort vasking i PBST (Fosfatbufret saltvann og 0,1% Tween 20), ble membranene blokkert i 5% fettfri tørrmelk i PBS i minst 2 timer og deretter inkubert med primære antistoffer (anti- Paf1 /PD2, Oct3 /4 og RNA-Pol II). De immunoblot ble vasket fem ganger (5 x 10 min), inkubert 1 time med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer, vasket fem ganger (5 x 10 min), omsatt med forsterket kjemiluminescens ECL-reagens (Amarsham Bioscience, Buckinghamshire, UK), og eksponert for røntgenfilm for å detektere signalet.
Micrococcal nuklease-analyse
micrococcal-nuklease-analyse ble utført som tidligere nevnt [20] med noen modifikasjoner. Femti x 10
6-celler ble pelletert ved 2000 rpm ved 4 ° C i 10 minutter, etterfulgt av vasking med 10 ml iskald PBS og pelletert på nytt som før. Cellene ble deretter resuspendert i 5 ml iskald NP-40 lyseringsbuffer (10 mM tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl
2, 0.5% Nonidet P-40, 0,15 mM spermin og 0,5 mM spermidin), inkubert i 5 minutter på is og kjernene ble pelle. Kjernene ble vasket med 2,5 ml av MNase fordøyelse buffer (10 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 0,15 mM spermin og 0,5 mM spermidin) og etter sentrifugering ytterligere resuspendert i 1 ml av MNase fordøyelse buffer inneholdende 2 mM CaCl
2. Fra de resuspenderte oppløsninger ble 100 ul alikvoter tatt og inkubert med økende mengder av det Micrococcal Nuclease enzym (0, 80 og 100 enheter) i 5 og 10 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 80 ul av MNase fordøyelse buffer, 20 ul MNase stoppbuffer (100 mM EDTA, 10 mM EGTA), 3 pl proteinase K (25 mg /ml) og 10 ul 20% SDS og inkubert over natten ved 37 ° C. Den følgende dag, blir prøvene ekstrahert med 200 pl fenol-kloroform-løsning. Prøvene ble sentrifugert, og et vandig lag ble samlet opp. To ul RNase A (10 mg /ml) ble tilsatt til løsningen og inkubert ved 37 ° C i 2 timer og på nytt fenol-kloroform ekstraksjon ble utført. Videre, ble DNA utfelt ved tilsetning av 100% etanol, og etter sentrifugering ble DNA-pelleten resuspendert i DNA hydrering buffer eller vann. Fem mikrogram av det isolerte DNA ble løst i en 1,4% agarosegel og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. ImagJ programmet ble brukt for densitometry analyse av DNA båndmønstre i kontroll, eggerøre og PD2 KD PC celler.
Resultater
hPaf1 /PD2 påvirker andre PAF komplekse subenheter i PC-celler
humane PAF-komplekset består av fem underenheter, i likhet med dets motstykke gjær, nemlig hPaf1, parafibromin (hCdc73), hCtr9, hLeo1 og hSki8 subenhet, som også er en del av det humane SKI komplekset. Tidligere rapporter har vist at underenhetene av det humane PAF-komplekset demonstrere koordinert ekspresjon hvor knockdown av enten hCtr9 eller hSki8 subenheten førte til en reduksjon i nivåene av de andre underenheter som hPaf1 og hLeo1 [12]. Dette er konsistent med den observasjon i gjær, hvor delesjon av de enkelte underenheter fører til ulike grader av reduksjon i proteinnivåer av andre subenheter [21]. Interessant nok har de siste data fra vårt laboratorium vist at PAF komplekse subenheter fungere uavhengig i mus embryonale stamceller, slik at knockdown av Paf1 subenheten ikke påvirker nivået av de andre underenheter [22]. For å analysere den funksjonelle betydningen av hPaf1, den store subenheten av hPAF kompleks, i kreft i bukspyttkjertelen, vi forbigående slått ned hPaf1 /PD2 i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer Panc1 og MiaPaCa. I bekreftelse med tidligere rapporter, fant vi at hPaf1 /PD2 har et koordinert uttrykk med de andre subenheter av hPAF kompleks. Western Blot-analyse av hCdc73 (parafibromin), hLeo1, hSki8 og hCtr9 proteiner og påfølgende kvantifisering viste redusert ekspresjonsnivåer av hLeo1, hCdc73 og hCtr9 subenheten i hPaf1 knockdown Panc1 og MiaPaCa celler i forhold til de kodede siRNA behandlede celler (Fig. 1) selv om det ikke er statistisk signifikant. (P 0,05) men det var ingen observerbar forandring i proteinnivået hSki8 subenhet ved nedregulering av den hPaf1 subenheten. Vi ytterligere bekreftet resultatene ved å bruke en annen pool av siRNAs (Santa Cruz, California) rettet mot PD2 og observert lignende effekter (Fig. S3). Disse resultatene viser at knockdown av en subenhet av hPAF komplekset påvirker ekspresjonen av de andre medlemmene for å opprettholde en generell støkiometrisk forhold av komplekset i kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre understreker det også differensial uttrykk og funksjon av individuelle subenheter av PAF komplekset i forskjellige karsinomer.
Panc1 og MiaPaCa bukspyttkjertelen kreft celler ble transfektert med egge og PD2 spesifikke siRNA oligos og proteinlysatene ble samlet på 72 timer post-transfeksjon. Western blot analyse av cellelysatene ved hjelp av tilsvarende antistoffer viste uttrykk for hPaf1 /PD2 og andre PAF komplekse molekyler (parafibromin, hLeo1, hSki8 og hCtr9) i egge og Paf1 /PD2 RNAi behandlet Panc1 og MiaPaCa celler. Uttrykket av histone 3 Lysin 4 rest mono, di og tri-metylering merkene viste et redusert nivå i hPaf1 /PD2 knockdown Panc1 og MiaPaCa celler i forhold til egge RNAi behandlede celler. Den totale Histone H3 nivå er den samme i både kryptert og PD2 slått ned celler. β-actin fungert som en lasting kontroll. Kvantifisering av de vestlige blotter for hver cellelinje er gitt under immunoavtrykket tallene med tilsvarende feilfelt. * Representerer betydelig endring (p 0,05) i proteinnivå mellom kryptert og PD2 knockdown celler
hPaf1 /PD2 påvirker histon metylering i PC-celler
gjær PAF komplekset har en brønn. etablert rolle i histonmodifikasjonene som ubiquitylation og metylering [4], [23] – [25]. Det er kjent å mediere interaksjonen mellom Rad6-Bre1 kompleks, KOMPASS histon metyltransferase, og RNA-Pol II, som fører til ubiquitinering av histon H2B ved lysin 123 rest, som er en etterfølgende trigger for metylering på lysin-4 rest av Histone H3 [24]. En tidligere studie har vist at RNAi mot hCtr9 eller hSki8 førte til en reduksjon i cellenivå av histon H3K4 mono- og trimethylation merker, men ikke dimetylering merker i HeLa-celler, noe som indikerer en mulig rolle av det humane PAF-komplekset i histon metylering samt [12 ]. Vi fant at forbigående knockdown av hPaf1 /PD2 med bestemte RNAi i kreft i bukspyttkjertelen celler påvirker histone metylering ved H3K4 rest (Fig. 1). Western Blot-analyse av mono-, di- og trimethylation merker på histon H3 lysine4 rest viste en signifikant reduksjon (p * 0,05) i di- og trimetylert H3K4 nivåer i PD2 knockdown Panc1 og MiaPaCa celler sammenlignet med egge RNAi behandlede celler. Men det var ikke mye variasjon i de H3K4 monomethylation nivåer på grunn av PD2 reduksjon i kreft i bukspyttkjertelen celler. Forsøkene ble gjentatt med et annet basseng av PD2-spesifikke sirnas i begge cellelinjer (Fig. S3). Vi igjen observert nedregulering av histon di- og trimethylation merkene som før med liten eller ingen variasjon i histone monometyl- nivåer.
hPaf1 /PD2 regulerer histone metyltransferase MLL1 protein nivå
Basert på observasjonen om at hPaf1 /PD2 regulerer histon di og tri-metylering ved H3K4 rester, ønsket vi å undersøke effekten av hPaf1 knockdown på histone metyltransferaser. Den MLL1 protein som hører til familien av SET1 lysin metyltransferaser er kjent for spesifikt å regulere di-og trimethylation ved histon H3-lysin 4-rester. Derfor analyserte vi effekten av hPaf1 /PD2 knockdown på MLL1 protein uttrykk ved hjelp av to ulike sett av PD2 sirnas i Panc1 og MiaPaCa bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Western blot analyse viste at en reduksjon i hPaf1 /PD2 nivå i kreft i bukspyttkjertelen celler fører til en betydelig reduksjon (* p 0,05) i MLL1 proteinnivå (figur 2A, S3.). Grafene gitt under immunoblottingforsøk resultatene representerer kvantifisering av de vestlige blotter for hver cellelinje. Vi har videre sett på PD2-og MLL1 proteiner i kreft i bukspyttkjertelen celler ved konfokal mikroskopi og funnet at de to proteinene colocalize i kjernen, og dermed tyder på en mulig interaksjon mellom dem (fig. 2B). Imidlertid er mengden av colocalization av de to proteinene var forholdsvis lav, noe som indikerer en eventuelt svak og /eller transient interaksjon. Disse resultatene var i corroboration med tidligere studier som viste at både gjær og humane PAF-komplekser samvirke med den tilsvarende homolog av MLL eller Set1 protein [4], [26], [27]. Derfor våre resultater tyder på at hPaf1 /PD2 regulerer, og muligens samhandler med MLL1, for å kontrollere H3K4 metylering i kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) Panc1 og MiaPaCa kreft i bukspyttkjertelen celler ble transfektert med egge og PD2 RNAi oligos og lysatene ble samlet på 72 timer etter transfeksjon. Western blot-analyse ved anvendelse av spesifikke antistoffer som viser en nedgang i MLL1 histon-metyltransferase-protein ekspresjon i knockdown-celler sammenlignet med eggeceller. β-actin fungert som en lasting kontroll. Kvantifisering data av western blot er anordnet under de tilsvarende Immunoblotanalyse resultater for de respektive cellelinjer. Feilstolpene representerer standardfeil indikert beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. * Representerer betydelig endring (p 0,05) i proteinnivå mellom kryptert og PD2 knockdown celler. (B) konfokalmikroskop bilder som illustrerer PD2 og MLL1 lokalisering i kjernen av Panc1 celler. MLL1 colocalizes med PD2 i diskrete regioner i kjernen (farget med DAPI) av Panc1 celler. Det innfelte representerer et forstørret bilde av colocalization flekker av PD2 og MLL1.
knockdown av hPaf1 /PD2 synker CHD1 nivå i kreft i bukspyttkjertelen celler
Reguleringen av histon metylering av hPaf1 /PD2 subenhet av hPAF komplekset øker muligheten for at det kan påvirke forskjellige andre proteiner, slik som kromatin remodeling faktorer, som samvirker med modifiserte histoner i områder av transkripsjon. En antatt kromatin ombygging kompleks, CHD-1 (Chromodomain helikase DNA-bindende protein 1), ble identifisert adventitiously som en pattedyr-DNA-bindende protein, som inneholder tre signatursekvensmotiver: 52-aminosyre chromodomain befinner seg i samme heterochromatin protein HP- 1 og homeotiske tran repressor Polycomb, den SNF2 /SWI2 ATPase domenet, og motivene karakteristiske av mindre-spor DNA bindende proteiner [28], [29]. Interessant er det CHD1 kromatin ombygging protein som er kjent for spesifikt å binde til det metylerte lysin-4 rest av histon H3, som er et kjennetegn på aktiv transkripsjon. Det antas at de menneskelige CHD1 chromodomains er ansvarlig for anerkjennelse og samhandling med histone metylering merkene [30]. Gitt at hPaf1 /PD2 regulert histone metylering ved H3K4 rest undersøkte vi CHD1 regulering av hPaf1 av forbigående knockdown av hPaf1 /PD2 i kreft i bukspyttkjertelen celler og analysert variasjonen i nivåene av CHD1 protein. Western blot-analyse sammen med tilsvarende data som er gitt nedenfor kvantifisering immunoblotting figurene (fig. 3A) viser at knockdown av hPaf1 /PD2 i kreft i bukspyttkjertelen celler fører til en reduksjon i nivået av CHD1 i forhold til de kodede kontrollcellene. Nedregulering av CHD1 som en effekt av PD2 knockdown ble ytterligere bekreftet i de samme cellelinjer ved hjelp av en annen siRNA basseng mot PD2 (fig. S3). For å validere denne effekten, ble immunfluorescens-mikroskopi benyttet. I samsvar med de biokjemiske data, viste immunfluorescens analysen at CHD1 nivået er redusert i hPaf1 /PD2 knockdown Panc1 og MiaPaCa celler i forhold til egge MiaPaCa eller Panc1 celler (fig. 3B). Kvantitativ real-time PCR-analyse viser videre at sammen med PD2 mRNA, er det også en reduksjon i CHD1 mRNA-nivå i PD2 siRNA behandlede Panc1 celler, noe som indikerer at hPaf1 regulerer CHD1 uttrykk både på transkripsjons- og translasjons-nivåer (fig. S1A). Samtidig overekspresjon av PD2 i HPAF /CD18 bukspyttkjertelen kreftceller oppregulerer også CHD1 uttrykk (Fig. S1B). Disse resultatene indikerer at hPaf1 /PD2 regulerer ekspresjonen av kromatin remodeling proteinet CHD1, noe som tyder på en mulig rolle i omleiring av den kromatinstruktur under transkripsjon forlengelse i kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) Western blot-analyse viser en redusert nivå av den CHD1 proteinet i PC-celler ved RNAi mediert hPaf1 /PD2 inhibering. β-actin fungert som en lasting kontroll. Grafen under hver western blot Figuren representerer de tilsvarende resultater for kvantifisering individuelle cellelinjer. (B) Immunofluorescensanalyse viser et redusert hPaf1 /PD2 nivå (grønt) sammen med en tilsvarende reduksjon i CHD1 nivå (rød) i PD2 siRNA behandlet PC celler i forhold til egge siRNA behandlede celler.
hPaf1 /PD2 samhandler med CHD1 i både cytoplasma og kjernen av kreft i bukspyttkjertelen celler
Chromatin ombygging protein CHD1 er kjent for å samhandle med transkripsjonsforlengelsesfaktorer og lokalisere aktivt transkriberte gener [31]. I gjær, CHD1 funksjoner under transkripsjon forlengelse gjennom samhandling med forlengelses faktorer, Spt4-Spt5 og Spt16-Pob3. Interessant er CHD1 også funnet å samhandle med Rtf1 subenhet av gjær PAF kompleks som knytter sammen med RNA-polymerase II og regulerer transkripsjon tøyelighet [31]. Selv om Rtf1 er til stede hos mennesker, er det ikke som en del av den hPAF komplekset. Derfor, testet vi muligheten for at hPaf1 /PD2-subenheten av den humane PAF-komplekset reagerer med CHD1 ved hjelp av co-immunoutfellingsstudier. Western blot-analyse av co-immunopresipitatene viser at PD2 samvirker med CHD1 i både cytoplasma, så vel som kjernefysiske ekstrakter av kreft i bukspyttkjertelen celler, Panc1 og MiaPaCa (fig. 4). Vi videre analysert samspillet mellom PD2 og CHD1 ved samlokalisering studier med konfokalmikroskopi (Fig. 5A). Den CHD1 farging (rød) ble funnet å overlappe med PD2 farging (grønn), både i cytoplasma og i kjernen av kreft i bukspyttkjertelen celler i bekreftelser med de biokjemiske data. Disse resultatene tyder på at PD2 og CHD1 samhandle og videre delta i kromatinstruktur ombygging i bukspyttkjertelkreft.
(A) Cytoplasmatisk og kjerneekstrakt fraksjonering ble utført i Panc1 og MiaPaCa kreft i bukspyttkjertelen celler, etterfulgt av gjensidige ko-immunpresipitering av endogen proteiner i cellefraksjoner. Western blot analyse viser at hPaf1 /PD2 samhandler med CHD1 både cytoplasmatiske og kjernefysiske ekstrakter av Panc1 og MiaPaCa bukspyttkjertelen kreftceller. Anti-PD2 immunoutfellinger fra ekstrakter av Panc1 og MiaPaCa celler ble immunoblottet med et anti-CHD1 antistoff. På samme måte ble anti-CHD1 utfellinger blottet med anti-PD2 antistoff. Kanin IgG ble brukt som kontroll.
(A) Panc1 og MiaPaCa celler ble transfektert med egge og PD2 RNAi oligos og 48 timer etter transfeksjon immunfluorescens analyse ble utført. Confocal bilder viser at det er redusert lokalisering av CHD1 i kjernen (blå, farget med DAPI) av PD2 KD bukspyttkjertelen kreftceller (midten panel) sammenlignet med egge celler (øverste panel). Celler ble ytterligere retransfected med pBABE-hygro PD2 konstruere for ektopisk uttrykk for PD2, 72 timer etter intital transfeksjon. Confocal bilder illustrere tillegg av eksogene PD2 reshuttles CHD1 tilbake til kjernen (nederst panel). Det innfelte representerer PD2 og CHD1 lokalisering i kjernen (farget med DAPI).
