Abstract
Det var studier som undersøker effekten av bredbånd infrarød stråling (IR) på kreftcelle, mens påvirkninger av middel infrarød stråling (MIR) er fortsatt ukjent. I denne studien ble en MIR emitter med utslipp bølgelengde band i 3-5 mikrometer regionen utviklet for å bestråle A549 lunge adenokarcinomceller. Det ble funnet at MIR eksponering hemmet celleproliferasjon og indusert morfologiske endringer ved å endre den cellulære fordelingen av cytoskeletal komponenter. Ved hjelp av kvantitativ PCR, fant vi at MIR fremmet uttrykket nivåer av ATM (ataxia telangiectasia mutert), ATR (ataksi-telangiectasia og Rad3 relatert og Rad3-relatert), TP53 (tumor protein p53), p21 (CDKN1A, cyclin-avhengig kinase inhibitor 1A) og GADD45 (vekststans og DNA-skade induserbar), men reduserte uttrykket nivåer av cyclin B kodende gener, CCNB1 og CCNB2, så vel som CDK1 (Cyclin-avhengig kinase 1). Reduksjonen av protein ekspresjonsnivåer av CDC25C, cyklin B1 og fosforylering av CDK1 ved Thr-161 til sammen antyder G
2 /M rest forekom i A549-celler ved MIR. DNA-reparasjon foci dannelsen av DNA dobbel-tråd pauser (DSB) markør γ-H2AX og sensor 53BP1 ble indusert av MIR behandling, innebærer det at MIR indusert G
2 /M cellesyklus arrest resulterte fra DSB. Denne studien viser en mulig rolle for bruk av MIR i lungekreft terapi ved å initiere DSB og blokkerer cellesyklusprogresjon
Citation. Chang HY, Shih MH, Huang HC, Tsai SR, Juan HF, Lee SC ( 2013) Middle infrarød stråling induserer G
2 /M cellesyklus arrest i A549 lungekreft celler. PLoS ONE 8 (1): e54117. doi: 10,1371 /journal.pone.0054117
Redaktør: Jasti Rao, University of Illinois College of Medicine, USA
mottatt: 9. september 2012; Godkjent: 06.12.2012; Publisert: 15 januar 2013
Copyright: © 2013 Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Council, Taiwan (NSC 100-2120-M-002-014, NSC 99-2621-B-002-005-My3, NSC 99-2621-B-010-001-My3) og National Taiwan Universitetet Cutting-Edge Steering Research Project (10R70602C3 og 101R4000). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Svulst er den viktigste dødsårsaken i verden, og lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall [1]. Som røyking vane avtar, har forekomsten av lungekreft forverret i mange land i henhold til [2]. Bortsett fra røyking, andre faktorer som for eksempel asbest, radon eller tungmetaller eksponeringer også bidra til lungekreft [3]. Statistikk data fra en 2008 International Agency for Research on Cancer (IARC) risikovurdering indikerer at lungekreft dreper om lag 1,4 millioner mennesker per år på verdensbasis [4]. På grunn av den høye forekomst og letalitet av lungekreft, er beslektet terapi utvikler seg å løse disse problemene.
Den elektromagnetiske stråling fra solstråling kan deles inn i flere regioner, inkludert γ-ray, røntgen, ultrafiolett (UV), synlig lys, infrarød (IR) stråling, mikrobølgeovn og radiobølger. Blant de solstråling, kan IR-lys med bølgelengder som strekker seg 0,76 til 1000 um deles i tre regioner, nær-infrarødt (NIR, 0,76 til 1,5 um), middels infrarødt (MIR, 1.5 til 5.6 um) og langt infrarød ( FIR, 5,6 til 1000 mikrometer). Anvendelser av IR har vært mye etablert i daglige bruk og kliniske formål, inkludert kutane mikrosirkulasjonen, sårheling, gass-sensorer, og ekstern temperaturmåling [5].
Tidligere studier har indikert at NIR utløste en retrograd mitokondrielle signalrespons resulterende ROS mediert matriksmetalloproteinase-1 (MMP-1) produksjon via mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) pathway [6]. Den viste også at NIR beskyttet menneskelig dermal fibroblast fra UV-indusert cytotoksisitet ved å fremkalle Hsp27 som hindrer apoptosome montering, en første tilfelle av apoptose [7], [8].
In vivo
studier viste at NIR økte den angiogene indus vaskulær endotelial vekstfaktor og reduserte den angiogene inhibitor thrombospondin-2, initiere dermal angiogenese i human hud [9]. Videre eksponering av FIR fremmes angiogenese i humane mikrovaskulære endotelceller sammen med aktivering av p38 og ekstracellulært signal regulert kinase signalering [10], forbedret blodsirkulasjon i hud [11], [12], og som virker anti-inflammatorisk aktivitet i vaskulært endotel [1. 3]. Det er også rapportert at FIR hemmet celleproliferasjon gjennom økt ekspresjon av cyklisk AMP-avhengig transkripsjonsfaktor (ATF) 3 i kreftceller som basal ekspresjon nivå av varmesjokkprotein (HSP) 70A var lav, [14], [15].
effektene av MIR på kreftceller, men er fortsatt ukjent. Denne studien hadde som mål å undersøke effektene av MIR med bølgelengdebåndet i 3-5 mikrometer regimer på de svært prolifererte kreftceller. For å oppnå dette, har vi utviklet en MIR emitter og begrenset MIR bølgelengde på 3 til 5 um. Siden molekyl C-H, kan N-H og O-H-bindinger eksiteres til å generere strekking vibrasjoner med 3-5 mikrometer infrarødt, er det forventet at den viktige biokjemiske reaksjon vil bli påvirket av bestråling av infrarøde med bølgelengde i dette området [16]. Vi viste at MIR redusert celle levedyktighet, forårsaket betydelige endringer i cytoskjelettet ordning, og indusert G
2 /M cellesyklus arrest som kan være bidratt ved induksjon av dobbelt-tråder pauser (DSB) i DNA langs ATM /ATR-p53 -p21 aksen.
Resultater
bølgelengde MIR ble Begrenset 3-5 mikrometer og temperaturen i dyrkingsmedium var konsekvent ved 37 ° C
den brede bånd black kilden ble fabrikert for å tilveiebringe bredbåndet MIR og satt i et metallkammer for å unngå forstyrrelser fra omgivelsene (figur 1). Med den økende oppvarmingstemperatur ble utslipp kraften av silikonsubstratet hevet tilsvarende. Den strålingsintensitet ble satt til 3 mW /cm
2 ved å justere varme temperaturen og måle omfanget av THORLAB PM100D strømmåleren. For å fjerne varmen virkningene av MIR, setter vi recycle kjøligere maskin ved 28 ° C for å kjøle luften i kammeret der gitt MIR kilden dermed opprettholde temperaturen i dyrkingsmedium ved 37 ° C. Anordningen av apparatet er vist i Figur 1B.
(A) den sideriss av bredbåndet kilde sort legeme. (B) Skjematisk diagram som viser oppsettet for MIR bestråling eksperiment. Cellene ble sådd ut på 12-brønners plater og dyrket i en inkubator med 100% fuktighet ved 37 ° C og med 5% CO
2.
celleproliferasjon til A549-celler forble uendret i MIR Exposed medium
å skille hvorvidt effektene av MIR forekommet direkte på dyrkede celler, eller indirekte via forandring av cellemediet, ble kulturmediet utsettes for MIR i 48 timer før tilsetning til cellekulturen. Etter at A549-celler (2 x 10
4 celler per brønn) ble sådd ut på en 12-brønns plate, substituert vi kulturmediet med MIR-eksponerte eller ueksponerte medium i ytterligere 48 timer, og deretter bestemmes cellenes levedyktighet ved MTT-analyse. Det ble observert at celleformering til A549-celler som ikke ble signifikant endret i henhold til MIR-eksponert medium sammenlignet med ikke-eksponerte medium (figur S1). Herfra har vi brukt en 48-timers periode av eksponering til cellene for alle eksperimenter med mindre annet er spesifisert.
MIR hemmet celleproliferasjon og endret morfologi til A549-celler
For å undersøke effekten av MIR på kreftceller, ble lunge adenokarsinomceller A549 anvendes for å vurdere cytotoksisitet av MIR og de normale lungefibroblaster MRC-5, ble testet for sammenligning. Celler (2 x 10
4) ble sådd ut i 12-brønners kulturplater over natten før MIR eksponering. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse og trypanblått-baserte celletelling etter MIR eksponering. Resultatene indikerte at proliferasjonen av A549-celler ble signifikant undertrykt av MIR eksponering i 48 timer (figur 2A), mens vekst og morfologi av MRC-5-celler ble ikke påvirket av MIR behandling (figur S2A, S2B). Interessant nok viste vi morfologiske endringer i A549 cellene ved MIR eksponering. Vi observerte at MIR-eksponerte A549 celler var mer avrundet i formen, forstørret i størrelse, og dannet en radial forkle under fase-kontrast mikroskopisk undersøkelse (figur 2B). Resultatene antyder at MIR kunne regulere cytoskjelett dynamikk som bestemmer cellens morfologi.
(A) Celle-tallene ble målt på 0, 24 og 48 timer etter eksponering MIR ved hjelp av Trypan blått og et hemocytometer. De gjennomsnittlige celle tall for kontroll (ueksponert) og MIR eksponerings behandlinger ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige forsøk. **
P
0,01. (B) Cell bildene ble observert av fasekontrastmikroskopi etter 48 timer MIR eksponering. Pilene viser de radiale forklær forstørret celler. Scale bar representerer 50 mikrometer.
MIR Eksponering Aktivert omorganiseringen av Actin filament, Vinculin og microtubule
cytoskjelettet spiller en viktig rolle i å regulere celleform [17], [18] , og begge aktin filamenter og mikrotubuli er kjent for å påvirke dannelse og fordeling av celle fokal adhesjon [17] som bestemmer cellemorfologi og motilitet. For å skille effekten av MIR på cytoskjelettet, utførte vi immunfluorescens-farging for å undersøke hvorvidt de to viktige komponenter av cytoskjelettet, aktin filamenter og mikrotubuler, så vel som det sentrale adhesjonsmolekylet vinculin involvert i denne morfologisk forandring. Resultatene viste at MIR induserte en signifikant nedgang i F-aktin inneholdende spennings fibre som bestemt ved farging med rhodamin-merkede phalloidin (figur 3). Videre er actinfilamenter oppviste en tett nettvare av upolarisert ordningen og vinculin ble samlet rundt cellen periferien i MIR-eksponerte celler (figur 3), noe som tyder på at MIR kan hemme cellemigrering ved å regulere omorganisering av aktin filamenter og fordeling av vinculin [ ,,,0],19]. På den annen side ble mikrotubuli fordelt på perinukleære cytoplasmatiske regioner etter MIR behandling (figur 4). Denne spesifikke fordelingen av uregelmessige mikrotubul-fragmenter tyder på at MIR kan forårsake G
2 /M cellesyklus-stans som tidligere demonstrert [20], [21].
Cellene ble sådd ut på dekkglass i 12-brønners plater , utsatt for MIR i 48 timer, fiksert for farging og visualisert ved fluorescens mikroskopi. Aktin filamenter ble merket med rhodamin-merkede phalloidin (rød), ble vinculin merket med mus anti-vinculin antistoff og den tilsvarende FITC- konjugert sekundært anti-muse-IgG-antistoff (grønn), og kjerner ble farvet med DAPI (blå). Scale bar representerer 10 mikrometer. Pilene angir posisjonen vinculin.
Celler ble sådd på dekkglass i 12-brønners plater, utsatt for MIR i 48 timer, fast for flekker og visualisert ved fluorescens mikroskopi. Mikrotubuli ble merket med α-tubulin-antistoff og den tilsvarende FITC-konjugert sekundært antistoff (grønn), og kjerner ble merket med DAPI (blå). Scale bar representerer 10 mikrometer.
MIR Eksponering regulert mRNA uttrykk Nivå G
2 /M regulerte gener i A549-celler
Siden fordelingen av cytoskjelettet innebærer en mulig rolle av MIR ved regulering av cellesyklusutvikling, er det viktig å undersøke ekspresjon av gener som er involvert i G
2-M overgang ble videre valgt for å bli validert. G
2 /M cellesyklus sjekkpunkt reagerer på DNA skade og involverer aktivering av ataksi-telangiectasia mutert (ATM) og ataksi-telangiectasia og Rad3-relaterte (ATR) proteiner [22]. Både ATM og ATR aktiverer p53 ved fosforylering av Ser15 i respons til DNA-skade, og dermed øke transkripsjonen av vekststans og DNA-skade induserbar genet (GADD45) og p21, som er nødvendig for å hemme ekspresjon av de viktige regulatorer av G
2 /M overgang, cyklin-avhengig kinase 1 (CDK1) og cyclin B [23], [24], [25], [26]. Uttrykket av gener som er involvert i å indusere G
2 /M arrest ble økt i MIR-behandlede A549 celler, inkludert ATM, ATR, p53, GADD45A, GADD45B, og p21 (figur 5A). I motsetning til dette, ble mRNA ekspresjonsnivåer av CDK1, CCNB1 og CCNB2 sank etter MIR eksponering (figur 5A). Resultatene viser at MIR eksponering aktiverer uttrykk for ATM, ATR, p53 og p21-gener i respons til DNA-skade, og regulerer genene til å styre G
2 /M cellesyklusprogresjon.
Celler ble eksponert til MIR i 48 timer, og høstet for RNA og protein utvinning. (A) Gene ekspresjon av gener som er involvert i reguleringen av G
2 /M overgang (x-aksen). Y-aksen indikerer de relative transkripsjons mengdene beregnet ved hjelp av metoden med ΔΔCt GAPDH som referanse-genet amplifisert fra hver prøve. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. (
n
= 3). *
P
0,05, **
P
0,001. (B) Protein uttrykk nivåer ble undersøkt med Western blot med aktin som den interne kontrollen. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger. (C) Strømningscytometrisk analyse av DNA-innhold. Celler ble utsatt for MIR i 48 timer. Celler fra seks uavhengige eksperimenter ble samlet for å analysere cellesyklus distribusjon. (D) Prosentandelen av celler i hver fase ble oppnådd ved multicycle analyse.
MIR Eksponering Avskaffet Uttrykk for Cdc25C og Cyclin B1, og redusert Fosforylering av CDK1
Celle syklusprogresjon fra G
2 til M fase er regulert av aktivering av CDK1, hvis virksomhet er avhengig av samordning med cyclin B [27], [28]. Aktiveringen av CDK1 /Cyclin B-komplekset blir opprettholdt gjennom fosforylering ved Thr161 og defosforylering ved Thr14 og Tyr15 av CDK1 [27], [28]. Defosforylering av Thr14 og Tyr15 rester i CDK1 katalyseres av fosfatase Cdc25C. Det er tenkt som en hastighetsbegrensende trinn for G
2 inntreden i mitose [27], [29]. Tatt i betraktning den rolle CDK1 /Cyclin B kompleks og Cdc25C i å regulere G
2 til M faseovergang, vurderte vi hvorvidt MIR eksponering endret protein ekspresjon av CDK1, cyklin B1, og Cdc25C, samt fosforyleringen av CDK1. Resultatene viste at fosforyleringen av CDK1 protein ved Thr161 og nivåene av cyklin B1 og Cdc25C ble alle redusert i celler behandlet med MIR (figur 5B). Det indikerer at MIR eksponering induserte en typisk G
2 /M cellesyklus arrest i A549 celler ved å regulere cyclin B1 og Cdc25C uttrykk, og CDK1 fosforylering.
MIR Eksponering Resulterte i cellesyklus arrest på G
2 /M fase
Vi neste undersøkt om cellesyklus distribusjon av A549 ble påvirket av MIR bestråling. For å få DNA-innhold, utførte vi flowcytometri å analysere PI-merket celler. Resultatene viste at cellene i G
2 /M populasjonen ble øket i henhold MIR eksponering. Koordinert, G
2 /M regulatorer ble begge aktivert i sine transkripsjonen, translasjonelle og post-translasjonelle nivåer, noe som fører til akkumulering av celler i G
2 /M-fasen.
MIR Eksponering utløst colocalization av 53BP1 og γ-H2AX Nuclear Foci i Response til reaktive oksygen arter (ROS) Mediert DNA Damage
Siden MIR aktivert ATM /ATR-p53-p21 akse som er DNA-skade sjekkpunkt vei, er det avgjørende å undersøke om MIR forårsaket DNA-skade i A549 celler. Tidligere studier har vist at p53 tumor suppressor-bindende protein (53BP1) og γ-H2AX delta i ATM-avhengig DNA-skade-signalveien og danne foci som respons på ioniserende stråling forårsaket skade på DNA [30], [31]. For å undersøke dette ble A549 cellene fiksert med aceton og farget for 53BP1 og γ-H2AX etter MIR eksponering. Vi viste at 53BP1 (figur S3A) og γ-H2AX (figur S3b) ble dispersedly lokalisert i kjernen av ueksponerte celler, men dannet en rekke fremstående subnuclear foci som reaksjon på MIR. Vi viste også at 53BP1 og γ-H2AX foci ble colocalized i nucei av MIR utsatt celler. Dannelsen og colocalization av 53BP1 /γ-H2AX foci ble redusert ved forbehandling eller cotreatment av 10 mM ROS oppfanger NAC (figur 6). Vi kan postulere at MIR indusert G
2 /M cellesyklus-stans kan resultere fra ROS-mediert DNA-skade som skaden markørene 53BP1 og y-H2AX foci ble observert i denne studien.
Cellene ble sådd ut på glass dekkglass i 12-brønns plate, eksponering av MIR i 48 timer i nærvær eller fravær av 10 mM N-acetyl-cystein (NAC). Cellene ble behandlet med NAC for 1 time før MIR eksponering (NAC 1 h) eller cotreated hele eksponering i 48 timer (NAC). Celler ble fiksert for farging og visualisert ved fluorescens mikroskopi. 53BP1 ble merket med kanin-anti-53BP1 antistoff og samsvarer med FITC-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff (grønn), γ-H2AX ble merket med mus anti-γ-H2AX antistoff følgende samsvarer med PE-konjugert anti-muse-IgG-antistoff (rød), og kjerner ble merket med DAPI (blå). Scale bar representerer 10 mikrometer.
Diskusjoner
Fordi de molekylære endringer som er involvert i regulering av cellesyklusprogresjon er ledsaget av en unnlatelse av å arrestere spredning i kreftceller, hemming av celleproliferasjon ved å forstyrre med cellesyklus er en lovende metode for anticancerterapi. I denne studien ble det observert at MIR eksponering kan inhibere proliferasjonen av A549-celler (figur 2A), og også føre til en større målestokk, radial skillevegg og avrundet form cellemorfologi (figur 2B) ved å påvirke anordningen og fordelingen av aktin filamenter (figur 3), fokal adhesjon (figur 3), og mikrotubuli (figur 4). Den perinukleært fragmentert fordeling av mikrotubuli er i overensstemmelse med den cellemorfologi observert under G
2 /M cellesyklusstans, noe som ble ytterligere bekreftet ved å analysere cellesyklusfordeling, genekspresjon og protein regulering av regulatorer av den G
2 /M sjekkpunktet (figur 5). I avansert, vi også vist at MIR kan indusere dannelsen av og colocalization 53BP1 og γ-H2AX atom foci (figur 6) som svar på DNA-skade som vanligvis aktiverer ATM /ATR-p53-p21 veien resulterer G
2 /M celle syklus-stans.
MIR er den del av lyset fra solstråling som kan føre til DNA-skade ved direkte eksitering av DNA eller indirekte mekanisme som innebærer eksitering av andre cellulære kromoforer [32]. Den direkte eksitasjon prosessen er forårsaket av kortbølget stråling, for eksempel UVB (280-315 nm) og UVC (100-280 nm), og for det meste fører til å generere cyklobutan pyrimidin-dimerer og fotoprodukter, som er produsert ved absorpsjon av stråling ved DNA [32 ]. På den annen side er den indirekte mekanisme bidro med reaktive oksygenarter (ROS) som er generert av endogene fotosensibiliserende. Den indirekte DNA-skade er forårsaket av lengre bølgelengden over 320 nm, slik som UVA (315-400 nm) og nær-synlig lys, ved hvilken DNA-absorberer bare svakt [33], [34]. Stråling med lengre bølgelengde og dermed absorberes av fotosensibiliserende midler for å generere ROS. Etter UVA-lys absorpsjon, endogen fotosensibiliserende krysse over til en triplet staten og overføre energi til å generere singlet oksygen [35]. Disse UVA bestrålt fotosensibiliserende inkluderer flavins [36], NADH /NADPH [37], urocanic syre [38] og noen steroler [39]. På grunn av den korte halverings tid i cellene, er det singlet oksygen bare til stede etter bestråling [40]. Imidlertid kan ROS bli presentert i en lengre periode etter stråling siden den ekstra ROS kan fremstilles ved innledende arter [41]. Den superoxide anion radikal (
• O
2
-), hydrogenperoksid (H
2o
2), og hydroksyl-radikalet (
• OH) er tilhørte ROS gruppe, som alle kan bli generert av endogen mekanisme som biprodukter av normal mitokondriell aktivitet eller eksogent spenning [42].
Når det eksogene spenning indusert ROS nivå er dramatisk høyere enn cellen kan eliminere, oppstår oksidativt stress og fører til oksidativ DNA-skade etter DNA-protein tverrbindes, base og sukker modifikasjon, depurinering eller deprimidination [43], [44], [45], [46], [47]. Den oksidative DNA-skader indusert av ROS kan utløse cellesyklus sjekkpunkt reaksjoner inkludert rekruttering av 53BP1 og γ-H2AX fulgt av nedbrytning av CDC25C for G
2 /M arrest som vi har observert, og dermed gir ekstra tid for DNA-reparasjon [48], [49]. Videre NIR har blitt funnet å generere ROS avledet fra mitokondrier, og cytokrom
c
oksidase er blitt foreslått som en mulig fotoreseptoren [6], [50]. Bevisene tyder på at IR kan akselerere oksidativ fosforylering reaksjon i mitokondriene ved å bestråle fotoreseptorer som cytokrom c oxidatse og NADH. Den forbedrede hastigheten på oksidativ fosforylering genererer høyere ROS bidrar dermed til indirekte skader i DNA.
I denne studien fant vi at MIR eksponering undertrykte proteiner nivå CDC25C og cyclin B1, og hemmet fosforylering av CDK1. Nedregulering av CDC25C ville blokkere aktiveringen av CDK1, noe som resulterer i dissosiering av cyklin B1 og forebyggelse av cellesyklusutvikling i G
2 til M-fasen. Videre viste vi at 53BP1 andγ-H2AX danne mange subnuclear foci som svar på MIR behandling. 53BP1 tar del i ATM-avhengig DNA-skade-signalveien og danner atom foci som respons på ioniserende stråling forårsaket skade på DNA [30], [31], mens γ-H2AX letter rekrutteringen av et antall skaderespons proteiner, såsom BRCA1, MDC1 og RAD51 for DNA reparasjon [51], [52]. Det er mulig at MIR eksponering indusert G
2 /M rest er forårsaket av DNA-skade, selv om bølgelengden til MIR er nær NIR som er vanskelig å forårsake direkte skader i DNA. Her, postulerer vi at MIR eksponering kan absorberes av fotosensibilisatoren endogen således heve ROS og forårsake oksidativ DNA-skade.
Tidligere studier viste at hydrogenperoksyd-indusert G
2 /M cellesyklus-stans og påvirket organisering av mikrotubuler og aktin filamenter relé på kapasiteten for å redusere de oksyderte cytoskjelett proteiner eller balanse av tiol avbrudd [51], [52], [53]. Hydrogenperoksid økt monomere tubulin, men reduserte den polymeriserte tubulin tyder hydrogen peroxide forårsaket depolymerization av mikrotubuli. I denne studien, forårsaket MIR eksponering perinukleær distribusjon og tett aggregering av mikrotubuli og dermed redusere mikrotubulidynamikk nettverk. Denne observasjonen er lik mikrotubulidynamikk rettet mot narkotika, for eksempel Vinkaalkaloider [54]. Den perinukleær fordeling av mikrotubuli innebærer at MIR eksponering kan forårsake oksidativt stress og dermed forstyrrende mikrotubuli nettverkene.
I denne studien fant vi at MIR eksponering indusert DNA skade respons. Tidligere studier viste at γ-H2AX foci ble funnet å være colocalized med reparasjons proteiner involvert i homologi rekombinasjon og nonhomologousend-sammenføyning (NHEJ) [55]. Øvrige reparasjons- proteiner, inkludert MCD1 /NFBD1 og 53BP1, ble også dokumentert å samhandle med γ-H2AX å danne atom foci [56]. Tidligere rapporter viser at konformasjonsendringer i 53BP1 er forårsaket av fosforylering av 53BP1 via minibank og dermed utsette den kromatin-bindende domene som deltar direkte i reparasjon av DNA DSB sin ved å aktivere DNA ligase IV /Xrcc4 kompleks i NHEJ vei [57]. I denne studien fant vi at MIR eksponering dannet atom foci av 53BP1 og γ-H2AX (figur 6) innebærer at MIR eksponering indusere DNA-reparasjon i respons til DAN skade.
I sammendraget, denne studien utstillingen MIR av bølgelengde på 3-5 um kan endre organiseringen av aktin filament, mikrotubulus og vinculin, og føre til inhibering av cellesyklusprogresjon ved å aktivere ATM /ATR-p53-p21 akse i respons til DNA-skade, også den Cdc25C regulere reaksjonsveien parallelt dermed resulterer i nedregulering av defosforylering i CDK1 og cyclin B. spesielt viser vår studie det første beviset på den hemmende effekten av MIR i lungekreftceller og gir nyttig informasjon for kreftbehandling.
Materialer og Metoder
Middle infrarød stråling (MIR) Emitter
bølgelengde på MIR generert fra brede bånd black kilde var begrenset i området mellom 3-5 mikrometer ved hjelp av en 3-5 mikrometer band pass safir wafer (SingHuang Technology Co., Ltd., Taipei, Taiwan) (figur 1A). Den brede båndpassfilter er designet for å isolere 3-5 um atmosfæriske vinduer med en diameter på 25,4 mm ± 0,1%. Den 50% kutt på /avskåret sendepunkter ble satt til 3,0 mikrometer ± 4% og 5,0 mikrometer ± 4%, henholdsvis. Filteret oppviste gjennomsnittlige transmisjon i passbåndet høyere enn 60% og mindre enn 0,1% transmisjonsnivåer utenfor passbåndet. En 300 nm tykk molybdenfilm ble avsatt ved plasmaavsetning på baksiden av en n-type silisiumsubstrat som en oppvarmingskilde (figur 1A). Den strålingsintensitet ble målt ved THORLAB PM100D strømmåleren til å være 3 mW /cm
2. For å opprettholde cellekulturen temperatur, resirkulere kjøler maskinen ble satt til å opprettholde temperaturen i kulturmedium ved 37 ° C som vist i figur 1B. Celler seeded på 12 brønners vevskulturplater (Corning Costar, Corning, NY, USA) før 24 timer av IR eksponering ble plassert på filteret som vist i figur 1B.
Cell Culture
Menneske lunge epitelceller A549 (ATCC, CCL-185) og human føtal lunge fibroblast celler MRC5 (ATCC, CCL-171) ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). De A549-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Biological Industries, Beit HaEmek, Israel). MRC5-celler ble dyrket i Minimum Essential Medium (Gibco) supplementert med 1 mM natriumpyruvat (Gibco), 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer (Gibco) og 10% føtalt bovint serum (Gibco). Begge cellelinjene var fri for mykoplasma som detektert ved PCR-basert fremgangsmåte og dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2.
Immunofluorescence Farging
A549-celler ble sådd på glass dekkglass i 12-brønns kulturplate, dyrket i en dag, og eksponert ved MIR eller dyrket i mørket i ytterligere 48 timer. Celler ble fiksert og permeabilisert med forkjølings aceton i 5 minutter ved -20 ° C og deretter inkubert med 1% BSA (Bioshop, Burlington, ON, Canada) i PBS som blokkeringsbuffer i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble cellene merket med muse-monoklonalt anti-tubulin-antistoff (Millipore, Billerica, MA, USA; 1:1000), muse-monoklonalt anti-vinculin antistoff (Millipore; 1:200), kanin-polyklonalt anti-53BP1 antistoff (GeneTex, San Antonio, TX, USA; 1:500), eller mus anti-γ-H2AX antistoff (Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:500) ved 4
oC over natten. Etter å ha vasket med PBST (PBS inneholdende 0,05% Tween-20, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) tre ganger, ble cellene merket med tilsvarende sekundære anti-mus-IgG-Alexa 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA; 1:1000 ), anti-muse-IgG-PE (Abcam; 1:1000), eller sekundær anti-kanin FITC-IgG (Millipore; 1:200) i 1 time i mørke ved romtemperatur. Celler merket med anti-vinculin ble telleren farget med TRITC-konjugert Phalloidin (Millipore; 1:1000) i 15 min i mørket ved romtemperatur. Cellene ble deretter vasket med PBST tre ganger og montert med ProLong® gull-reagens med DAPI (Invitrogen). Bilder ble kjøpt opp av fluorescens mikroskop med Leica HCX FL PLAN 100 × /1.25 olje objektiv du bruker en SPOT kamera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA) og SPOT Avansert programvare (Diagnostic Instruments).
celleviabilitet Assay
2 × 10
4-celler ble sådd på 12-brønners plater per brønn og lov til å feste natten før MIR eksponering. MTT-pulver (3 [4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid, Sigma-Aldrich) ble fremstilt som lager i PBS ved en konsentrasjon på 5 mg /ml og filtrert. Etter eksponert ved MIR i 48 timer ble 150 ul MTT-løsning tilsatt til hver brønn. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 3 timer inntil den bryter krystall dannet. Formazankrystaller ble oppløst i 500 ul dimetylsulfoksid (DMSO, Scharlau Chemie, Barcelona, Spania) og agitert unngått mot lys i 15 minutter for fullstendig å oppløse krystallene. Absorbansen ble målt ved 570 nm på en ELISA-leser (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). Alle forsøk ble gjentatt tre ganger.
RNA Utvinning og revers transkripsjon
Total RNA ble isolert ved hjelp TRIzol reagens (Invotrogen) etter 48-timers eksponering. I korte trekk, ble 400 ul TRIzol reagens (Invitrogen) tilsatt til hver brønn av 12-brønns plate TC når mediet ble fjernet. Prøvene ble samlet inn fra tre uavhengige eksperimenter og lagret ved
oC -80. RNA ekstraksjon ble utført i henhold til bruksanvisningen, og RNA konsentrasjon og kvalitet ble bestemt av Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies, Montchanin, DE, USA). mRNA ble reverstranscripted av RevertAid ™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA). 1 pg av total RNA ble blandet oligo (dT)
18 primer og denaturert. Deretter ble RNA prøven blandet med 5x reaksjonsbuffer, dNTP, RiboLock ™ RNase Inhibitor, og RevertAid ™ H Minus revers transkriptase. Revers transkripsjonsreaksjon ble utført ved 42
° C i 60 minutter og avsluttet ved
° C 70 ° C i 5 min. Revers transkripsjon Produktet ble brukt direkte i PCR forsterkning eller oppbevares ved
oC -20.
Real Time PCR
De gen-spesifikke primere for sanntids PCR ble designet av Beacon Designer 7 program (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA) og sekvensene er oppført i Tabell 1. real-time kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn Supermix (BIO-RAD, Hercules, CA) for 40 amplifiseringscykluser i en iCycler iQ5 ™ real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories). Relative transkripsjon mengder ble beregnet ved anvendelse av ΔΔCt (terskelsyklus) Fremgangsmåte med GAPDH som referanse-genet amplifisert fra prøvene. Alle reaksjoner ble kjørt i tre eksemplarer.
Protein Extraction og Western blotting
Etter MIR eksponering i 48 timer, ble totalt protein ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen) etter produsentens anvisninger. Protein ble løst i lyseringsbuffer (7 M urea (Boehringer, Mannheim, Tyskland), 2 M tiourea, 4% CHAPS (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) og 0,002% bromfenolblått (Amersco, Solon, OH, USA)) og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-metoden (Pierce bioteknologi Inc, Rockford, IL, USA).
