Abstract
I pattedyr, døgnrytmen sentrale generator består av interaksjoner mellom klokkegener, inkludert
Per1 /2/3
,
Cry1 /2
,
Bmal1
, og
Klokke
. Døgnrytme forstyrrelser kan føre til økt risiko for kreft hos mennesker, og deregulering av klokkegener har vært innblandet i mange typer kreft. Blant disse genene,
Per2
er rapportert å ha tumor suppressor egenskaper, men lite er kjent om sammenhengen mellom
Per2 Hotell og HIF, som er det viktigste målet for nyrecellekreft (RCC) terapi . I denne studien, den rytmiske uttrykk for
Per2
genet var ikke påvises i nyrekreftcellelinjer, med unntak av Caki-2 celler. Økte HIF1α i Caki-2 celler amplitude
Per2
oscillasjon ved direkte binding til HIF-bindingssetet ligger på
Per2
promoter. Disse resultatene indikerer at HIF1α kan øke amplitude av
Per2
døgnrytme
Citation. Okabe T, Kumagai M, Nakajima Y, Shirotake S, Kodaira K, Oyama M, et al. (2014) Virkningen av HIF1α på
Per2
døgnrytmen i nyre kreft cellelinjer. PLoS ONE 9 (10): e109693. doi: 10,1371 /journal.pone.0109693
Redaktør: Shin Yamazaki, University of Texas Southwestern Medical Center, USA
mottatt: 9 januar 2014; Godkjent: 12 september 2014; Publisert: 21 oktober 2014
Copyright: © 2014 Okabe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nyrecellekarsinom (RCC) er den vanligste malignitet av den voksne nyre, som står for ca 2% av krefttilfellene i verden [1]. En somatisk mutasjon av Von Hippel-Lindau (
VHL
) genet er den hyppigste genetiske endringen observert i RCC [2], og siste innsats har målrettet VHL-hypoksi induserbar faktor (HIF) -mediert hypoksi- induserte genet vei for RCC terapi [3]. HIFs er heterodimere transkripsjonsfaktorer med to strukturelt beslektede subenheter: en oksygen-sensitive HIFα subenhet og en konstitutivt uttrykt HIFß eller aryl hydrokarbon reseptor atom Translocator (ARNT) subenhet [4]. I normoxia, er HIFα molekyler utsettes for en reguleringsprosess som involverer enzymatisk hydroksylering av konservert Prolyl- og asparaginylrester, som fører til rask VHL protein-mediert ubiquitinering og proteasomal degradering [5]. Hypoksi eller mutasjoner i
VHL
genet inaktiverer denne veien. Økt HIFα aktivitet oppregulerer gener involvert i mange aspekter av kreft progresjon, inkludert metabolsk tilpasning, apoptotisk motstand, og angiogenese [3]. I RCC, kan intens tumor vaskulære nettverk tilskrives upassende opphopning av HIFα fører til angiogenic genet induksjon. Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er en av de mest potente pro-angiogene faktorer, som uttrykk transactivated av HIF1α /ARNT gjennom binding til hypoksi-responselement (HRE) i
VEGF
promoter [6] , [7]. Øket ekspresjon av VEGF er også forbundet med ondartet progresjon og en dårlig behandlingsresultat [8]. Derfor undertrykke HIF-mediert reaksjonsvei-gen kan være et viktig terapeutisk strategi for behandling av RCC [3].
Mange fysiologiske, biokjemiske og atferdsmessige prosesser er under circadian regulering, som er generert av en intern tids -keeping mekanisme referert til som den biologiske klokken i nesten alle organismer fra bakterier til pattedyr [9], [10]. Døgnrytme er styrt av genetisk bestemt nettverk av transkripsjon-oversettelse feedbacksløyfer som involverer klokkegener, inkludert
Per1 /2/3
,
Cry 1/2
,
Bmal1
, og
Klokke product: [11]. Et felles tema underliggende circadian rhythmicity er at svingninger av klokke genet transkripsjoner er konsekvensen av intracellulære transkripsjons-translasjonell feedback loops. For eksempel, i pattedyr, det transkripsjonsfaktorer KLOKKE og BMAL1 heterodimerize og aktivere uttrykk for tre
Per
gener og to
Cry
gener ved å binde seg til E-box elementer i sine arrangører. Protein produkter av disse genene multimerize og translocate til kjernen, hvor Per og gråte proteiner undertrykke transkripsjonen aktivitet av KLOKKE-BMAL1 dimer [12], [13].
Blant disse klokkegener,
Per2
er ansvarlig for å sette den perioden av pendling [14]. Videre
Per2
har tumor-suppressor egenskaper og er ofte mutert eller nedregulert i menneskelige brystkreft [15], [16]. I nyrekreft, endret uttrykk for
Per2
genet er angivelig involvert i sykdomsutbruddet og progresjon, men den molekylære mekanismen ansvarlig fortsatt uklart [17].
I denne studien målte vi nivåene av
Per2
promoter aktivitet og mRNA i åtte nyrekreft cellelinjer etter deksametason behandling.
Per2
promoter aktivitet og mRNA nivå svingte over en ca 24-timers syklus i Caki-2 celler, som inneholder BMAL1, klokke og HIF1α proteiner. Vi fant også at HIF1α økt amplitude for pendling ved direkte binding til HRE-lignende element ligger på
Per2
promoter. Disse resultatene viser at HIF1α kan påvirke amplitude av
Per2
døgnrytme i nyrekreftcellelinjer.
Materialer og metoder
Celler og cellekulturer, kjemikalier og enzymer
Etablerte humane RCC-cellelinjer (A704, ACHN, 786-O, A498, 769-P, og Caki-2) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). RCC4 + vektor alene og RCC4 + VHL ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). Disse nyrecellelinjer ble holdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium (Bio Kojin, Tokyo, Japan) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 24 U /ml penicillin , og 25 ug /ml streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA) i en standard fuktet inkubator ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2. Vi har også brukt mus fibroblast NIH3T3 og menneske osteosarkom U2OS cellemodeller av den autonome biologiske klokke [18], [19]. Disse cellelinjene ble også erholdt fra ATCC, og ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), supplert med 10% FBS, penicillin (24 U /ml) og streptomycin (25 ug /ml). Chrysin ble innkjøpt fra Sigma, og dens renhet oversteg 96%. En stamløsning av chrysin ble fremstilt i dimetylsulfoksyd (DMSO). Chrysin ble oppløst i DMSO ved tre forskjellige konsentrasjoner (1, 10 og 100 mM) og tilsatt hver 2 mL til 2 ml kulturmedium (sluttkonsentrasjon, 1, 10, 100 uM). Cellene ble behandlet med kultur medier som inneholder 1, 10, 100 mikrometer chrysin eller samme konsentrasjon av DMSO som kontroll i 2 timer.
Plasmid bygging
For å konstruere reporter vektorer som bærer den m
Per2
promoteren, m
Per2
promoter fragment (-279 til 112 bp, hvor 1 angir den antatte transkripsjonsstartsetet) ble polymerase kjedereaksjon (PCR) -amplified fra C57BL /6J mus genom og klonet inn i NheI /XhoI stedet pGL3 Basic (Promega, Madison, WI, USA). Firefly luciferase (Fluc) ble erstattet med
Nco
jeg og
Xba
jeg fragment av pSV40-dFLuc, noe som resulterer i m
Per2
-dFLuc. Den HRE-mutant m
Per2
promoter reporter ble generert med invers PCR ved hjelp av en KOD-Plus-mutagenese Kit (Toyobo, Osaka, Japan).
Real-time rapportering av circadian-regulert gen uttrykk ved hjelp av luciferase bioluminescence
Alle celler ble sådd (5 × 10
4 per parabol) i en 35-mm fatet 2 dager før transfeksjon, og reporteren plasmid ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Den passende mengden av reporter plasmid for hver cellelinje ble bestemt i henhold til forskjeller i transfeksjonseffektivitet blant cellelinjer. En dag etter transfeksjon ble cellene behandlet med 100 nM deksametason (Nakalai Tesque, Kyoto, Japan) i 2 timer, og ble mediet erstattet med medium i fravær av fenol rød supplert med 10% FBS og 100 mM D-luciferin (Toyobo ). Bioluminesens ble målt ved 37 ° C under en 5% CO
2 atmosfære og integrert i 1 minutt med mellomrom på 10 min ved hjelp av en tallerken-type luminometer, AB-2550 Kronos Dio (Atto, Tokyo, Japan) [20], [21]. Bioluminesens aktivitet ble uttrykt som relative lysenheter (RLU). Hvert eksperiment ble gjentatt minst fire ganger. Cellene ble dyrket i luminometer i minst 4 dager mens instrumentet telles deres bioluminescens. De oppnådde rå data (10 min urner) ble glattet av en 10-punkts glidende gjennomsnitt metoden og detrended ved å trekke en 12-timers glidende gjennomsnitt av de utjevnede data [21].
Analyse av døgnrytme hjelp bioluminesens
for å teste betydningen av circadian rhythmicity og å beregne circadian parametre (dvs. perioden, amplitude, og acrophase), vi utførte datastyrt dataanalyse i Cosinor programvare lastet ned fra døgnrytmen Laboratory (Walterboro, SC, USA) programvare hjemmesiden (https://www.circadian.org/software.html) [22], [23]. Biologiske parametre ble beregnet ved hjelp av data fra 1-5 dager etter deksametasonbehandling.
Automatisert bildeopptak og analyse
NIH3T3 celler ble sådd (5 × 10
4 per brønn) på 6- brønners plater 1 dag før transfeksjon, og uttrykket plasmid ble transfektert ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. En dag etter transfeksjon ble cellene behandlet med 100 nM deksametason (Nakalai Tesque) i 2 timer, og ble mediet erstattet med medium i fravær av fenol rød supplert med 10% FBS. Cellene ble farget med 0,1 mikrogram /ml Hoechst 33342 (Invitrogen) i 1 time og analysert ved hjelp av ArrayScan XTI (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).
Kvantifisering av mRNA ved real-time RT-PCR
Alle celler ble høstet ved 4-timers intervaller fra seks plater ved hvert tidspunkt begynner 24 timer etter behandling med deksametason. Total RNA fra disse cellene ble ekstrahert ved bruk av ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan) og revers transkribert.
Per2 Hotell og
GAPDH
transkripsjoner ble kvantifisert ved hjelp av en ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR ble utført ved anvendelse av ett trinn SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio, Kyoto, Japan) med følgende termisk sykling parametere: 94 ° C i 5 minutter etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 20 s og 62 ° C i 1 minutt.
GAPDH
avskrift ble brukt til å normalisere uttrykk for hver karakterutskrift. Circadian rhythmicity betydning ble analysert ved hjelp av Cosinor programvare (døgnrytme Laboratory) [22], [23]. Primere for hvert gen ble utformet basert på tilgjengelig informasjon fra National Center for Biotechnology Information (NCBI). PCR-primer sekvensene var som følger:
Per2 plakater (GenBank tiltredelse nei, NM_022817, fragment, 85 bp.): Følelse primer 5′-CACACACAGAAGGAGGAGCA-3 «og antisense primer 5» AGTAATGGCAGTGGGACTGG-3 «
GAPDH plakater (GenBank tiltredelse nei, M33197, fragment, 185 bp.). følelse primer 5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′ og antisense primer 5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3 «.
Luciferase assay
transfekterte NIH3T3 celler ble brukt for luciferase analyser. En dag før transfeksjon ble cellene sådd ut (5 x 10
4 per brønn) i 24-brønners plater som inneholdt DMEM supplert med 10% FBS, penicillin (24 U /ml) og streptomycin (25 ug /ml). -Celler ble transfektert ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). For hver prøve ble transfektert DNA tilsatt til hver brønn. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene vasket i fosfat-bufret saltvann (PBS) og avbrutt med 100 mL av passiv lyseringsbuffer (Promega). Luciferase aktivitet ble bestemt ved hjelp av en Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega) og en Ascent FS II luminometer (Thermo Scientific).
Western blotting
Alle celler ble synkronisert med 100 nM deksametason behandling for 2 timer. Deretter ble mediet erstattet med friskt medium. Etter 24-h inkubasjon ble disse cellene lysert i Cell Lytisk-MT (Sigma). Cellelysatene ble sentrifugert ved 15000 rpm ved 4 ° C i 10 min. Supernatantene ble lagret som fullcelle-ekstrakter ved -80 ° C inntil bruk. For Western blotting, ble 20- ug protein løst på 7,5% natriumdodecylsulfat polyakrylamid (SDS-PAA) geler og overført på en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranene ble blokkert med Tris-bufret saltvann (TBS)-Tween inneholdende 5% ikke-fett tørrmelk. Proteiner ble oppdaget ved hjelp av antistoffer mot HIF1α (fortynning 1: 500; BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), PER2 (fortynning, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), CRY1 (fortynning, 1:2000, Santa Cruz Biotechnology), klokke (fortynning, 1:1000; Thermo Scientific), GAPDH (fortynning, 1:10000, Sigma), og BMAL1 (fortynning, 1:100, mus monoklonalt antistoff generert i vår lab). Vi utførte fire gjenskape vestlige blotter; en representant blot er vist
ChIP analysen
chip eksperimenter ble utført med en kommersielt tilgjengelig kit i henhold til produsentens instruksjoner (Magna-chip; Millipore, Bedford, MA, USA).. Kort fortalt ble Caki-2 celler belagt i diameter retter 100 mm (5 × 10
4 celler per parabol); etter 24 timer ble cellene inkubert med formaldehyd (sluttkonsentrasjon 1%) i 10 minutter ved 37 ° C for å kryssbinde proteiner til DNA. Ureagert formaldehyd ble stanset med 1 ml 10 x glycin. Platen ble vasket to ganger med iskald PBS, og pelletene ble høstet i 1 ml PBS med protease inhibitor cocktail og slått sammen i et 1,5 ml rør. Den tverrbundne kromatin ble skjærpåvirket ved sonikering 20 ganger i 1 min hver gang med 1 min av avkjøling på is mellom pulsene ved hjelp av en Branson 2510 Ultrasonic Cleaner (Branson, Danbury, CT, USA). Immunoutfelling (IP) ble utført med 5 ug av enten anti-HIF1α (fortynning 1: 500; Novus Biologicals Inc., Littleton, CO, USA) eller anti-IgG-antistoff (Millipore) som en negativ kontroll. Vasker og eluering av IP-DNA ble utført i henhold til den Magna-chip-protokollen (Millipore). Ti prosent (10%) av den opprinnelige skjærpåvirkede kromatin DNA var tilsvarende omvendt tverrbundet og renses, og det gjenvunnede DNA ble anvendt som et inngangsstyre. PCR ble utført med spesifikke primere flankerer HRE-lignende sekvens innenfor promoter-regionen i den menneskelige
Per2
gen (-476 til -284 bp, følelse: 5’ACGCCGGAAGTGGATGAGAC -3 «og antisense: 5» CGACTCCGTCTCATCTGCATACAT -3 «) med de følgende termisk sykling parametere: 94 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 20 sekunder, annealing ved 59 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek.
Statistisk analyse
Hvert eksperiment ble gjentatt minst fire ganger. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil. For å vurdere betydningen av forskjeller, Student
t
-test ble utført. Vi brukte en en-veis analyse av varians (ANOVA) for sammenligninger mellom legemiddelkonsentrasjonen grupper, etterfulgt av anvendelse av Tukey innlegget hoc tester. For alle analysene, ble signifikansnivået satt til
P
0,05. Den Cosinor programvare (døgnrytme Laboratory) [22], [23] ble brukt til å analysere biologiske rhythmicity.
Resultater
Circadian uttrykk for
Per2
genet i nyrekreft cellelinjer
for å utforske transcriptional svinging av
Per2
, alle cellelinjer ble transfektert med en luciferasereportergenet drevet av
Per2
promoter, og en real-time overvåkning analysen ble utført ved hjelp av Kronos Dio (AB-2550, ATTO). En luciferase-bundet promoter i Caki-2-celler som vises døgnrytme etter 2 timer deksametason-behandling (fig. 1 A, tabell 1), men rhythmicity ble ikke påvist i de andre cellelinjer (Fig. S1). Hvert eksperiment ble gjentatt fire ganger, og disse resultatene var konsistente. 24 timer etter behandling deksametason,
Per2
mRNA-nivåer hadde en døgnrytmen i Caki-2-celler (Fig. 1B, tabell 1). Resultatene viste at circadian rhythmicity av
Per2
genet var ikke påvises i nyrekreftcellelinjer, unntatt Caki-2 celler.
(A) Alle nyrekreft cellelinjer ble transfektert med Per2 promoter reporter (2 ug) og Bioluminescens ble deretter målt ved anvendelse av en sanntids overvåkning av analysen. Real-time overvåkning av luciferase aktivitet av
Per2
arrangøren viste at aktiviteten svingte over en ca 24-timers syklus. Luciferase-aktivitet av fire duplikate prøver er vist. Disse kulturene viste betydelige døgnrytme (tabell 1). (B) mRNA nivåer av
Per2
ble bestemt ved real-time PCR for seks plater på hvert tidspunkt. Total RNA ble ekstrahert hver 4. time, begynner 24 timer etter behandling med deksametason for en 24-timers syklus, og
Per2
transkripsjoner ble kvantifisert. Feilfelt angir standardfeil av gjennomsnittsverdiene (
n
= 6). Dataene fra en enkelt 24 timer etter deksametasonbehandling ble analysert ved hjelp av Cosinor programvare for rhythmicity (tabell 1). (C) Strukturen av
Per2
promoter og en analyse av de potensielle transkripsjonsfaktorbindende motivene i denne regionen. Den 2994 bp region inneholder en E-boks-lignende sekvens (CACGTT) og en HRE-lignende sekvens (ATGTG), i likhet med konsensussekvensen HRE (ACGTG) plassert oppstrøms for transkripsjonsstartsetet (TSS). (D) Sequence sammenligninger: øvre linje, mus sekvens; nedre linje, humane sekvens. Nukleotidsekvensen til potensielle transkripsjonsfaktorbindende motiver for E-boks-aktig sekvens og HRE-aktig sekvens er 100% konservert mellom mus og menneske.
Analyse av
Per2
promoter omegn
en tidligere studie viste at en E-boks-lignende sekvens (CACGTT) og dens nedstrøms regionen er avgjørende for transkripsjonen svinging av
Per2
, en viktig del av molekylære klokker [24]. Vi har fokusert på denne E-boks-aktig regionen og HRE. Transkripsjonsfaktor-bindende motiver som ligger på
Per2
promoter i mus og mennesker ble analysert ved hjelp MatInspector programvare (Genomatix, München, Tyskland). Sekvensanalyse av
Per2
promoter regionen avslørte høy homologi mellom mus og mennesker. Sekvensanalyse avslørte også en E-boks-lignende sekvens (CACGTT) og en HRE-lignende sekvens (ATGTG), ligner konsensus HRE sekvensen (ACGTG) [25] som ligger oppstrøms for transkripsjonsstartsetet (TSS) (Fig. 1C ). Disse sekvensene var 100% konservert mellom mus og mennesker (Fig. 1D). En real-time overvåkning analyse (Fig. 1A) indikerte at arrangøren regionen vi klonet er tilstrekkelig til å produsere biologiske transcriptional svingning i humane cellelinjer.
Expression klokke gener i nyrekreftcellelinjer
for å undersøke forskjellen mellom Caki-2 og andre cellelinjer, undersøkte vi uttrykket av BMAL1, klokke, PER2, og CRY1 proteiner. Caki-2, 786-O, og A498 cellene uttrykte BMAL1 protein. Alle nyrekreftcellelinjer uttrykte KLOKKE og CRY1 protein, men uttrykte ikke PER2 protein (Fig. 2A). Full-lengde blots av PER2 og BMAL1, i tillegg til en positiv kontroll, er vist i figur S2, S3.
Alle cellelinjer ble lysert og høstet 24 timer etter synkroniseringen av 2-h deksametason behandling. Vi utførte fire gjenskape vestlige blotter; en representativ blot er vist. (A) Western blot av nyrekreft hel-celle ekstrakter (20 mikrogram) med BMAL1, klokke, PER2, CRY1 og GAPDH antistoffer er vist. Full-lengde blots av PER2 og BMAL1, i tillegg til en positiv kontroll, er vist i figur S2, 3. (B) Western-blots av renal kreft hel-celle-ekstrakter (20 pg) med HIF1α og GAPDH-antistoffer er vist.
Expression of HIFα proteinet under normoksisk forholdene i nyrekreftcellelinjer
Siden HIF1α protein kan generelt overuttrykt i RCC, vi også undersøkt uttrykk for HIF1α protein. I Caki-2 og RCC4 + vektor alene, ble HIF1α protein overexpressed (Fig. 2B). Med tanke på resultatene at
Per2
døgnrytmen ble vist bare i Caki-2 celler, som inneholdt BMAL1, klokke og HIF1α protein, er det mulig at HIF1α er relatert til
Per2
circadian rytme i nyrekreftcellelinjer.
virkningen av HIF1α på
Per2
transkripsjonen aktivitet
for å undersøke virkningen av HIF1α på
Per2
transkripsjonen aktivitet, NIH3T3 og U2OS celler ble transfektert med en luciferasereportergenet drevet av
Per2
promoter og co-transfektert med
Hif1α Hotell og
Arnt
ekspresjonsvektor. Co-transfeksjon med HIF1α /ARNT øket svingningsamplitude og hadde ingen innflytelse på perioden eller acrophase av oscillasjon i disse cellelinjer (Fig. 3A-D, tabell 2). De samme resultatene ble observert i Caki-2 celler (Fig. 3E, F, tabell 2).
(A) NIH3T3 celler ble ko-transfektert med
Per2
promoter reporter (400 ng ) og de angitte ekspresjonsplasmider (300 ng) for HIF1α /ARNT eller tom vektor pcDNA3 (600 ng) som en kontroll. Bioluminesens ble deretter målt ved anvendelse av en sanntids overvåkning analysen. Control, transfektert med tom vektor pcDNA3 (uklonet-vektor kontroll); + HIF1α /ARNT, transfektert med ekspresjonsplasmider. Luciferase-aktiviteter i fire duplikate prøver er vist. (B) Detrended bioluminesens vises. Perioden ble amplitude, og acrophase av svingninger målt på dagene 2 til 5 ved hjelp av Cosinor programvare (døgnrytme Laboratory). Amplitude betydelig økt (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 4) sammenlignet med kontrollgruppen (
p
0,01, Student
t-
test). Se tabell 2. (C) U2OS celler ble ko-transfektert med
Per2
promoter reporter (400 ng) og de angitte ekspresjonsplasmider (300 ng) for HIF1α /ARNT eller tom vektor pcDNA3 (600 ng) som en kontroll. Bioluminesens ble deretter målt ved anvendelse av en sanntids overvåkning analysen. Control, transfektert med tom vektor pcDNA3 (uklonet-vektor kontroll); + HIF1α /ARNT, transfektert med ekspresjonsplasmider. Luciferase-aktiviteter i fire duplikate prøver er vist. (D) Detrended bioluminesens vises. Perioden ble amplitude, og acrophase av svingninger målt på dagene 2 til 5 ved hjelp av Cosinor programvare (døgnrytme Laboratory). Amplitude betydelig økt (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 4) sammenlignet med kontrollgruppen (
p
0,01, Student
t-
test). Se tabell 2. (E) Caki-2 celler ble ko-transfektert med
Per2
promoter reporter (2 mikrogram) og de angitte ekspresjonsplasmider (1,5 mikrogram) for HIF1α /ARNT eller tom vektor pcDNA3 (3 mikrogram ) som en kontroll. Bioluminescence ble deretter målt ved hjelp av en sanntids overvåking analysen. Control, transfektert med tom vektor pcDNA3 (uklonet-vektor kontroll); + HIF1α /ARNT, transfektert med ekspresjonsplasmider. Luciferase-aktivitet av fire duplikate prøver er vist. (F) Detrended bioluminesens vises. Periode, amplitude, og acrophase av svingninger ble målt fra dager 2-5 med Cosinor programvare (døgnrytme Laboratory). Amplitude betydelig økt (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 4) sammenlignet med kontrollgruppen (
p
0,01, Student
t
-test). Se tabell 2.
HIF1α har ingen effekt på antall NIH3T3 celler
For å avgjøre om HIF1α øke amplitude for pendling av
Per2
promoter aktiviteter ved å øke antallet av celler, utførte vi legemer ved hjelp av ArrayScan XTI (Thermo Scientific). Co-transfeksjon med HIF1α /ARNT hadde ingen innflytelse på antall av NIH3T3-celler (fig. 4). Dette indikerer at HIF1α /ARNT øket Bioluminescens av
Per2
promotor aktiviteter som ikke påvirker antallet celler.
NIH3T3-celler ble ko-transfektert med Per2 promoteren reporter (400 ng) og den indikerte ekspresjonsplasmider (300 ng) for HIF1α /ARNT eller tom vektor pcDNA3 (600 ng) som en kontroll. Platene ble avlest på ArrayScan XTI (Thermo Scientific) for celletall angitt tid etter deksametason behandling. Antall levedyktige celler ble ikke påvirket av HIF1α /ARNT på alle tidspunkter (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 6, Student
t
-test).
HIF1α binder direkte til HRE-lignende sekvens i
Per2
arrangøren
for å avgjøre om HIF1α påvirket
Per2
transkripsjon gjennom HRE-lignende element, en antatt HIF1α- bindende sekvens, undersøkte vi effekten av HIF1α /ARNT på
Per2
uttrykket med en luciferase assay i NIH3T3 celler. HIF1α /ARNT økt
Per2
transkripsjonen aktivitet, men hadde ingen effekt på HRE-mutant
Per2
arrangører (Fig. 5A, B). CoCl
2 behandling induserer HIF1α ekspresjon ved binding til PAS domene, noe som resulterer i blokkering av HIF1α-pVHL binding og derved HIF1α stabilitet [26], [27]. For å undersøke effekten av CoCl
2-indusert HIF1α overekspresjon på
Per2
transkripsjonen aktivitet ble cellene behandlet med CoCl
2. CoCl
2 oppregulert
Per2
transkripsjon, men hadde ingen effekt på HRE-mutant
Per2
promoter (fig. 5C). Disse resultatene tyder på at HRE-lignende sekvens i
Per2
promoter vi klonet svart på HIF1α overekspresjon. For å undersøke om HIF1α binder direkte til HRE-lignende sekvens i
Per2
arrangøren
in vivo
, en chip-analysen ble utført. Cross-koblede Caki-2-celler ble immunopresipitert med kanin anti-HIF1α antistoff eller normal kanin IgG. De resulterende immunutfelninger ble analysert ved PCR-analyser ved hjelp av primere flankerer de HRE-lignende sekvenser (-476 til -284 bp) i
Per2
promoter. En merkbar økning i intensiteten av DNA-bånd ble observert for kanin-anti-HIF1α antistoff (fig. 5D, spor 3), men ikke for normal kanin IgG (fig. 5D, kolonne 2). Resultatene indikerte at HIF1α kan øke
Per2
transkripsjonen aktivitet ved direkte binding til HRE-lignende element og forbedre amplitude for pendling av
Per2
promoter aktiviteter.
(A ) Skjematisk fremstilling av mus
Per2
promoter. Den øvre området representerer villtype mus
Per2
arrangøren og den nedre delen representerer HRE-mutant
Per2
promoter. (B) HIF1α /ARNT potent indusert
Per2
promoter aktivitet.
Per2
promotoren og HRE-mutant
Per2
promoter reporter (60 ng) ble ko-transfektert med de angitte ekspresjonsplasmider (+, 50 ng).
Per2
promoter aktiviteter ble signifikant økt (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 4,
p
0,01, Student
t
test) sammenlignet med kontrollen (uten ekspresjonsplasmidet), men det HRE-mutant
Per2
promoteren ble ikke påvirket. (C) Tjuefire timer etter behandling med CoCl
2 (10, 30, 100 pM i 6 timer), luciferaseaktivitet ble målt.
Per2
promoter aktiviteter ble signifikant økt (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 4,
p
0,05, enveis ANOVA etterfulgt av Tukey innlegg hoc tester) konsentrasjon -dependently sammenlignet med kontrollgruppen, men HRE-mutant
Per2
arrangøren ble ikke påvirket. (D) HIF1α samhandler spesielt med HRE-lignende sekvens i
Per2
promoter. Caki-2-celler ble kryssbundet, lysert, og immunopresipitert med anti-HIF1α antistoff eller normalt kanin-IgG (negativ kontroll). Det utfelte DNA ble underkastet PCR med primere som er spesifikke for målet region (-476 /-284). En alikvot av input DNA ble anvendt som en positiv kontroll. PCR-produktet ble observert i anti-HIF1α brikke (felt 3) og 10% Input-DNA (felt 4). Vesentlig mindre ble påvist i noen antistoff-brikke (spor 1) og normal kanin IgG-brikke (kjørefelt 2) baner.
Effekten av å hemme HIF1α på
Per2
døgnrytme
Chrysin er en naturlig flavonoid, som er kjent for å hemme HIF1α ekspresjon ved å redusere proteinsyntese, og derved reduserer HIFα stabilitet uten å påvirke cellenes levedyktighet [28]. For å undersøke effekten av å hemme HIF1α protein på
Per2
døgnrytme, cellene ble forbehandlet med forskjellige Chrysin konsentrasjoner. Ekspresjon av HIF1α protein ble signifikant undertrykt etter en 2-timers inkubering med 100 uM chrysin i Caki-2-celler (fig. 6A, B). Amplituden av døgnrytmen av
Per2
promoter aktivitet betydelig redusert etter en to-timers inkubasjon med 100 mikrometer chrysin i Caki-2 celler (Fig. 6C, D, tabell 3). Basert på disse resultatene, kan HIF1α forbedre døgnrytme av
Per2
arrangøren nivå.
(A) Caki-2-celler ble dyrket til 60-70% konfluens. Cellene ble behandlet med DMSO som en kontroll, eller forskjellige chrysin konsentrasjoner (1, 10, 100 mM) i 2 timer. (B) HIF1α protein nivåene ble målt i tetthetsverdier optiske normalisert til sine respektive GAPDH lasting kontroll, deretter gjennomsnitt ± SEM, og plottes (relative uttrykk) til semikvantitativt sammenligne protein nivåer (
n
= 4). HIF1α ekspresjon ble betydelig undertrykt ved 100 nM chrysin sammenlignet med kontrollen inkubert med DMSO (
p
0,05, enveis ANOVA etterfulgt av Tukey s post hoc test). (C) Caki-2-celler ble transfektert med
Per2
promoter reporter (2 mikrogram). Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene inkubert med 100 pM chrysin eller DMSO i 2 timer. Bioluminesens ble deretter målt ved anvendelse av en sanntids overvåkning analysen. Luciferase-aktivitet av fire duplikate prøver er vist. (D) Detrended bioluminesens vises. Perioden ble amplitude, og acrophase av svingninger målt på dagene 2 til 5 ved hjelp av Cosinor programvare (døgnrytme Laboratory). Amplitude betydelig redusert (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 4) sammenlignet med kontrollen (
p
0,05). Se tabell 3.
Diskusjoner
I denne studien, rytmisk uttrykk for
Per2
genet ble observert i Caki-2 celler. Men
Per2
promoter aktiviteter og mRNA nivåer ikke har døgnrytme i andre cellelinjer. Noen forskjeller kan eksistere mellom Caki-2 og andre nyrekreft cellelinjer. Fordi
Per2
gentranskripsjon aktiveres av heterodimerized transkripsjonsfaktor BMAL1 /CLOCK ved binding til E-boks-aktig sekvens [24] undersøkte vi uttrykket av BMAL1 og KLOKKE protein i disse cellelinjene. Caki-2, 786-O, og A498 celler uttrykt BMAL1, og alle cellelinjer inneholdt KLOKKE protein. Videre alle nyrekreft cellelinjer uttrykte CRY1 protein, men uttrykte ikke PER2 protein. I Caki-2 celler, vi også undersøkt uttrykk for PER2 protein ved 4-timers mellomrom begynner 24 timer etter behandling med deksametason. Men ingen PER2 protein ble påvist ved alle tidspunkter (fig. S4).
