Abstract
Til tross for raske fremskritt innen kjemoterapi og kirurgisk fjerning strategier, forblir bukspyttkjertelkreft den fjerde ledende årsak til kreft dødsfall i USA med en 5-års overlevelse på mindre enn 5%. Derfor er nye terapeutiske midler for forebyggelse og behandling av kreft i bukspyttkjertelen et presserende behov. Målet med denne studien var å undersøke effekten av pristimerin, en quinonemethide triterpenoid sammensatte isolert fra spolebuskfamilien og Hippocrateaceae, på hemming av celleproliferasjon og induksjon av apoptose i tre kreft i bukspyttkjertelen celler, BxPC-3, PANC-en og ASPC-en, både i monoterapi og i kombinasjon med gemcitabin. Behandling med pristimerin redusert celleproliferasjon av alle tre kreft i bukspyttkjertelen celler i en dose- og tidsavhengig måte. Behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med pristimerin også resultert i G1-fasen arrest som var sterkt assosiert med en markert nedgang i nivået av cykliner (D1 og E) og cyclin-avhengige kinaser (CDK2, CDK4 CDK6) med samtidig induksjon av WAF1 /P21 og KIP1 /p27. Pristimerin behandling førte også til apoptotisk celledød, spalting av caspase-3, modulasjon i uttrykket av Bcl-2-familieproteiner, inhibering av translokasjon og DNA-bindende aktivitet av NF-kB. I tillegg pristimerin potensierte vekstinhibering og apoptose induserende effekt av gemcitabin i alle tre kreft i bukspyttkjertelen celler, i det minste delvis, ved å inhibere konstitutive samt gemcitabin-indusert aktivering av NF-kB i både DNA-bindende aktivitet og transkripsjonen aktivitet . Samlet utgjør disse dataene gir den første bevis for at pristimerin har stort potensial for utvikling som en roman middel mot kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Wang Y, Zhou Y, Zhou H, Jia G, Liu J, Han B, et al. (2012) Pristimerin Årsaker G1 Arrest, induserer apoptose, og Forbedrer kjemosensitivitet å Gemcitabin i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 7 (8): e43826. doi: 10,1371 /journal.pone.0043826
Redaktør: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 16 april 2012; Godkjent: 30 juli 2012; Publisert: 28 august 2012
Copyright: © Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra New Century Support Foundation for Elitist av kinesiske utdanningsdepartementet (NCET-07-0248), det vitenskapelige grunnlag for Prominent Youth i Heilongjiang-provinsen, Kina (JC200717), den vitenskapelige og teknologiske Prosjekt i Heilongjiang-provinsen Kina (GC09C407-2), forskning Special Fund for offentlig velferd industrien av helse (201.202.007) og Natural vitenskapelige grunnlag National of China (81170431, 81101799). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest aggressive og dødelige kreft hos mennesker, som stadig har økt i hyppighet i løpet av de siste tiårene, og er i dag den fjerde største årsaken til kreftdød i USA. Den kollektive 1-års overlevelse fra diagnosetidspunktet på ethvert stadium er bare 26%, mens en langsiktig total overlevelse (OS) faller ned til 5% [1]. I 2010 ble det estimert 43,140 amerikanere ble diagnostisert med kreft i bukspyttkjertelen og 36 800 døde av sykdommen [2]. Den viktigste grunnen for en slik dårlig prognose av kreft i bukspyttkjertelen er hovedsakelig på grunn av mangel på tidlig diagnose, den svært aggressive biologiske oppførsel av svulsten og dårlig respons på de fleste behandlinger, inkludert kjemoterapi, strålebehandling og immunterapi [3]. For tiden, Gemcitabin (2′-deoksy-2 «, 2»-difluorocytidine) er kjent for å være bærebjelken i behandling for avansert og metastatisk kreft i bukspyttkjertelen. Imidlertid er gemcitabin behandling fører til en svarprosent på mindre enn 20% og assosiert med flere bivirkninger og chemoresistance [4], [5]. Derfor er utvikling av alternative kjemopreventive og kjemo-terapeutiske strategier sterkt behov for behandling av denne dødelige sykdom.
Nuclear faktor-kB (NF-kB), som spiller en viktig regulerende rolle i ekspresjonen av gener som er involvert i inflammasjon, celleproliferasjon, invasjon, angiogenese, metastase, undertrykkelse av apoptose, blir konstitutivt aktivert i en rekke forskjellige kreftceller, inkludert kreft i bukspyttkjertelen celler [6], [7], [8]. I tillegg er flere linjer av bevis tyder på at NF-kB spiller en sentral rolle i veksten og chemoresistance av kreft i bukspyttkjertelen. For det første er NF-kB konstitutivt aktivert i kreft i bukspyttkjertelen celler, men ikke i normale pankreatiske vev eller nontumorigenic cellelinjer [7], [9]. For det andre, kan NF-kB fremme kreft i bukspyttkjertelen vekst på grunn av sin evne til å hemme celle apoptose, indusere mitogen genprodukter (c-Myc og cyclin D1), øke ekspresjonen av proangiogenic faktor inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og fremmer migrasjon og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler [10], [11], [12], [13], [14]. Endelig spiller NF-kB en sentral rolle som formidler chemoresistance i bukspyttkjertelkreft [15]. Sammen, impliserer dette bevis på rollen av NF-kB i bukspyttkjertelkreft og foreslår midler som kan blokkere NF-kB-aktivering har potensial til å bekjempe veksten av kreft i bukspyttkjertelen.
Pristimerin (fig. 1), et naturlig forekommende quinonemethide triterpenoid sammensatte isolert fra spolebuskfamilien og Hippocrateaceae, har nylig vakt stor interesse på grunn av sitt potensial chemopreventive eller kjemoterapeutiske egenskaper. Det har anti-inflammatorisk, antioksidant, antimalaria, og insektdrepende aktivitet, og har vist seg å ha veksthemmende virkning på en rekke humane kreftcellelinjer som brystkreft og lungekreft, prostatakreft, livmorhalskreft og multippelt myelom tumorer [16], [17], [18], [19], [20]. Men potensialet effekten av pristimerin mot bukspyttkjertelkreft er ukjent.
I denne studien brukte vi tre menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, BxPC-3, Panc-1 og ASPC-en, for å evaluere potensialet for pristimerin som en effektiv Kjemopreventivt og kjemoterapeutisk middel mot kreft i bukspyttkjertelen. Vi viser at pristimerin sterkt undertrykker vekst av alle tre bukspyttkjertelkreft cellelinjer ved å fremkalle G1-fase cellesyklus og apoptose, og sensitizes dem til gemcitabin-indusert celledød. Videre Våre resultater viser at effektene og molekylære virkningsmekanismer av pristimerin i kreft i bukspyttkjertelen celler er forbundet med hemming av NF-kB aktivering.
Resultater
Pristimerin induserer cellevekst Hemming i Pancratic Cancer celler
for å bestemme effekten av pristimerin på cellevekst, menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3, Panc-1 og ASPC-1) ble behandlet med varierende konsentrasjoner (0-1000 nM) av pristimerin for 24 h, 48 h og 72 h, og celleoverlevelse ble bedømt ved CCK-8-analyse. Som vist på fig. 2, pristimerin behandling resulterte i en dose- og tidsavhengig inhibering av cellevekst i alle tre bukspyttkjertelcancercellelinjene som ble testet. Hemmende konsentrasjon (IC) 50 verdier var omtrent 652,71 nM, 283,78 nM og 190,54 nM (mot BxPC-3) og 969,86 nM, 343,62 nM og 261,05 nM (mot PANC-1), og 1261,6 nM, 378,46 nM og 304,57 nM (mot ASPC-1) i 24 h, 48 h og 72 h behandling, henholdsvis. Disse resultatene indikerer at pristimerin har potente antiproliferative virkninger i kreft i bukspyttkjertelen celler.
BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1-celler ble dyrket i fravær eller nærvær av økende konsentrasjon av pristimerin i 24 t, 48 t og 72 h og deretter levedyktigheten av celler ble målt ved hjelp av CCK-8-analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene som vises, er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, sammenlignet med kontrollen. ** P. 0,01, sammenlignet med kontroll
Pristimerin induserer G1-fase cellesyklus arrest og skreddere i G1-fase cellesyklusrelaterte proteiner i kreft i bukspyttkjertelen celler
Basert på den foreløpige undersøkelser, som har vi undersøkt effekten av pristimerin på veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler, i doser på 200, 400 og 600 nM av pristimerin ble utvalgt for ytterligere in vitro mekanistiske undersøkelser. For å utforske den underliggende mekanisme for pristimerin-indusert veksthemming av cellene, ble effekten av pristimerin på cellesyklusfordelingen studert ved Strømningscytometrisk analyse av cellulært DNA-innhold. Som vist på fig. 3A, behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med pristimerin i 48 timer resulterte i en signifikant doseavhengig arrest av celler i G1 fasen av cellesyklusen. G1-fasen i cellesyklus distribusjon var 48.73, 54.75, 63,29 og 73,62% (i BxPC-3) og 67,23, 75,32, 79,41 og 84,29% (i PANC-1) og 70,79, 72,46, 74,95 og 82,97% (i AsPC- 1) på 0, 200, 400 og 600 nM konsentrasjoner av pristimerin, respektivt. Denne økningen i bidragene av celler i G0-G1 fasen ble fulgt med en samtidig reduksjon i bidraget av celler i S-fasen og G2-M-fasen av cellesyklusen i alle tre cellelinjene som ble testet. Samlet utgjør disse data tyder på at induksjon av G1 arrest i kreft i bukspyttkjertelen celler ved pristimerin kan være ansvarlig for pristimerin-indusert hemming av cellevekst.
(A) Effekt av pristimerin på cellesyklus distribusjon i kreft i bukspyttkjertelen celler. BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1-celler ble dyrket i fullstendig medium og behandlet med enten pristimerin (200, 400 eller 600 nM) eller DMSO (kontroll) i 48 timer. Etter behandling ble cellene oppsamlet ved trypsinering, vasket med iskald PBS, og spaltet med RNase. Cellulær DNA ble farget med propidiumjodid og strømningscytometrisk analyse ble utført for deteksjon av prosentandelen av celler i forskjellige faser av cellesyklusen som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. * P 0,05, sammenlignet med kontrollen. ** P 0,01, sammenlignet med kontrollen. (B) Effekt av pristimerin på proteinnivå cyclin D1, cyclin E, CDK 2, CDK 4, CDK 6, WAF1 /p21 og KIP1 /p27 i kreft i bukspyttkjertelen celler. Som beskrevet i Materialer og Metoder, ble kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1) behandlet med enten pristimerin (200, 400 eller 600 nM) eller DMSO (kontroll) i 48 timer og deretter høstet. Totale cellelysater ble fremstilt og underkastet SDS-PAGE, fulgt av Western blot-analyse for G1 cellesyklusregulerende proteiner (cyklin D1, cyklin E, CDK2, CDK4, CDK6, WAF1 /P21 og KIP1 /p27). β-actin ble oppdaget som protein lasting kontroll. De immunoblotter vises her er representative for minst tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
For å forstå mekanismen bak G1-fasen ble arrestert i pristimerin behandlet kreft i bukspyttkjertelen celler, vi neste undersøkt effekten av pristimerin på nivåene av proteiner som regulerer progresjon av celler i G1 fase, inkludert WAF1 /p21, KIP1 /p27, cyklin D1, cyklin E, CDK2, CDK4 og CDK6. Som vist på fig. 3B, behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med pristimerin forårsaket en signifikant reduksjon reduksjon i proteinnivåer cykliner D1 og E på en konsentrasjonsavhengig måte i alle tre bukspyttkjertelcancercellelinjene som ble testet. Tilsvarende ble en doseavhengig reduksjon i ekspresjonen av CDK2, CDK4 og CDK6 observert (fig. 3B). I tillegg til eksponering pristimerin fører til en doseavhengig induksjon av p21 og p27 i alle tre bukspyttkjertelcancercellelinjene som ble testet (Fig. 3B). Vi foreslår at modulering av cellesyklusregulerende proteiner ved pristimerin kan bidra til pristimerin-mediert G1-fasen arrest i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Pristimerin induserer apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler
I tillegg til celle syklus-stans, morfologiske observasjon av pristimerin-behandlede kreft i bukspyttkjertelen celler indikerte at pristimerin-indusert veksthemming kan også være assosiert med induksjon av apoptose. Derfor vurderte vi det apoptose induserende effekten av pristimerin i kreft i bukspyttkjertelen celler. Celler ble behandlet med varierende konsentrasjon av pristimerin (0-600 nM), farget med Annexin V /PI, kastet strømningscytometri for å bestemme den hastighet apoptose. Som vist på fig. 4A, behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med pristimerin i 48 timer resulterte i en signifikant doseavhengig forbedring i både de tidlige og sene stadier av apoptose. Den apoptotiske indeksene var 6,3, 17,5, 38,6 og 74,1% (i BxPC-3) og 8,1, 18,7, 29,3 og 49,8% (i PANC-1) og 11,2, 24,5, 34,7 og 52,9% (i ASPC-1) ved 0 , 200, 400 og 600 nM konsentrasjoner av pristimerin, respektivt. Laser scanning konfokal mikroskopi bekreftet den doseavhengige apoptotiske effekt som vist i de representative fotografier (fig. 4C). For ytterligere å undersøke effekten av pristimerin på celle apoptose, ble caspase-3 aktiviteter av alle tre cellelinjer også evaluert. pristimerin behandling ga en doseavhengig forbedring i caspase-3 aktivitet i alle tre cellelinjene som ble testet sammenlignet med kontroll etter 72 timers behandling (fig. 4D). Deretter undersøkte vi ekspresjonen av pro-kaspase-3 i alle tre cellelinjene som ble testet ved western blotting. Pristimerin behandling også ned-regulert ekspresjon av pro-kaspase-3 på doseavhengig måte (fig. 4E). Til sammen våre resultater tyder på at pristimerin-indusert veksthemming er delvis på grunn av induksjon av en apoptose mekanisme.
(A) Effekt av pristimerin på apoptoseinduksjon vurderes av Annexin V /PI-metoden ved hjelp av flowcytometri. BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1-celler ble dyrket i fullstendig medium og behandlet med enten pristimerin (200, 400 eller 600 nM) eller DMSO (kontroll) i 48 timer. Apoptose hastigheten ble bestemt ved strømningscytometri på annexin V-FITC. (B) Representative dot-plott fra cytometrically illustrerer apoptotisk status i BxPC-3 (øvre panel), PANC-en (i midten panel) og ASPC-en (nedre panel) celler. (C) Virkning av pristimerin på apoptose-induksjon bestemt ved fluorescens mikroskopi. Celler ble også sett under et fluorescens mikroskopi. Representative bildene ble tatt fra Annexin V /PI-farget i bukspyttkjertelen kreftceller under visse behandling. (D) Virkning av pristimerin på apoptose-induksjon vurdert av caspase-3 aktivitet analysen. Cellelysater ble analysert for caspase-3 aktivitet, som beskrevet i «Materialer og metoder». (E) Effekt av pristimerin på spaltning av caspase-3. Som beskrevet i Materialer og Metoder, ble kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1) behandlet med enten pristimerin (200, 400 eller 600 nM) eller DMSO (kontroll) i 48 timer og deretter høstet. Totale cellelysater ble fremstilt og underkastet SDS-PAGE, fulgt av Western blot-analyse. β-actin ble oppdaget som protein lasting kontroll. De immunoblot vises her, er representative for minst tre uavhengige forsøk med lignende resultater. * P 0,05, sammenlignet med kontrollen. ** P. 0,01, sammenlignet med kontroll
Pristimerin modulerer nivåer av BCL-2 Familie Proteiner i kreft i bukspyttkjertelen celler
Siden BCL-2 Familie proteiner spiller viktige roller i apoptose ved å fungere som arrangører (f.eks Bax) eller hemmere (f.eks, Bcl-2 eller BCL-xL) av celledødsprosess, vi neste studert endringer i nivåene av av Bax, Bcl-2 og Bcl-xL i kreft i bukspyttkjertelen celler . Western blot analyse viste at behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler i 48 timer med økende konsentrasjoner av pristimerin resulterte i en doseavhengig reduksjon i nivåer av anti-apoptotiske proteiner Bcl-XL og Bcl-2 (fig. 5). I skarp motsetning til dette ble nivået av pro-apoptotiske protein Bax økte signifikant ved behandling med pristimerin på en doseavhengig måte (fig. 5). Således kan pristimerin behandling modulere nivåene av Bcl-2-familieproteiner på en måte som ville favorisere økninger i prosenter av Bax /Bcl-2 og Bax /Bcl-xL, noe som kan bidra til den observerte apoptotiske virkning av pristimerin.
Som beskrevet i Materialer og Metoder, kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1) ble behandlet med enten pristimerin (200, 400 eller 600 nM) eller DMSO (kontroll) i 48 timer og deretter høstes. Totale cellelysater ble fremstilt og underkastet SDS-PAGE, fulgt av Western blot-analyse. β-actin ble oppdaget som protein lasting kontroll. De immunoblotter vises her er representative for minst tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Pristimerin hemmer trans og DNA-bindende aktivitet av NF-kB i kreft i bukspyttkjertelen celler
NF-kB har vist seg å være konstitutivt aktivert i en rekke forskjellige kreftceller, inkludert kreft i bukspyttkjertelen celler og i forbindelse med både proliferasjon og apoptotisk motstand. Derfor Vi undersøkte om pristimerin medierer sine effekter gjennom moduler NF-kB aktivitet. Ansette western blot analyse, undersøkte vi effekten av pristimerin på konstituerende uttrykk for NF-kB /p65 og IkB-α i kreft i bukspyttkjertelen celler. Våre resultater viste at pristimerin behandling resulterte i en konsentrasjonsavhengig reduksjon i NF-kB /p65 protein nivåer i den nukleære fraksjonen, men det var ingen endring av det i det totale protein (Fig. 6A). I samsvar med disse funn ble en reduksjon i NF-kB proteinnivå i forbindelse med en konsentrasjonsavhengig reduksjon i fosfo-IkB-α med en ledsagende konsentrasjonsavhengig økning i den cytosoliske nivåene av IkB-α-proteinet (fig. 6A). For å støtte denne observasjonen ytterligere, undersøkte vi effekten av pristimerin på den DNA-bindende aktivitet av NF-kB /p65 ved anvendelse av en spesifikk NF-kB /p65 ELISA og funnet pristimerin behandling resulterte i en signifikant doseavhengig reduksjon i DNA-bindende aktivitet av NF-kB /p65 i alle tre kreft i bukspyttkjertelen celler (fig. 6B). Til sammen tyder våre resultater at behandling med pristimerin resulterer i en betydelig undertrykkelse av konstitutiv NF-kB-aktivering i kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) Virkning av pristimerin på proteinnivåer av NF-kB /p65 i kjerne lysater og totale cellelysater av kreft i bukspyttkjertelen celler. Som beskrevet i Materialer og Metoder, ble kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1) behandlet med enten pristimerin (200, 400 eller 600 nM) eller DMSO (kontroll) i 48 timer og deretter høstet. Atom lysater og de totale cellelysatene ble fremstilt og underkastet SDS-PAGE, fulgt av Western blot-analyse for proteinnivået av NF-kB /p65, p-IkB-α (S32 /36) og IkB-α. β-actin ble oppdaget som protein lasting kontroll. De immunoblot vises her, er representative for minst tre uavhengige forsøk med lignende resultater. (B) Effekt av pristimerin på NF-kB /p65 DNA-bindende aktivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler. Som beskrevet i Materialer og Metoder, ble kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1) behandlet med enten pristimerin (200, 400 eller 600 nM) eller DMSO (kontroll) i 48 timer og deretter høstet. Atom lysater ble fremstilt og NF-kB-DNA-bindende aktivitet ble bestemt ved anvendelse av den trans Am NF-kB ELISA Kit. * P 0,05, sammenlignet med kontrollen. ** P. 0,01, sammenlignet med kontroll
Pristimerin Potenserer den cytotoksiske effekten av gemcitabin ved å redusere celleviabilitet og fremme apoptose
gemcitabin, den beste kjemoterapeutiske middel tilgjengelig for behandling av avansert kreft i bukspyttkjertelen, er alene ikke er meget effektiv og er assosiert med systemisk toksisitet og chemoresistance. På grunn av at aktiveringen av NF-kB er blitt vist å fremme gemcitabin motstand i kreft i bukspyttkjertelen, vurderte vi hvorvidt pristimerin kan forsterke effekten av gemcitabin i disse cellelinjene.
CCK-8-analysen viste at behandling med enten pristimerin ( 200 nM) eller gemcitabin (500 nM) alene i 48 timer resulterte i bare 31,5% eller 46,7% tap av levedyktighet av BXPC-3, og 27,2% eller 25,9% tap av levedyktighet av PANC-1, og 26,3% eller 23,6% tap av levedyktigheten til ASPC-1, respektivt. Imidlertid er kombinasjonen av pristimerin og gemcitabin resulterte i tap av 68,1%, 61,7% eller 57,8% av levedyktige celler i hver celletype undersøkt, henholdsvis (fig. 7A). Arten av vekselvirkningen mellom pristimerin og gemcitabin ble kvantifisert ved hjelp av Chou /Talalay median-effekt ligning metode for å utlede et kombinasjonsindeks. En CI 1 betegner en synergistisk effekt, og de CI områdeverdiene for kombinasjonen av pristimerin og gemcitabin i alle tre humane bukspyttkjertel cancer cellelinjer var 0,5 til 0,9 for fraksjonert effekt som tilsvarer 0,3 til 0,9 (figur 7A), som indikerer at den kombinasjonen av pristimerin og gemcitabin ha synergieffekter på å hemme cellevekst i alle cellelinjene som ble testet.
(A) Forsterkning av gemcitabin-indusert hemming av cellevekst ved pristimerin. Celler ble dyrket i fravær eller nærvær av pristimerin (200 nM), gemcitabin (500 nM) eller deres kombinasjon i 48 timer. Levedyktigheten av cellene ble målt ved hjelp av CCK-8-analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. Kombinasjon indeks (CI) versus fraksjon berørt (FA) tomter hentet fra median-effekt analyse av Chou-Talalay. CI verdier: 1, antagonisme; 1, additivity; 1, synergisme. (B) Forsterkning av gemcitabin-indusert apoptose av pristimerin. Celler ble dyrket i fravær eller nærvær av pristimerin (200 nM), gemcitabin (500 nM) eller deres kombinasjon i 48 timer. Apoptose hastigheten ble bestemt ved strømningscytometri på annexin V-FITC. * P 0,05, sammenlignet med kontrollen. ** P 0,01, sammenlignet med kontrollen.
# P. 0,05, sammenlignet med enkelt gemcitabin-gruppen
## P. 0,01, sammenlignet med enkelt gemcitabin-gruppen
Annexin V-analysen viste at enkelt gemcitabin (500 nM) økte frekvensen av apoptose fra 6,3% til 26,9% i BxPC-3 celler og fra 8,1% til 17,9% i Panc-1 celler og fra 11,2% til 20,8% i ASPC-1 celler, mens enkelt pristimerin (200 nM) økte frekvensen av apoptose fra fra 6,3% til 17,5% i BxPC-3-celler og fra 8,1% til 18,7% i PANC-1-celler og fra 11,2% til 24,5% i ASPC-1-celler. Videre gemcitabin i kombinasjon med pristimerin ført til et økt apoptose sammenlignet med enkelt-middel behandling i de respektive celler (46,8%, 40,5% og 46,7%, henholdsvis) (fig. 7B). Disse resultatene sammen indikerer at pristimerin forsterker den cytotoksiske effekten av gemcitabin i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Deretter Vi vurderte effekten av pristimerin og gemcitabin på NF-kB aktivitet for å finne ut om denne fordelaktig effekt av pristimerin og gemcitabin er assosiert med inhiberingen av NF-kB-aktivering. Våre data viser at BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1-celler uttrykt konstitutivt aktiv NF-kB-DNA-bindende aktivitet og gemcitabin alene ytterligere indusert NF-kB-DNA-bindende aktivitet sammenlignet med kontrollen (Fig. 8A og B). Interessant, i alle tre celler, pristimerin var i stand til å redusere NF-kB-DNA-bindende aktivitet uansett med eller uten gemcitabin (Fig. 8A og B). Disse resultater indikerer at pristimerin ikke bare reduserer konstitutivt aktiv NF-kB-DNA-bindende aktivitet i ikke-stimulerte betingelser, men hemmer også gemcitabin-indusert NF-kB-aktivering, som kan være ansvarlig for den forsterkende virkningen av pristimerin på gemcitabin mot kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) Effekt av pristimerin og gemcitabin på proteinnivå NF-kB /p65 i atomlysatene og totale cellelysater av kreft i bukspyttkjertelen celler. Som beskrevet i Materialer og Metoder, kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1) ble dyrket i fravær eller nærvær av pristimerin (200 nM), gemcitabin (500 nM) eller deres kombinasjon i 48 timer og deretter høstes. Atom lysater og de totale cellelysatene ble fremstilt og underkastet SDS-PAGE, fulgt av Western blot-analyse for proteinnivået av NF-kB /p65. β-actin ble oppdaget som protein lasting kontroll. De immunoblot vises her, er representative for minst tre uavhengige forsøk med lignende resultater. (B) Effekt av pristimerin og gemcitabin på NF-kB /p65 DNA-bindende aktivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler. Som beskrevet i Materialer og Metoder, kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3, PANC-1 og ASPC-1) ble dyrket i fravær eller nærvær av pristimerin (200 nM), gemcitabin (500 nM) eller deres kombinasjon i 48 timer og deretter høstes. Atom lysater ble fremstilt og NF-kB-DNA-bindende aktivitet ble bestemt ved anvendelse av den trans Am NF-kB ELISA Kit. * P 0,05, sammenlignet med kontrollen. ** P 0,01, sammenlignet med kontrollen.
# P 0,05, sammenlignet med enkelt gemcitabin-gruppen.
## P. 0,01, sammenlignet med enkelt gemcitabin-gruppen
Diskusjoner
Evalueringen av naturlig forekommende kosttilskudd forbindelser kan indikere roman tilnærminger til behandling av kreft i bukspyttkjertelen, noe som fortsatt en av de mest dødelige kreft tross enorm vitenskapelig innsats [2]. I vår nåværende arbeid, fant vi at pristimerin utøvde betydelig veksthemmende effekt på kreft i bukspyttkjertelen celler (BxPC-3, Panc-1 og ASPC-1) via induksjon av G1 arrest og apoptotisk celledød. I tillegg pristimerin forbedret kjemosensitivitet til gemcitabin i kreft i bukspyttkjertelen celler. Våre data antyder at anti-proliferativ og chemosensitization virkning av pristimerin på bukspyttkjertelcancerceller kan være mediert gjennom hemming av NF-kB aktivitet og endring av celle cycle- og apoptose-relaterte proteiner.
Modulering av cellesyklus progresjon i kreftceller er å anse som en verdsatt mål for behandling av humane maligniteter siden forskjellige studier har vist at avvik av cellesyklus regulatorer er et felles trekk ved human kreft [23], [24], [25]. Våre in vitro resultater viste at behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med pristimerin resulterte i doseavhengig arrest av celler i G1 fasen. Passasjen gjennom cellesyklus, i eukaryoter er styrt av komplekser inneholdende cykliner, de regulatoriske enheter, med cyclin-avhengige kinaser (CDK’er), de katalytiske enheter [26]. Cykliner D og E sammen med CDK2, CDK4, CDK6 og spiller en viktig rolle i progresjon av celler gjennom G1 fasen av cellesyklusen [27]. Dereguleringen av G1 fasecellesyklus regulatorer er antatt å fremme den avvikende spredning av kreftceller. Overekspresjon av cykliner og cdks kan gi kreftceller med en selektiv vekst fordel [28]. Derfor er rettet mot cyklin /CDK-komplekser anses å være en lovende strategi for effektiv behandling av kreft. Under progresjonen av cellesyklusen, blir CDK-komplekser cyclin hemmet via binding til CDK-inhibitorer (ckis) som CIP /KIP og INK4 familier av proteiner [29]. WAF1 /P21 og KIP1 /p27, proteiner av Cip /Kip familie, blokk cellesyklusprogresjon ved å hemme aktiviteten av Cyclin E-Cdk2 komplekser som normalt fremmer G1-S-faseprogresjon. De observerte inhiberende virkninger av pristimerin på cyklin D1, cyklin E, CDK2, CDK4 og CDK6, sammen med dens oppregulering virkninger på WAF1 /p21 og KIP1 /p27 i kreft i bukspyttkjertelen celler antyder dets potensial i forstyrrelse av ukontrollert cellesyklusprogresjon. Til sammen disse dataene indikerer at pristimerin arrestasjoner kreft i bukspyttkjertelen celler i G1 fasen av cellesyklus via modulerende cellesyklus regulatorer som tyder på en av de mekanismer som pristimerin kan handle for å undertrykke kreftcellevekst og indusere apoptotisk celledød.
G1 -fase cellesyklus arrest skaper en mulighet for celler til enten gjennomgå reparasjon eller angi apoptotiske sti å opprettholde vev homeostase og eliminere muterte neoplastiske og hyperproliferating neoplastiske celler fra systemet. I de senere år har begrepet regulering av cellecyklus-mediert apoptose fått økende oppmerksomhet, og har dukket opp som en ideell måte for hemming av cellevekst [30], [31]. I dette aspekt, synes pristimerin å være et potent kjemoterapeutisk middel som det kunne selektivt /preferensielt eliminere kreftceller etter å forårsake cellesyklus-stans og /eller indusere apoptose [20]. I den foreliggende undersøkelse, strømningscytometri data viste at behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med pristimerin resulterte i signifiant induksjon av apoptose, noe som ble ytterligere bekreftet ved spalting av caspase-3, fluorescens mikroskopi og caspase-3 aktivitet. Sammen er disse resultatene viser tydelig at den cytotoksiske effekten av pristimerin i kreft i bukspyttkjertelen celler medieres via induksjon av cellesyklus og apoptose.
Medlemmer av Bcl-2 familien av proteiner har en sentral rolle i å kontrollere apoptotiske sti. Noen proteiner i denne familien, inkludert Bcl-2 og Bcl-XL, undertrykke apoptose, mens andre som Bax og Bak fremme apoptose [32], [33], [34] De pro-apoptotiske proteiner og anti-apoptotiske proteiner av Bcl-2-familien kan danne heterodimerer, noe som resulterer i innbyrdes nøytralisering av de bundne pro-og anti-apoptotiske virkninger. Derfor, endringer i nivåer av anti- og pro-apoptotiske Bcl-2-familieproteiner er kritiske for induksjon av apoptose. Vi har funnet at behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med pristimerin resulterte i en økning i ekspresjonen av Bax protein og en nedgang i ekspresjon av Bcl-2 og Bcl-xL og dermed øke forholdene mellom Bax /Bcl-2 og Bax /Bcl-xL i favør av apoptose. Derfor virker det logisk å postulere at oppregulering av Bax og downmodulation av Bcl-2 og Bcl-XL kan være ansvarlig for den observerte apoptotisk effekt av pristimerin.
Enkelte naturlig forekommende bioaktive forbindelser med chemopreventive eiendommer i kreft i bukspyttkjertelen celler slik som benzyl isotiocyanat, honokiol, curcumin, dihydroartemisinin og fisetin har blitt vist å hemme celleproliferasjon og indusere apoptose gjennom en NF-kB – avhengig mekanisme [35], [36], [37], [38], [39]. Nukleær faktor-kB (NF-kB), som spiller en viktig regulatorisk rolle i ekspresjonen av gener som er involvert i inflammasjon, cellevekst, invasjon, angiogenese, metastase, undertrykkelse av apoptose, blir konstitutivt aktivert i en rekke forskjellige kreftceller, inkludert kreft i bukspyttkjertelen cellene [6], [7], [8]. NF-kB er en homo- eller heterodimer sammensatt av medlemmer av NF-kB familien, herunder NF-κB1 (P50), NF-κB2 (P52), rela (p65), relB og c-Rel [40]. Den vanligste formen er en dimmer av rela (p65) og NF-κB1 (P50), og deponeres i cytoplasma i en inaktiv tilstand gjennom interaksjon med en endogen hemmer IkB [41]. Etter cellestimulering, IkB gjennomgår phosphorylation- og ubiquitinering-avhengig nedbrytning, for derved å tillate aktiv NF-kB til translocate inn i cellekjernen hvor det bindes til bestemte responselementer i DNA-sekvensene for å slå på gentranskripsjon inkludert antiapoptotic (Survivin, Bcl-xL, Bcl-2), proliferative (Cyclin D1), proinflammatoriske (COX-2), invasjon [matriks-metalloproteinase-9 (MMP-9)], og angiogene [vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF)] gener [7], [12], [14], [42], [43].
