Abstract
Bakgrunn
Bare en undergruppe av radikalt resected bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC ) pasienter har nytte av kjemoterapi, og identifisering av prognostiske faktorer er berettiget. Nylig mirnas dukket opp som diagnostiske biomarkører og innovative terapeutiske mål, mens high-throughput arrays åpner nye muligheter for å vurdere om de kan forutsi klinisk utfall. Denne studien vurdert om omfattende miRNA uttrykket profilering korrelert med total overlevelse (OS) i resected PDAC pasienter.
metodikk /hovedfunnene
Høy oppløsning miRNA profiler ble oppnådd med Toray er
3D-Gene
™ -miRNA-chip, oppdage mer enn 1200 mennesker miRNAs. RNA ble vellykket isolert fra parafininnstøpte primære svulster i 19 av 26 scene pT3N1 homogent behandlede pasienter (adjuvant gemcitabin 1000 mg /m
2 /dag, dager-1/8/15, hver 28days), nøye utvalgt etter til deres utfall (OS 12 (N = 13) vs. OS 30 måneder (N = 6), dvs. kort /lang-OS). Svært strenge statistikk inkludert t-test, avstand matrise med Spearman rangerte korrelasjon, og iterative tilnærminger. Unsupervised hierarkisk analyse viste at PDACs gruppert i henhold til deres kort /lang-OS klassifisering, mens funksjonen seleksjonsalgoritmen HJELPE identifisert topp 4 diskriminerende mirnas mellom de to gruppene. Disse mirnas målrette mer enn 1500 transkripsjoner, inkludert 169 målrettet av to eller flere. MiR-211 dukket opp som den beste diskriminerende miRNA, med signifikant høyere uttrykk i lang- vs. kort OS pasienter. Ekspresjonen av dette miRNA ble deretter bestemt ved kvantitativ PCR i en uavhengig kohort av laser-microdissected PDACs fra 60 resekterte pasienter som ble behandlet med det samme regime gemcitabin. Pasienter med lav Mir-211 uttrykk ifølge medianverdien hadde en betydelig kortere median OS (14,8, 95% KI = 13,1 til 16,5, sammenlignet med 25,7 måneder, 95% KI = 16,2 til 35,1, log-rank-P = 0.004). Multivariat analyse viste at lav Mir-211 uttrykk var en faktor av betydning for dårlig prognose (hasardratio 2,3, p = 0,03) etter justering for alle de faktorer som påvirker utfallet.
Konklusjon /Betydning
Gjennom omfattende microarray analyse og PCR validering vi identifisert MIR-211 som en prognostisk faktor i resected PDAC. Disse resultatene spør videre prospektive studier og forskning på biologiske rolle MIR-211 i PDAC
Citation. Giovannetti E, van der Velde A, Funel N, Vasile E, Perrone V, Leon LG, et al. (2012) høy gjennomstrømming mikroRNA (mirnas) Arrays Utred prognostisk rolle MiR-211 i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (11): e49145. doi: 10,1371 /journal.pone.0049145
Redaktør: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 03.07.2012; Godkjent: 04.10.2012; Publisert: 14.11.2012
Copyright: © 2012 Giovannetti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra nederlandske organisasjonen for Scientific Research, VENI tilskuddet (prosjektnummer 91611046 (Elisa Giovannetti)) og Stimuleringfonds Open Access (Elisa Giovannetti), CCA-vici Foundation stipend (Elisa Giovannetti, Amir Avan, Godefridus J Peters) , AIRC Marie Curie International Fellowship (Elisa Giovannetti), og italienske forskningsministeren PRIN-2009 (Elisa Giovannetti, Niccola Funel, Ugo Boggi). Toray Industries, Inc. er en Funder på grunn av ansettelse av Hiroko Sudo, som ga teknisk støtte til å gjennomføre dette prosjektet, men hadde ikke en rolle i studiedesign. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. I denne studien forfatterne bruker produkter av Toray Industries, Inc., 3D-GeneTM «for miRNA microarray, men dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
med en 5-års overlevelse på mindre enn 5%, bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC), inkludert mer enn 90% av bukspyttkjertel kreft, er den mest dødelige blant de store solide tumorer [1]. De siste årene har det vært viktige fremskritt i forståelsen av molekylærbiologi av kreft i bukspyttkjertelen, samt i diagnose og iscenesettelse. Imidlertid har minimalt med fremgang blitt oppnådd i forhindring, tidlig diagnose, behandling og resultatene [2].
Kirurgisk reseksjon er den eneste kurative modalitet for PDAC, men bare 15-20% av pasientene har resectable sykdom ved tidspunktet for diagnosen. Likevel er prognosen for pasienter etter fullstendig reseksjon er dårlig, med 3 års sykdomsfri overlevelse (DFS) rate på 27% (95% konfidensintervall (KI): 23-32%) og median total overlevelse (OS) på 15 -19 måneder [3].
Bare en undergruppe av radikalt resected PDAC pasienter har nytte av kjemoterapi og adjuvant behandling kan ha betydelige toksisitet [4]. Derfor er nye biomarkører av følsomhet for adjuvant behandling snarest garantert for å individualisere klinisk ledelse og bedre terapeutisk utfall [5].
Omfattende studier har preget de komplekse genetiske nettverk og transcriptomics endringer som ligger bak utvikling og progresjon av PDAC [6]. Den nylige oppdagelsen av microRNAs (miRNAs) har gitt ytterligere innsikt potensielt forklare gapet som eksisterer mellom svulst genotype og fenotype
miRNA er en klasse av små ikke-kodende evolusjonært konserverte RNA [19] -. [23 nukleotider] som har blitt funnet i dyre- og planteceller. Per i dag er 1921 unike modne menneskelige mirnas oppført i miRBase database (Slipp 18, november 2011) [7]. MikroRNA gener blir transkribert som ikke-kodende transkripter, og er behandlet gjennom en serie av sekvensielle trinn som involverer RNase III enzymer, drosha og dicer. De behandlede microRNAs er endelig innlemmet i RNA-induserte stanse kompleks (RISC) for å lede dette komplekset for å ned-regulere genekspresjon via binding til 3’UTR av mål-mRNA. Plant og noen dyr mirnas danner perfekte basepar med sine mål mRNA, som resulterer i sin fornedrelse. Men de fleste av de menneskelige mirnas binde seg til sine mål 3’UTRs med ufullkommen komplementaritet og derfor indusere translasjonell undertrykkelse [8].
sentral regulerende rolle hver miRNA i å kontrollere uttrykk for flere genet transkripsjoner tilbyr en unik mulighet å identifisere kritiske mirnas som informative biomarkører for deteksjon, diagnose og prognose av svulster som følge av deregulering av flere gener [9]. Denne underliggende biologiske mekanismen var mest sannsynlig grunnen til at uttrykk mønstre av 217 mirnas ble funnet å klassifisere krefttyper mer nøyaktig enn den informasjon basert på uttrykk profilen til ~16000 mRNA [10].
Rollen miRNAs i kontroll av spredning /differensiering og apoptose, og deres avvikende uttrykk i mange svulster, signalisert at de kan fungere som tumor suppressors og onkogener, noe som tyder deres bruk for diagnostiske og terapeutiske formål. Videre kan utvalgte mirnas påvirke svulst ondartet adferd og respons på kjemoterapi [11].
Våre tidligere studier som fokuserer på MIR-21 viste at både kaukasiske og asiatiske pasienter husing høy uttrykk for dette miRNA i sine PDAC eksemplarer hadde en vesentlig kortere overlevelse [12], [13]. Dette miRNA har blitt referert til som en «oncomir» (dvs. en miRNA med onkogene egenskaper), fordi det er nesten allestedsnærværende og overuttrykkes i humane tumorer. Nylige
in vivo
studier i MIR-21 overekspresjon mus modell etablert av Cre /Tet-off teknologier, demonstrert sin onkogene rolle, viser sin betydelig innvirkning på startfasen, vedlikehold, overlevelse og invasjonen [14].
Men high-throughput teknologiske nyvinninger i å oppdage hundrevis av microRNAs gi nye effektive måter å løse rollen som andre sentrale mirnas regulerer flere gener som kan forklare hvorfor pasienter med liknende clinicopathological egenskaper kan ha stor variasjon i kliniske utfall. Derfor, i denne studien vurderte vi om omfattende miRNA uttrykket profilering, ved hjelp av en miRNA chip påvise mer enn 1200 typer menneskelige miRNA kan skille mellom PDAC pasienter med svært kort OS i forhold til langtidsoverlevende.
I spesielt vi nøye utvalgt 26 PDAC pasienter med homogene clinicopathological karakteristikker som gjennomgikk reseksjon med kurativ hensikt og ble behandlet med tre sykler med standard gemcitabin adjuvant regime. Halvparten av disse pasientene hadde en forferdelig kamp prognose, dør innen ett år etter diagnose, mens de øvrige 13 pasienter overlevde mer enn 30 måneder. Den miRNA microarray analyse ble utført i 19 prøver som sendes RNA kvalitetskriteriet, inkludert 13 pasienter med kort overlevelse og 6 pasienter med lang overlevelse. Siden Mir-211 uttrykk status dukket opp som den mest forutsigbare biomarkør for behandlingsresultat hos disse pasientene, ble utført nærmere analyse av Mir-211 uttrykk i en annen kohort av 60 pasienter, alle behandlet med den samme adjuvant behandling. Dette uavhengig sett bekreftet signifikant sammenheng av Mir-211 uttrykk status med både OS og DFS.
Metoder
Pasienter
Pasienter som gjennomgikk radikal kirurgisk reseksjon med kurativ hensikt (pancreatico -duodenectomy, total pancreatectomy og distal pancreatectomy) ved Institutt for generell kirurgi og transplantasjon, Universitetssykehuset i Pisa (Pisa, Italia), mellom 2000 og 2010 ble retrospektivt anmeldt bruker elektronisk pasientjournal. Blant dem, for den høyoppløselige miRNA uttrykket profilering vi valgt 26 pasienter med tilsvarende patologiske funn, kliniske egenskaper og behandling, men stor variasjon i kliniske utfall. Spesielt halvparten av disse pasientene hadde en svært dårlig prognose, dør innen ett år etter diagnose og ble klassifisert som «short-OS», mens de øvrige 13 pasienter overlevde mer enn 30 måneder, og ble klassifisert som «long-OS». Det som kjennetegner disse 2 gruppene er rapportert i tabell 1.
Validerings kohorten besto av andre 60 radikalt resected PDAC pasienter diagnostisert og behandlet i samme periode, med sine egenskaper også er beskrevet i tabell 1 . Alle disse pasientene gjennomgikk gemcitabin-basert adjuvant behandling, som beskrevet tidligere [15].
Etikk
Alle pasientene ga sin skriftlig informert samtykke til prøvetaking og analyse, og studien har fått godkjenning fra etikkomiteen i Pisa universitetssykehus som en oppfølgingsstudie av forskningsprotokollen tittelen «Farmakogenetikk av gemcitabin relaterte gener i bukspyttkjertelen kreft: korrelasjon med klinisk utfall og toleranse» [15]. De ansvarlige etterforskerne sikre at denne studien ble gjennomført i henhold til Helsinkideklarasjonen, de europeiske retningslinjer for Good Clinical Practice, og relevante nasjonale og regionale krav.
Vev
Formalin Fast Parafin Embedded ( FFPE-) §§ ble nøye gjennomgått for diagnose og tumor innhold. På grunn av lang erfaring med våre patologi laboratorium på store årskull av radikalt resected PDAC pasienter, var det ingen problemer med å velge områder med morfologiske definert kreftceller [16]. Svulstene ble klassifisert og evaluert for svulst staging og gradering som foreslått av WHO, som rapportert i tabell 1.
RNA ekstraksjon fra FFPE lysbilde
Histologiske seksjoner (10 mikrometer) ble fremstilt fra hver FFPE- prøven. Parafin ble fjernet ved behandling xylen og vev ble vasket med etanol to ganger for å fjerne xylen. Vevene ble deretter behandlet med proteinase K ved 37 ° C over natten. Etter sentrifugering ble supernatanten behandlet med en silika-baserte spinn kolonne (New Frontiers Research Laboratories, Toray Industries Inc., Kanagawa, Japan) for å oppnå renset total RNA. Graden av RNA kryssbinding og RNA degradering ble analysert ved elektroforese ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Prøvene som viste de fleste av RNA ved 4000 nukleotider på grunn av tverrbinding, eller flertallet av RNA ved 1.000 nukleotider på grunn av nedbrytning i elektroforese mønstrene var uegnet for miRNA analyse og således ikke benyttet. Av de 26 undersøkte prøvene, 19 prøver passert dette kriteriet, og ble brukt i miRNA profilering.
For de 60 prøvene brukes som en uavhengig validering sett, et gjennomsnitt på 5000 neoplastiske celler ble deretter dissekert bruker Leica LMD6500 instrument (Leica, Wetzlar, Tyskland), som beskrevet tidligere [17]. Presisjonen av den smale fokus for laserstrålen resulterte i fangst av enkeltceller med høy grad av nøyaktighet (figur S1). RNA ble vellykket isolert med RecoverAll Total nukleinsyreisolering kit (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. RNA utbytter og renhet ble kontrollert ved 260 og 280 nm med NanoDrop®-1000 Detector (Nanodrop-Technologies, Wilmington, USA).
miRNA profilering
Vi utnyttet Toray 3D-Gene ™ (Toray Industries, Japan) menneskelige mikroRNA sjetonger for miRNA uttrykk profilering. Den reproduserbarhet og sammenlignbarhet til Taqman RT-PCR, og de eksperimentelle prosedyrer Toray er microarray, ble beskrevet tidligere [18], [19]. Kort fortalt ble 500 ng total RNA ekstrahert fra FFPE seksjon analysert for miRNA profilering ved hjelp av microarray, 3D-Gene® miRNA oligo chip V.16 (Toray Industries) i henhold til produsentens protokoll vE1.10. Antallet montert mirnas på denne microarray er 1212 totalt. Microarray ble skannet og de innhentede bildene ble nummerert ved hjelp av 3D-Gene® scanner 3000 (Toray Industries). Uttrykket nivået for hver miRNA ble globalt normalisert med bakgrunn korrigert signal intensitet av hele miRNAs i hvert mikromatriser (Beskrivelse S1).
Alle microarray data fra denne studien er i samsvar med minimum informasjon om en microarray eksperiment (MIAME) og offentlig tilgjengelig gjennom NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/) under serien posten GSE38781.
Totalt clustering
for å utforske forskjeller i uttrykk mønstre mellom de to gruppene av prøvene, valgte vi mirnas som viste en signifikant forskjell i uttrykk. Den t-test ble utført på lang OS og short-OS grupper for alle mirnas og de som ikke synes å være signifikant forskjellige (p 0,05) har blitt filtrert ut. Hierarkisk unsupervised cluster analyse ble utført på de resterende 170 miRNAs. Tosidige Spearman rangert korrelasjon ble brukt til å generere en avstand matrise. Deretter avstanden matrise ble brukt til å generere klynger for både mirnas og prøver ved hjelp av en hierarkisk clustering algoritmen, basert på gjennomsnittlig sammenhengen [20] -. [21]
Analyse med lettelse og iterativ HJELPE
En funksjon utvalg algoritme, HJELPE [22] – [24], ble ansatt på hele datasettet for å oppdage de mest kresne miRNAs. HJELPE er en iterativ algoritme som tildeler vekter til funksjoner (dvs. miRNA uttrykk verdier) i henhold til avstander mellom funksjoner innenfor og mellom grupper. Ut av 1212 Mirs, ble 703 Mirs som har maksimalt en manglende verdier over alle prøvene valgt. Lettelsen algoritme ble brukt for å velge de 10 høyeste veier miRNAs. I en påfølgende analyse generert vi 100 tilfeldige sett av 6 av 13 prøver som er klassifisert som kort. På hver tilfeldig sett av prøver, kombinert med de 6 prøvene klassifisert som lenge HJELPE algoritme ble brukt til å velge de 10 høyeste veier Mirs. For alle mirnas vises på topp 10 en poengsum ble holdt og de 10 mest vises mirnas ble valgt.
Top mirnas målgener
Et søk ble utført på de antatte målene for den mest kresne mirnas identifisert i vår studie ved hjelp av
TargetScan
webgrensesnitt v.6.1 (https://www.targetscan.org/) og miRDB versjon 4.0 (https://mirdb.org/miRDB/index.html) . Etter sammenligning av alle datasett, ble en undergruppe av gener som ble angrepet av flere enn én miRNA generert.
Revers transkripsjon (RT) og kvantitativ PCR-analyse av MIR-211 og MIR-4321
for å validere resultatene av microarray analyse, vurderte vi uttrykk for den mest kresne miRNA, MIR-211, samt av sjelden undersøkt MIR-4321, i en uavhengig kohort av PDAC pasienter. RNA (10-100 ng) ble revers transkribert og den resulterende cDNA ble forsterket ved hjelp av spesifikke tilpassede TaqMan®-mikroRNA-analyser (Applied Biosystems) for MIR-211 og MIR-4321. Vi utførte en foreløpig analyse av 3 endogene kontroller (RNU1, RNU6 og RNU43) i en serie på 10 PDAC celler. Ettersom verdiene av RNU6 var nærmest de geometriske middelverdier for disse genene, brukte vi denne rengjøring for normalisering av alle følgende analyse. PCR-reaksjonene ble utført i det 7500HT sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems), i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble forsterket i duplikat med passende ikke-mal kontroller. Forsterkning data ble normalisert til RNU6 uttrykk. Kvantifisering av relative uttrykk (rapportert som vilkårlige enheter [a.u.]) ble utført ved å bruke ΔCt metode. Kvantitative-PCR data viste en variasjon koeffisient på Ct alltid lavere enn 2% av middelverdier.
Korrelasjonen av MIR-211 og MIR-4321 med utfallet
Sammenligning av klinisk informasjon og miRNA uttrykk nivåer ble gjort ved hjelp av Pearson χ
2 test og Wilcoxon test. Forholdet mellom miRNA ekspresjon og resultatene ble evaluert ved stratifisering pasientene med hensyn til medianverdien uttrykket (høy versus lav ekspresjon). Analysene av prøvene ble gjort på en blindet måte i forhold til klinisk utfall.
OS ble beregnet fra datoen for operasjonen til datoen for dødsfallet, ble DFS definert som tiden fra dato for operasjonen til datoen av første tilbakefall eller død. Overlevelseskurver ble konstruert ved anvendelse av Kaplan-Meier-metoden, og forskjeller ble analysert ved hjelp av log-rank test. De betydelige prognostiske variabler av OS og DFS i univariat analyse ble inkludert i multivariate analyser ved hjelp av Cox proporsjonal farer modell.
Forholdet mellom MIR-211 uttrykk og resultatet ble også vurdert ved hjelp av unsupervised clustering algoritmen k- midler. Denne algoritmen partisjoner datapunkter i k grupper i en iterativ måte, gitt et forhåndsdefinert antall klynger k (k = 2, maks gjentakelser = 1000).
For Pearson χ
2 test, Wilcoxon-test Kaplan-Meier-kurver, log-rank test og multivariat analyse ble data analysert ved hjelp av
SPSS V.17
statistisk programvare (SPSS, Inc, Chicago, IL), mens alle de andre beregnings analysene ble utført i
R product: (
R v.2.10.1
, pakker: statistikk, dprep). Nærmere om metode og statistikk er gitt i de supplerende data.
In vitro
studier
Den menneskelige PDAC cellelinjer ASPC-1, CAPAN-en, CFPAC-en , HPAC, HPAF-II, MIA PACA-2, PANC-1, PL45, og Su86.86 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), mens fem primære cellekulturer (LPc006, LPc028, LPc033, LPc067, og LPc111) ble isolert fra pasienter ved Universitetssykehuset i Pisa (Pisa, Italia), som beskrevet tidligere (17). Cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium, supplert med 10% FBS, og 1% penicillin (50 IE /ml) og streptomycin (50 ug /ml) (Gibco, Gaithersburg, MD). Celler ble holdt ved 37 ° C under en atmosfære av 5% CO
2 i 75 cm
2 vevsdyrkingskolber (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Tyskland) og høstet med trypsin-EDTA i sin eksponentielt voksende fasen . RNA ble ekstrahert ved anvendelse av en Trizol-kloroform-protokoll (Sigma, St. Louis, MO). RNA utbytter og renhet ble kontrollert ved å måle optisk tetthet ved 260/280 nm med en Nanodrop® spektrofotometer. Basal ekspresjon av MIR-211 ble undersøkt ved QRT-PCR, som beskrevet ovenfor for PDAC vev. Forsterknings data ble normalisert til RNU6 uttrykk, og kvantifisering av relative ekspresjon ble utført ved anvendelse av ΔCt metoden.
Virkningen av MIR-211 på kjemosensitivitet ble evaluert på MIA PACA-2 og LPc028 celler, ved å transfektere disse cellene med forløperen og antisense oligonukleotider (pre-MIR-211 og anti-MIR-211) som er kjøpt fra Ambion-Applied Biosystems (analysen ID, MC10168 og henholdsvis MH10168,) på 30 nM endelig konsentrasjon. Celler ble platet ut ved 5000 celler /brønn i 200 ul RPMI med 10% FBS og 1% antibiotika. Etter 24 timer ble cellene eksponert for 0,9 ul oligofectamine (Invitrogen, Paisley, UK) i serumfritt medium, blandet i 10 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av tilsetning av 0,3 ul 6,25 pM MIR-211-forløper eller inhibitor. Celler ble også inkubert med miRNA negative kontroller (Ambion). Etter å være utsatt over natten ble mediet fjernet fra brønnene og erstattet med RPMI med 10% FBS, uten antibiotika. Deretter ble cellene tillatt å vokse i ytterligere 48 timer i medikamentfritt medium eller behandlet med 1 pM gemcitabin, som beskrevet ovenfor. Ytterligere kontrollbrønner ble anvendt for RNA-ekstraksjon, for å evaluere transfeksjonseffektivitet.
Til slutt, i preliminære funksjonelle analyser for potensielle mål fra Mir-211 prediksjonen
TargetScan
, har vi valgt ribonukleotidreduktase-underenheten 2 (RRM2), som er en viktig cellulær mål av gemcitabin [25]. Derfor, utførte vi en RT-PCR-analyse av ekspresjonen av RRM2 i cellene transfektert med pre-MIR-211 og anti-MIR-211, som beskrevet ovenfor. Disse PCR reaksjoner ble utført med primere og probe fra Applied Biosystems analysen-on-Demand Gene uttrykk produkt Hs0035724, ved hjelp av en tidligere validert metode [15]. Amplifikasjoner ble normalisert til GAPDH og kvantifisering av genekspresjon ble utført ved hjelp av ΔΔCT beregningen, hvor CT er grensesyklus; mengden av målgen, normalisert til GAPDH og i forhold til kalibratorfluider (ubehandlede kontrollceller), er gitt som to
-ΔΔCT. Prøvene ble forsterket i tre eksemplarer med passende ikke-templat-kontroller, og variasjonskoeffisienten var mindre enn 1% for alle replikater
Resultater
Kjennetegn på pasientene
Tabell. 1 oppsummerer clinicopathological karakteristika av alle PDAC pasienter evaluert i denne studien. De fleste pasientene hadde scene-T3 grade-2 svulster, med positive lymfeknuter, og perinevral invasjon.
ble utført Den miRNA microarray analyse i 19 prøver som sendes RNA kvalitetskriterium. Disse pasientene inkluderte 13 pasienter med OS kortere enn ett år (median OS, 8,0, 95% KI, 5.4-10.6) og 6 pasienter som overlevde mer enn 30 måneder (median OS, 31,0, 95% KI, 30.6-31.4). Kaplan-Meier plot av disse gruppene er rapportert i figur S2.
En ytterligere gruppe på 60 pasienter ble anvendt som en validering kohort, med median OS og DFS av 20,9 og 11,9 måneder, henholdsvis (se fig S3 for Kaplan-Meier plott). Arrangementet-rate var 66,7%, og median oppfølging for overlevende pasienter var 21,4 måneder. I dette kullet OS var signifikant lenger (p = 0,009) for pasienter som hadde karakteren 1/2 svulster (median OS, 25,2, 95% KI, 14,7 til 35,7) enn pasienter med grad 3 PDACs (median OS, 14,8, 95% KI, 11,3 til 18,3) data om resultater i henhold til pasientenes egenskaper er rapportert i tabell S1
Mirna microarray analyse. ordnede clustering
Etter de analytiske prosedyrer for normalisering av rådata fra microarray analyse (beskrevet i Beskrivelse S1) vi utført en t-test analyse, noe som resulterte i en liste på 170 mirnas som viser signifikante forskjeller i uttrykk mellom de to gruppene (p 0,05) (tabell S2). For å kunne utføre hierarkisk klyngeanalyse vi senere konstruerte en avstand matrise ved hjelp av den tosidige Spearman korrelasjonstest, på grunn av den ikke-normal fordeling av uttrykk innen prøvene. Denne klyngen analyse viste en god separasjon mellom de to gruppene av prøvene (short-OS vs lang OS), basert på vesentlig forskjellige mirnas (figur 1).
For å kunne utføre hierarkisk klyngeanalyse vi konstruert en avstand matrise ved hjelp av den tosidige Spearman korrelasjonstest, på grunn av den ikke-normal fordeling av uttrykk innen prøvene. Klyngen Analysen viser en god separasjon mellom de to gruppene av prøvene, basert på vesentlig forskjellige miRNAs. De mikroRNA ekspresjonsdata var sentrert ved 2 retninger (dvs. av miRNA og pasienter). Røde og gule representere lav og høy miRNA uttrykk, henholdsvis
Mirna microarray analyse. HJELPE og iterativ HJELPE
Hjelpe algoritmen ble ansatt på det fullstendige datasettet, som beskrevet i metoder. Denne algoritmen tildelt score for hvert miRNA henhold til hvor godt det diskriminert de to gruppene av prøver (f.eks prøver fra kort OS
versus
prøver fra lang OS pasienter). Dette resulterte i en topp 10 mest kresne miRNAs. Figur S3 viser klyngeanalyse basert på de 10 mirnas, mens tabell 2 viser denne gruppen av de 10 miRNAs og deres tildelte score.
Etter å ha observert hvordan resultatet ble distribuert (figur S4), valgte vi de første fire (MIR-211, MIR-4321, MIR-1207-3p og MIR-326) blant denne topp 10 og utført en klyngeanalyse.
Som vist i figur 2, denne toppen 4 mirnas klart skilte de to grupper av pasienter. Med unntak av ett tilfelle (S2), som viste meget høye ekspresjonsnivåer verdier for alle de studerte mirnas, de to hoved klynger på x-aksen svarer til de to grupper (kort /lang-OS). Spesielt, siden fargene i heatmap viste den relative ekspresjon av miRNA på tvers av alle prøvene, ble det observert to typer ekspresjonsprofiler, en hvor ekspresjonen var lavere i pasienter med en kort-OS (for MIR-211, MIR -1207-3p, MIR-326) og en der mønsteret var motsatt (for MIR-4321). Omvendt, pasienter med lang OS hadde høyere uttrykk verdier for MIR-211, MIR-1207-3p, MIR-326, og lavere uttrykk verdier for MIR-4321.
Fargene er normalisert, og kan bare sammenlignes venstre til høyre.
for å bekrefte de mest diskriminerende mirnas vi utført en ekstra analyse ved hjelp av iterative lettelse. Som observert fra tabell S3, de 10 beste Mirs var de samme, med unntak av MIR-1200 og MIR-766 som erstattet MIR-197 og MIR-1296. Men rangeringen av de iterative lindringspoeng viste et klarere skille mellom topp 4 og bunnen 6 mest diskriminerende mirnas (figur S6). På denne måten viste vi at de beste 4 mirnas ikke var forutinntatt mot noen bestemt prøve. Som rapportert i tabell 2, mirnas som dukket opp i topp 4 med HJELPE tilnærming også dukket opp i topp 4 i iterativ HJELPE analyse, noe som tyder på at uttrykket profilen til de 4 miRNAs kan brukes til å trygt skille mellom pasienter med short-OS og pasienter med lang OS.
Target prognose for de øverste miRNA kandidatene
identitet, kromosom~~POS=TRUNC plassering og antall målgener av miRNA kandidatene identifisert i vår studie er oppsummert i tabell 3. for å få ytterligere innsikt i de biologiske pathways potensielt regulert av mirnas, neste utførte vi en omfattende sammenligning mellom de antatte målgener for våre topp 4 miRNA kandidater i henhold til
TargetScan Hotell og
miRDB
. Viktigere, i
TargetScan
forutsigelse om lag 10% av disse genene ble spådd å bli målrettet av 2 mirnas, med 13 gener målrettet av tre miRNA og ett gen målrettet av alle de fire forskjellige mirnas (tabell S4).
analyse av prognostisk rolle MIR-211 og MIR-4321 i en uavhengig kohort av PDAC pasienter
RT-PCR analyse av Mir-211 uttrykk i 60 uavhengige PDAC prøvene ble brukt å validere den prognostiske betydningen av dette miRNA. Denne valideringsgruppen var ikke signifikant forskjellig i form av clinicopathological egenskaper i forhold til den opprinnelige kohort av pasienter (tab 1).
uttrykk for MIR-211 ble observert hos alle disse prøvene, og pasientene ble opprinnelig kategorisert i henhold til medianverdien av uttrykket MIR-211 (12,8 aU), i henhold til den gaussiske fordeling av uttrykket verdier, som beskrevet i figur S7.
Bemerkelsesverdig, MIR-211 uttrykk skilte seg mellom klasse 1/2 ( N = 30) og klasse 3 (N = 30) tumorer (P = 0.006 i Wilcoxon-rank-sum-test). I kontrast, ble det ikke registrert forskjeller i MIR-21 uttrykk nivåer i henhold til andre clinicopathological parametre (tabell S5).
En sterk korrelasjon mellom MIR-211 uttrykk status og klinisk utfall ble demonstrert. Den høye MIR-211 uttrykk gruppen hadde en bedre prognose enn den lave uttrykk gruppen. Pasienter med MIR-211 uttrykk under median (lav MIR-211) hadde en betydelig kortere median OS (14,8 måneder, 95% CI, 13.1-16.5 måneder) sammenlignet med pasienter med Mir-211 uttrykk høyere enn median (median OS, 25,7 måneder , 95% CI, 16.2-35.6 måneder, HR = 3,0, 95% KI, 02.01 til 08.09, P 0,001). Lignende resultater ble oppnådd med de DFS-kurver av pasienter med MIR-211 uttrykk ovenfor median, med en median DFS på 16,7, sammenlignet med 9,3 måneder hos pasienter med lavest MIR-211 uttrykket (P = 0,004). OS og DFS Kaplan-Meier-kurver er vist i figurene 3A-B.
Omvendt vil ekspresjon av MIR-4231 ble ikke korrelert for å resultere i den samme kohort av pasienter (fig S8). Pasienter med MIR-4231 uttrykk under median hadde bare en trend i retning av en betydelig lengre median OS sammenlignet med pasienter med MIR-4231 uttrykk over median (25,8 måneder, 95% CI, 18.2-32.3 måneder, kontra 16,7 måneder, 95% CI, 13.7-19.7 måneder, p = 0,194). Tilsvarende ble det ikke observert signifikante forskjeller for median DFS (13,0 måneder, 95% KI, 8.4-17.6 måneder, kontra 10,0 måneder, 95% CI, 2.0-17.9 måneder, p = 0,581).
Men gitt det faktum at det var en god korrelasjon mellom ekspresjonen av MIR-211 og OS, som vist i fig S8 (r = 0,724) vi videre analysert MIR-211 uttrykk data ved hjelp av k-means (k = 2).
