Abstract
levermetastaser er en viktig årsak til dødelighet av tykk- og endetarmskreft (CRC). Imidlertid mekanismene bak denne fremgangsmåte er stort sett ukjent. Osteopontin (OPN) er en utskilt fosforylert glykoprotein som er involvert i tumor migrasjon og metastasering. Rollen til OPN i kreft er foreløpig uklart. I denne studien ble OPN mRNA undersøkt i vev fra CRC, ved normal slimhinne, og levermetastatiske lesjoner som bruker kvantitativ real-time PCR-analyse. Proteinet uttrykk for OPN og dets reseptorer (inte αv og CD44 v6) ble påvist ved hjelp av en immunhistokjemisk (
IHC
) -metoden. Rollen til OPN i levermetastaser ble undersøkt i etablert tykktarmskreft Colo-205 og SW-480 cellelinjer transfektert med fornuftig-eller antisense-OPN eukaryote ekspresjonsplasmider av flowcytometri og celle adhesjon analysen. Florescence omfordeling etter fotobleking (FRAP) ble brukt til å studere gap funksjonell intercellulær kommunikasjon (GJIC) blant OPN-transfekterte celler. Det ble funnet at OPN ble sterkt uttrykt i metastatisk lever lesjoner fra CRC i forhold til primær CRC vev og tilstøtende normal slimhinne. Ekspresjonen av mRNA OPN i tumorvev var signifikant relatert til CRC-stadier. OPN uttrykk ble også påvist i normale hepatocytter rundt CRC metastatiske lesjoner. To kjente reseptorer av OPN, inte αv og CD44v6 proteiner, ble sterkt uttrykt i hepatocytter fra normal leveren. CRC celler med tvang OPN uttrykk utstilt økt heterotypic heft med endotelceller og svekket interkommunikasjon. OPN spiller en betydelig rolle i CRC metastaser til leveren gjennom interaksjon med sine reseptorer i hepatocytter, redusert homotypisk heft, og forbedret heterotypic vedheft
Citation. Huang J, Pan C, Hu H, Zheng S, Ding L ( 2012) osteopontin-Forbedret levermetastaser fra kolorektal kreft celler. PLoS ONE 7 (10): e47901. doi: 10,1371 /journal.pone.0047901
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: May 11, 2012; Godkjent: 18 september 2012; Publisert: 24 oktober 2012
Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Natural Science Foundation of China (81102012, https://www.nsfc.gov.cn/), Zhejiang Qianjiang talenter prosjekt (2011R10029; https://kjt.zj.gov.cn/), og Zhejiang medisin vitenskapelige finansiere prosjekter (2010ZB073; https://www.zjtcm.gov.cn/) til LD. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) fortsetter å være den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA [1]. Omtrent 50% av CRC pasientene har metastaser i leveren, men bare 10% -20% av disse pasientene kan gjennomgå kirurgisk reseksjon. Den 5-års overlevelse etter kirurgisk reseksjon av metastatisk tumor er bare 30% -40% [2], [3] .Den molekylære mekanismene bak CRC metastaser er ikke helt forstått, men de siste bevis tyder på at osteopontin (OPN) spiller en rolle i regulere tykktarmskreft cellemetastase [4].
OPN er en phosphoglycoprotein som opprinnelig isolert fra mineralisert bein matrise [5], også ofte utskilt av ulike typer kreftceller, avgjørende for vekst og metastasering av brystkreft [ ,,,0],6], prostata [7], [8], hepatisk [9], melanom [10], og andre tumorer [11]. OPN signaler gjennom celleadhesjonsmolekyler, slik som integriner og CD44 [12], [13]. Gene-profilering studier har identifisert en sammenheng mellom avanserte og metastatisk kolorektal tumorer og høy uttrykk for OPN [14]. En stor innflytelse på OPN på metastatisk potensial er gjennom mobilnettet vedlegg og migrasjon over ekstracellulære matrise proteins22. Imidlertid har ikke blitt etablert de funksjonelle rollene og de underliggende mekanismene for OPN i tykk- og metastasering.
Her har vi undersøkt hvilken rolle OPN i tykktarm metastaser til leveren og mekanismer som OPN fremmer tykktarmskreft metastatisk aktivitet.
Materialer og metoder
pasienter
vevsprøver fra 44 tilfeller av CRC og 20 pasienter med levermetastaser på Second Affiliated Hospital of Zhejiang University ble oppnådd frisk fra kirurgiske reseksjoner med tidligere tillatelse. Median alder for pasientene var 57 år i drift, alt fra 25 til 84. Patologiske egenskaper inkludert svulst plassering, scene, og differensiering ble registrert. Denne studien har fått menneskelig forskningsetikk godkjenning fra etikkomiteen av den andre Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University.
Cell Kultur
To kolorektal adenokarsinom cellelinjer Colo-205 og SW480 celler ble hentet fra Cancer Institute of Zhejiang University og vedlikeholdes i RMPI-1640 med 10% kalveserum ved 37 ° C med 5% CO
2.
Kvantitativ real-time PCR
vevsprøver ble snap-frosset umiddelbart etter kirurgisk reseksjon. Det totale RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. RNA integritet ble undersøkt ved gel-elektroforese med 1% formaldehyd-gel. 2,0 mikrogram total RNA ble omvendt transkribert med SUPER SCRIPT II rtPCR sett (Invitrogen). Sanntids PCR ble utført i et sluttvolum på 50 pl inneholdende 1 pl RT-transkript, 5 uM av hver primer, 0,5 enhet av AmpliTaq DNA-polymerase (Invitrogen). Som en intern positiv kontroll ble utført real-time PCR-analyse av GAPDH-genet i parallell. De følgende primere ble anvendt: OPN forover primer 5′-CAA ATACCCAGATGCTGTGGC-3 «; OPN reverse primer 5»-TCCTGGCTGTCCACATGGTC-3 «; GAPDH forover primer 5»-CTTAGCACCCCTCCCCAAG-3 «; GAPDH revers primer 5»-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3 «. OPN TaqMan probe 5»-TGACCCTACTCAGAAGCAGAATCTCCTAGCC-3 «; GAPDH TaqMan probe 5»-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3 «. PCR-amplifikasjoner ble utført i en 96-brønners reaksjonsplate format og fluorescens-signaler ble detektert med et PE-Applied Biosystems 7700 Sequence Detector (Perkin-Elmer). Fluorescens-signaler ble oversatt til C
T-verdier (syklus terskel, svarende til syklusnummer som ved en signifikant økning i fluorescens-signalet først ble påvist). Nivået av mRNA uttrykk for OPN = OPN C
T verdi /GAPDH C
T verdi.
PCR produktene ble elektroforese på agarosegel og farget med etidiumbromid og fotografert. PCR-produkter med den forventede størrelse ble klonet inn i en pGEM-T-Easy vektor (Promega) og sekvensene av de resulterende plasmider ble bekreftet.
Antisense- og Sense-OPN Eukaryote ekspresjonsplasmider
til obtainan anti-sense OPN ekspresjonsplasmid, genererte vi et 201 bp cDNA-fragment (210-368) ved hjelp av PCR med primere OPN som nevnt ovenfor. cDNA-fragmentet ble så klonet inn i
EcoR
I stedet for det pcDNA 3.1 (+). Den motsatte retning av den klonede cDNA ble bekreftet ved DNA-sekvensering (Vektoren er betegnet OPN-antisens).
Den åpne leseramme (ORF) av OPN ble oppnådd ved RT-PCR. OPN primer F: 5’CCG ACC AAG GAA AAC TCA CT – 3 «, R: 5’CTC CTT TTA ATT GAC CTC AG – 3». De 974 bp PCR-produktene ble klonet inn i en pGEM-T Easy-vektor og sekvensert på begge tråder ved bruk av ABI PRISM 377 DNA Sequencer ™ (Perkin-Elmer). ORF av OPN ble så klonet inn i en eukaryot ekspresjonsvektor pcDNA 3.1 (+) for å generere pcDNA 3.1-OPN (ORF). (Vektoren er utpekt OPN-følelse).
Stall Expression cellelinjer
De plasmider av OPN-antisense, OPN-følelse og pcDNA3.1 (+) ble linearlized med
Bgl ?
fordøyelsen i 4 timer. DNA transfeksjon ble utført ved hjelp av Superfect Transfeksjon Reagens (Qiagen) etter produsentens anvisninger. Etter 48 timer ble transfekterte celler valgt med G418 i 3 dager. Utvalgte kloner ble slått sammen og utvidet. De etablerte cellelinjer ble bekreftet med RT-PCR og Western bolt analyse.
In Situ
mRNA Hybridisering (
ISH
)
Spesifikke prober komplementære til den OPN mRNA ble utformet basert på GenBank J04765 (human osteopontin mRNA, komplett CDer). Disse oligonukleotidsekvenser ha 100% homologi med OPN genet og minimal homologi med andre pattedyr gensekvenser som søkte i GenBank etter eksplosjonen. DIG RNA Etikett Kit (SP6 /T7) (Roche) ble benyttet til å generere både fornuft og antisense. Parafininnstøpte vev ble seksjonert i 4 μ m. Glassene ble deparaffinized og behandlet med 0,2% M. HCl i 20 min. Etter å ha spaltet med proteinase K, ble objektglass inkubert med pre-hybridisering oppløsning (inneholdende 500 ug /ml poly (A)) ved 42 ° C i 30 minutter i en fuktkammer. Oppløsningen ble erstattet med hybridisering oppløsning (inneholdende 0,3 ug /ml følelse eller anti-sense-RNA enkelt tråd probe henholdsvis 50% formamid, 10% dextransulfate, og 2 x SSC), og hybridisert ved 42 ° C over natten. Etter å ha vasket med 2 x SSC og 1 x SSC i 15 minutter hverandre, objektglassene ble blokkert med PBS inneholdende 5% bovint serumalbumin i 10 minutter, inkubert med biotinmerkede mus-anti-digoksin-antistoff i 30 minutter og deretter med alkalisk phosphoesterase -affinitin i 30 minutter. NBT-BCIP ble brukt til å farge lysbilder i pH 10 substrat buffer. Etter dehydrering ble lysbilder montert med vandig monteringsmedium (Sigma).
Immunhistokjemi Analyse
Rotte anti-human osteopontin monoklonalt antistoff (Chemicon, Billerica, MA) ble anvendt for
IHC
. Alle deler (5 um tykke) fra formalin-fikserte parafininnstøpte vevsblokker ble montert på gelatinbelagt glass-slides. For å forbedre antigen eksponering, ble platene behandlet med 1 x EDTA ved 98 ° C i 10 min for antigen hente. Glassene ble inkubert med endogen peroksidase blokkeringsløsning for å inhibere endogen peroksidase og deretter inkubert med det primære antistoff (enten anti-OPN mus monoklonalt antistoff (Akm2A1, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i en fortynning på 1:200, eller inte αv monoklonalt antistoff (P2W7, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved en fortynning på 1:200 eller CD44v6 monoklonalt antistoff (MAB-0038, Maixin, Fujian, Kina) ved en fortynning på 1:100) ved romtemperatur i 60 min. Etter å ha skylt med Tris-bufret saltvann, ble platene inkubert i 15 min med biotin-konjugert sekundært antistoff, vasket og deretter inkubert med enzymforening HRP (pepperrotperoksidase) -streptavidin. Nylaget DAB (Zymed, South San Francisco, CA) ble brukt som underlag for å oppdage HRP. Til slutt, lysbilder ble kontra med hematoksylin og montert med vandig montering media.
celleadhesjonsanalyse
Ettlagskulturer Colo-205 celler og SW-480 celler ble opprettholdt i Ø 35 mm retter og normal medium til 70% -80% samløpet. Vedlagte Cellene ble så lagt over monolagcellene, blandet godt og inkubert i forskjellige tidsperioder.
Flytende-celler ble samlet opp etter inkubering i 10 min, 20 min, 30 min og 40 min, og antallet ble tellet ved hjelp av en hemocytometer. Celle adhesjon forholdet ble deretter beregnet: vedheft forhold = (summen av cellene har lagt til, suspendert celler) /sum av prøvelegemer. Homotypisk vedheft analysen ble utført med samme cellelinjer, hver av dem mellom navlen fartøy endotel celler ECV 304 celler ble brukt henholdsvis i heterotypic vedheft analysen.
flowcytometrisystemer Analysis
1 × 10
6 /ml celleprøver ble suspendert grundig i PBS, blandet med 20 ul CD44-FITC-antistoff, kontrollert med 20 ul lgG1 /2a-antistoff, celle inkubert med Ab ved RT i 20 min. Skylles med PBS, blandet med 1% paraformal-dehyde, deretter oppdaget med FAC Scan (BD selskap, Cell quest TM versjon 3.3 software).
Gap-fluorescens Omfordeling Etter fotobleking (Gap-FRAP) Metode
Celler av 80% samløpet ble undersøkt for fluorescens omfordeling etter fotobleking. Cellene skylles med Hanks (Ca
2+, Mg
2+), inkubert 15 minutter med 10 ug /ml 5 (6) -carboxyfluorescein diacetat (cfda) i 37 ° C, 5% CO
2 . Etter skylles med PBS, ble en celle ved siden av andre celler velges og fluorescens ble photobleached henhold LEICA TCS-SP laser co-fokus mikroskop (Argon ion laserstråle, 518 nM, Tid /lampse program for fotobleking og skanne, fysiologi programvare for bilde og data). Digitale bilder av fluorescensemisjonen eksiteres av svake laserpulser ble registrert med jevne mellomrom i 12 min (avsøkningsperiode ett minutt før og etter fotobleking) og lagret for påfølgende analyse. I hvert forsøk ble en merket, isolert celle igjen ubleket som en referanse for tap av fluorescens som følge av gjentatt skanning og fargestoff lekkasje, og en isolert, bleket celle fungerte som kontrollgruppe.
Statistical Analysis
data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Parvise prøver
t
testen, uavhengige prøver
t
test og enveis ANOVA ble brukt. Beregninger ble utført ved bruk av SPSS 13,0 programvare.
P
verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
OPN Expression i Primær CRC, CRC metastaselesjoner i leveren, og normalt vev
Basert på kvantitativ real-time PCR, C
T-verdier er omvendt proporsjonalt med loggen verdien av de opprinnelige kopiantall av målet sekvens. Vi fant at OPN mRNA ble uttrykt i 44 tilfeller av CRC vev, men på ulike nivåer; maksimal C
T verdi var 1,47 og den laveste verdien var 0,85, ±
s
= 1,15 ± 0,14. Da sammen med tilstøtende normale prøver, maksimal C
T verdi var 1,75 og den laveste verdien var 0,94, ±
s
= 1,32 ± 0,18. (Parvise prøver
t
test,
t
= 5,81,
P
= 0,000). Den OPN mRNA ekspresjon ble betydelig økt i primær CRC vev i forhold til nabo normalt vev.
I
ISH
, presenterer den positive flekk blå-lilla henhold mikroskop. Den OPN mRNA, noe som indikerer et positivt signal, ble funnet i cytoplasma i celler i CRC primære lesjoner (x 400). b, Flekken i tilstøtende normale kolorektal vev var negativ (× 400). c ble OPN mRNA funnet i cytoplasma av CRC celler lever metastatisk vev. Tilstøtende normale levervev flekker negativ (× 100).
I 20 av undersøkte levermetastatisk vev fra CRC, maksimal C
T verdi var 1,30 og den laveste verdien var 0,92, ±
s
= 1,07 ± 0,10. Sammenlignet med den primære kreft, OPN mRNA uttrykk i levermetastatisk vev var høyere (uavhengige prøver
t
test,
t
= 2,12,
P
= 0,038).
Basert på Dukes stadium, syv av totalt 44 CRC pasienter var på scenen A og OPN mRNA bety C
T-verdien var 1,49 ± 0,38, 1,21 ± 0,28 for trinn B (17 pasienter), 1,11 ± 0,29 for stadium C (18 pasienter), og 0,92 ± 0,32 for scene D (2 pasienter). Uttrykket nivået av OPN mRNA i CRC vevet på tidlig stadium var betydelig høyere enn som på avansert stadium (enveis ANOVA,
P
= 0,031).
Vi brukte
ISH
analyse for å vurdere nærmere OPN mRNA uttrykk og lokalisering. I denne analysen vises positiv blå-purpur under mikroskopet. OPN mRNA, som vises signal farge, ble funnet i cytoplasma i CRC-celler i både primære lesjoner og levermetastatisk vev. Farging signal ble ikke påvist i tilstøtende normalt kolorektal og normal leveren vev (
Fig. 1
).
Ved hjelp av en immunhistokjemisk metode, vi ytterligere bekreftet at OPN protein ble uttrykt i cytoplasma av CRC celler i både primær lesjon og metastatiske vev. Den brune positive flekker ble også funnet i normale hepatocytter rundt metastatisk vev. Tilstøtende normalt vev kolorektale oppviste ikke noe signal. Som kontroll, OPN proteiner flekker i normale levervevet uten CRC metastaser
(
Fig. 2
)
.
I
IHC
, ble OPN proteiner (brun positiv beis) lokalisert i cytoplasma av CRC celler i primær lesjoner (X200). b tilstøtende normalt kolorektal vev var negative (x200). c Positiv flekken ble funnet både i CRC celler og tilstøtende normale hepatocytter i leveren metastatisk vev (x100). d Som kontroller OPN proteiner flekker i normale levervevet uten CRC metastaser ble negativ (x100).
Expression of OPN reseptor-inte αv og CD44v6 Farging i Normal Hepatocytter
OPN har blitt vist å samvirke med en rekke forskjellige integriner via den RGD-sekvensen, inkludert αvβ3, αvβ1 og αvβ5. CD44v6 er et spleisevariant av CD44 (CD44v) kan også binde seg til OPN og sannsynlig fremmer kreftcelle tilslutning til det vaskulære endotelet og base membraner, så forbedrer invasjon og metastasering av colonic karsinomer. Hvis du vil kontrollere disse reseptorene i normal leveren, vi analysert for inte αvβ1 og CD44v6 av IHC. Vi fant at både inte αvβ1 og CD44v6 ble farget positivt i hepatocytter i normale levervev
(
Fig. 3
).
I
IHC
, inte αv proteiner (brun positiv beis) ble lokalisert i cytoplasma av hepatocytter (× 400). b, ble CD44v6 proteiner (brun positiv beis) lokalisert i cytoplasma av hepatocytter (× 400).
Uttrykk av CD44 på cellemembranen ved flowcytometri
CD44 spiller en stor rolle i celle-celle-adhesjon, celle-substrat interaksjon, lymphocyte homing, og tumormetastase. Nyere studier har vist at høyt uttrykk av CD44 i visse typer svulster er knyttet til hematogenic spredning av kreftceller.
Vi oppdaget CD44 uttrykk i overførte cellelinjer ved hjelp av flowcytometri. Vi har funnet at etter nedregulering av ekspresjon OPN, CD44 ekspresjon på Colo-205-OPN-antisense-cellemembraner ble redusert fra 54,28 ± 0,11 til 35,35 ± 0,24 i Colo-205,
P
0,01. I kontrast, ble verdien økt i SW-480- OPN-sense celler hvor OPN uttrykk var oppregulert fra 2,65 ± 0,21 til 33,12 ± 0,15,
P
. 0,01
homotypisk og Heterotypic celle adhesjon
Cell vedheft er en viktig faktor i kreft metastasering. Avløsning av kreftceller fra sine overordnede svulster er en innledende hendelse i metastaser og er relatert til homotypisk vedheft avtagende. Når kreftceller flykte fra den primære svulsten, kommuniserer de med forhåndsdefinert verts basalmembranene på et mangfoldig stadier i løpet av metastatisk kaskade. Heterotypic adhesjon hjelper kreftceller komplett hele denne prosessen.
Vi oppdaget den homotypisk og heterotypic heft evne i Colo-205-OPN-anti og SW-480-OPN-sense separat. Navle fartøy endotel celler ECV 304 ble brukt som målceller i heterotypic vedheft. Homotypisk heft evne ble forsterket etter OPN-antisense transfeksjon i Colo-205, men ble svekket i SW-480-OPN-følelse. I kontrast, ble heterotypic heft evne svekkes Colo-205-OPN-antisense, men ble forbedret i SW-480-OPN-følelse.
(data ikke vist)
.
Gap junctional inter Communication (GJIC) med Gap-FRAP
GJIC består av inter utveksling av lavmolekylære molekyler, og er den eneste en anordning for direkte kontakt mellom cytoplasms av tilstøtende dyreceller. Forstyrrelser i GJIC har vært forbundet med mange patologiske tilstander, som for eksempel kreftutvikling eller arvelig sykdom [15], kan også legge til rette for utgivelsen av en potensielt neoplastisk celle fra kontroll av omkringliggende vev, som fører til tumorvekst [16].
Vi brukte gap-FRAP å måle GJIC i OPN transfekterte celler (SW-480-pcDNA3.1 (+) – OPN) mens Colo-205 var semi-suspensjonsceller som ikke ble bevilget for denne metoden. Cell signalutveksling ble svekket og GJIC funksjonen ble hemmet. Sammenlignet med kontrollceller (vektor transfektert SW-480-OPN celler, SW-480-pcDNA3.1 (+)), fluorescens ble ikke omfordelt godt i SW-480-OPN-sense celler etter både 5 minutter og 10 minutter av fotobleking. Etter 5 minutter av fotobleking, andelen av fluorescens omfordeling etter fotobleking (FRAP%) ble 24,65 ± 4,08% i SW-480-pcDNA3.1 (+) – OPN sammen 44.74 ± 6.23% i SW-480-pcDNA3.1 (+ ) (
t
= 17,07,
P
0,001), og etter 10 minutter ble FRAP% fortsatt være hemmet på 25,98 ± 4,48% i SW-480-pcDNA3.1 ( +) – OPN mens det ble omfordelt til 64,92% ± 5,39% i SW-480-pcDNA3.1 (+) celler (
t
= 35,16,
P
0,001) (
fig. 4
). Disse resultatene indikerer at OPN kan hemme GJIC funksjon og nedsatt signalutveksling blant disse transfekterte SW-480 celler.
uniform fluorescens intensitet før fotobleking i SW-480-pcDNA3.1 (+). a2, svekket fluorescens intensitet etter fotobleking i SW-480-pcDNA3.1 (+). a3, fluorescens omfordeling etter 10minutes i SW-480-pcDNA3.1 (+). b1, uniform fluorescens intensitet før fotobleking SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN celler. b2, svekket fluorescens intensitet etter fotobleking SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN celler. b3, svak fluorescens omfordeling etter 10minutes SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN celler. c, Andelen av fluorescens omfordeling etter fotobleking (FRAP%) i SW-480-pcDNA3.1 (+) og SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN celler. Etter 5 minutter av fotobleking, andelen av fluorescens omfordeling etter fotobleking (FRAP%) 24,65 ± 4,08% i SW-480-pcDNA3.1 (+) -OPN sammenlignet 44.74 ± 6.23% i SW-480-pcDNA3.1 (+) (
t
= 17,07,
P
0,001), og etter 10 minutter ble FRAP% fortsatt være hemmet på 25,98 ± 4,48% i SW-480-pcDNA3.1 (+ ) -OPN mens det ble omfordelt til 64,92% ± 5,39% i SW-480-pcDNA3.1 (+) celler (
t
= 35,16,
P
. 0,001)
Diskusjoner
Menneskelig tykktarmskreft rammer nesten 150 000 pasienter og 60.000 dødsfall i USA hvert år. Leveren er den primære ekstra colonic stedet for CRC metastaser og representerer den vanligste plasseringen og klinisk presentasjon for tilbakevendende sykdom hos pasienter som ikke locoregioal terapi [17]. Det er få tumormarkører som har klinisk nytte i forvaltningen av CRC metastaser. Selv anvendelsen av de mest brukte markeringen, carcinoembryoni antigen (CEA), har nylig blitt trukket i tvil [18]. OPN er en kandidat gen av metastaser i CRC. Med anvendelse av genekspresjon profilering teknologi og samleprøve uttrykk profilering [19], [20], er OPN blitt identifisert som den ledende kandidat kliniske markeringen av CRC progresjon. Vi undersøkte derfor rollen som OPN i å regulere lever end-organ metastasering.
Ved hjelp av kvantitativ real-time, vi bekreftet at OPN ble sterkt uttrykt i metastatisk lever lesjoner fra CRC i forhold til primær CRC vev og tilstøtende normal slimhinne. I tillegg ble ekspresjon av OPN mRNA i tumorvev signifikant relatert til CRC-stadier. Disse resultatene impliserer at OPN er en potensiell markør for tumorinvasjon og levermetastaser fra CRC.
Spesielt OPN mRNA ble funnet i cytoplasma av CRC celler ved
in situ
hybridisering, men ikke i deres tilstøtende normale vev eller i de omkringliggende normale vev av lever. Immunhistokjemisk analyse viste at OPN proteinet finnes også åpenbart i cytoplasma av tilstøtende normale hepatocytter liggende CRC-vev, og at uttrykket av OPN protein i normalt levervev er negativ. Men vi har oppdaget to reseptorer av OPN, integrinαv og CD44v6, i normal levervevet. Derfor hypoteser vi at når CRC-tumorceller avvike fra primære lesjoner, i portvenen, som er en nødvendig circumfluence vene, gjør at kreftceller til å passere gjennom leveren. Tumorceller som inneholder OPN kan akkumuleres i leveren gjennom et samspill mellom en ligand og reseptor.
Vi undersøkte to ulike cellelinjer for å undersøke hvilken rolle OPN i regulering metastaser. Den Colo-205-cellelinjen ble transfektert med en OPN-antisens eukaryot plasmid for å inhibere OPN protein ekspresjon i denne cellelinje. SW-480-celler ble transfektert med en OPN-sense eukaryot plasmid, slik at OPN proteinet er uttrykt i denne cellelinje.
Etter celle transfeksjon, Colo-205-OPN-antisens-transfekterte celler i klynger (data ikke vist ), homotypisk adhesjon ble forbedret i disse cellene i forhold til Colo-205-pcDNA3.1 (+). Men vedheft evnen ble svekket i SW-480-OPN-sense celler, og mobiliteten ble forsterket i disse cellene uttrykker OPN (data ikke vist). Samtidig undersøkte vi heterotypic vedheft med ecv304 som målceller, heterotypic heft evne ble svekket i Colo-205-OPN-antisense celler og ble forbedret i SW480-OPN-sense celler. Disse resultater antyder at OPN reduserer homotypisk adhesjonen mellom CRC-celler og forbedrer adhesjonen heterotypic evnen mellom CRC-celler og endotel-celler.
invasjon og metastase er viktige egenskaper av ondartede svulster. Hele prosessen med metastaser inkluderer angiogenese vedheft, degradering, bevegelse, og reattachment [21]. Vedheft faktorer er hovedsakelig involvert i prosessen. OPN er trolig en av mange prognostiske faktorer knyttet metastasering av CRC.
På grunn av OPN er homotypisk heft evne svekkes i CRC celler og cellene til å fravike hovednettstedet lettere, og går inn i blodsirkulasjonen. Det første trinnet av metastaser er utbruddet. Imidlertid CRC-celler er lettere å invadere ECM (den ekstracellulære matriks) når heterotypic adhesjon forbedres. Disse to trinnene er viktig for metastaser i ondartet kreft.
GJIC har vært spekulert på å være en nødvendig, hvis ikke tilstrekkelig, biologisk funksjon av celler metazo i regulering av vekstkontroll, differensiering og apoptose av normale stamceller [22 ]. Intercellulær kommunikasjon i mange organer opprettholdes via intercellulære gap junction kanaler bestående av connexins, en stor proteinfamilie med en rekke isoformer. Dette GJIC tillater forplantningen av aksjonspotensialer (f.eks i hjerne, hjerte), og overføring av små molekyler som kan regulere cellevekst, differensiering og funksjon. Den sistnevnte har vist seg å være involvert i kreftvekst: redusert GJIC ofte er assosiert med økt tumorvekst eller med prosessen med de-differensiering. Fluorescens omfordeling etter fotobleking (FRAP) ble vedtatt å observere utvinning av fluorescens intensitet i bleket cellene og derfor å estimere inter kommunikasjon ved gap veikryss.
I vår studie, fluorescens omfordeling etter fotobleking ble svekket i SW-480 – OPN-sense celler. GJIC funksjonen ble hemmet og signalutveksling ble svekket, slik at disse kreftcellene er lettere løsrevet fra primære lesjoner for å starte det første trinnet av metastase forresten.
Basert på studier av korrelerte mekanismer mellom uttrykk for OPN og metastasering i kombinasjon med de aktuelle litteratur, konkluderte vi med at en potensiell mekanisme for OPN fremme CRC levermetastaser er som følger: CRC-celler uttrykker OPN, homogeniteten tilslutning evne er nedsatt, hvis funksjon GJIC inhiberes, er evnen til invasjon og bevegelse øker, noe som gjør det enkelt for CRC cellene til å fravike primær lesjon, få til sirkulasjon og innlede prosedyren for metastasering. På samme tid, på grunn av OPN, ekspresjonen av CD44, en metastase relatert faktor, er også økt. Den heterotypic adhesjonen mellom CRC-celler, ECM og vaskulær endotelial celle er forbedret. I løpet av portvenen refluence lar OPN kreftceller til å invadere perifere kar, settling ned og planting i leveren. Videre ble reseptorene til OPN, CD44v6 og inte αv funnet i leveren. Samspillet mellom ligander og reseptorer kan forklare leveren-klynge av CRC-celler.
Disse resultater antyder at OPN er en av de viktige faktorer i tumorinfiltrasjon og metastase. Effekten på homotypisk og heterotypic heft i CRC cellene i OPN er viktig i prosessen med levermetastaser.
Takk
Vi er takknemlige til Dr. Jiaping Peng og Dr. Xiaoming Fang for deres uvurderlige vitenskapelige råd i løpet av studien.
