Abstract
Cell-celle adhesjon er avgjørende i å gi og opprettholde flercellet struktur og signaloverføring mellom cellene. I huden, for å avbrudd desmosomal regulert intercellulære tilkobling kan føre til forstyrrelser av keratiniseringen og hyperproliferative sykdommer, inkludert kreft. Nylig viste vi transgene mus overekspresjon desmoglein 2 (Dsg2) i overhuden utvikler hyperplasia. Etter microarray og genet nettverksanalyse, vi demonstrere at Dsg2 forårsaket en dyptgripende endring i transkriptomet av keratinocytter
in vivo Hotell og endret en rekke gener viktige i epitelial dysplasi inkludert: kalsiumbindende proteiner (S100A8 og S100A9), medlemmer av cyclin proteinfamilien, og cystein protease inhibitor cystatin A (CSTA). CSTA er deregulert i flere hudkreft, inkludert plateepitelkarsinom (SCC) og tap av funksjon mutasjoner føre til recessive hud skjørhet lidelser. Microarray resultatene ble bekreftet av qPCR, immunoblotting, og immunhistokjemi. CSTA ble oppdaget på høyt nivå gjennom de nyfødte mus epidermis, men dramatisk redusert med utvikling og ble påvist hovedsakelig i de differensierte lag. I menneskelige keratinocytter, knockdown av Dsg2 av siRNA eller shRNA redusert CSTA uttrykk. Videre siRNA knockdown av CSTA resulterte i cytoplasmisk lokalisering av Dsg2, opprørt cytokeratin 14 farging og reduserte nivåer av desmoplakin i respons på mekanisk strekking. Begge knockdown av enten Dsg2 eller CSTA indusert tap av celleadhesjon i et dispase-baserte analysen og effekten var synergistiske. Våre funn her tilbyr en ny vei av CSTA regulering involverer Dsg2 og en potensiell crosstalk mellom Dsg2 og CSTA som modulerer celle adhesjon. Disse resultatene støtter de siste menneskelige genetiske funnene videre at tap av funksjon mutasjoner i CSTA genet resultat i hud skjørhet på grunn av svekket celle-celle adhesjon: autosomal-recessive eksfoliativ iktyose eller acral peeling hud syndrom
Citation. Gupta A, Nitoiu D, Brennan-Crispi D, Addya S, Riobo NA, Kelsell DP, et al. (2015) Cell Cycle- og kreft-assosiert Gene Networks aktiveres ved Dsg2: Bevis for cystatin A Deregulering og en potensiell rolle i celle-celle adhesjon. PLoS ONE 10 (3): e0120091. doi: 10,1371 /journal.pone.0120091
Academic Redaktør: Johanna M. Brandner, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, TYSKLAND
mottatt: 05.09.2014; Godkjent: 02.02.2015; Publisert: 18 mars 2015
Copyright: © 2015 Gupta et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under vilkårene Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden blir kreditert
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer. Microarray data ble sendt til Gene Expression Omnibus (Tiltredelse Nummer: GSE62814)
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (Mahoney, R01AR056067; Riobo, RO1 GM088256).. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
desmosomes er store vedheft strukturer lokalisert til celle-celle grenser epitelceller der cytoplasmatiske plakk komponenter, inkludert plakin (desmoplakin) og keratin familier, montere med armadillo (plakoglobin og plakophilins) og cadherin (desmogleins og desmocollins) proteinfamilier [1,2]. Disse klebe strukturer er viktig ikke bare for opprettholdelse av cellestrukturen og integritet, men også for utvikling av vev og morfogenese. Mutasjoner innenfor desmosom er den underliggende årsaken til mange hud skjørhet lidelser med eller uten hjerte abnormiteter [3]. I tillegg desmosomes også tjene som «signal sentre» som spiller en aktiv rolle i moduler flere viktige veier, inkludert Wnt /β-catenin og T-celle faktor /lymfoid Enhancer faktor [4]. Montering bevis støtter deres deltakelse i modulerende celle skjebne og overlevelse. Desmosomale proteiner kan aktivere intracellulær signalisering gjennom modulering av ekspresjonsnivåer og mønstre, som begge kan dramatisk endre adhesjonen og celle proliferasjon [5,6]. I interfollicular epidermis, er Dsg2 vanligvis uttrykt ved meget lavt nivå og begrenset til den proliferative basalcellelaget. Nylig har vi utviklet en transgen musemodell overekspresjon desmoglein 2 (Dsg2) i huden [5]. Vi er fast bestemt på at ektopisk uttrykk for Dsg2 aktiverer flere vekst- og overlevelses trasé som kan fremme kreftutvikling og progresjon. Selv om Inv-Dsg2 transgene mus utviklet forstadier papillomer og var mer utsatt for kjemisk indusert kreftutvikling, den mekanismen som Dsg2 induserer disse endringene er fortsatt uklart. Vi har nylig vist at Dsg2 assosierer med caveolin-en gir en mekanisme for å regulere mitogene signalisering og modulering av celleoverflate-presentasjon, som begge kan bidra til malign transformasjon og tumorprogresjon [7]. I denne rapporten, søkte vi å identifisere gener som er knyttet til hyperproliferative fenotype ved å sammenligne ekspresjon av Inv-profilen Dsg2 transgene mus med cDNA fra villtype-mus som en kontroll, via mikromatriseanalyse.
Nærmere bestemt har vi funnet Dsg2 ble knyttet til regulering av cystatin A (CSTA, mus Csta1-3), også referert til som stefin A, cystein protease inhibitor, keratolinin eller «epidermal SH-proteasehemmer», et medlem av den typen en cystein proteasehemmere [ ,,,0],8-11]. CSTA uttrykkes hovedsakelig i epitel og lymfevev hvor det beskytter proteolytisk prosessering av cytoplasmatiske og cytoskeletal proteiner ved å hemme katepsin, de papain-lignende, lysozomal cystein proteaser [12-14]. det er derfor ingen overraskelse at CSTA har en rekke biologiske funksjoner, inkludert en bakteriostatisk rolle for å beskytte vev fra cysteinproteaser som er produsert av invaderende patogener [15]. i huden, ble CSTA opprinnelig identifisert i forhomede celleveggen og er foreslått å spille en rolle i barrierefunksjon rettet mot støv midd proteaser [16]. Flere nylig, oppdaget vi at mutasjoner i
CSTA
genet er den underliggende genetiske årsaken til hud skjørhet tilstand kjent som eksfoliativ iktyose med nedsatt celle-celle adhesjon i de lavere lag av epidermis [17]. I tillegg kan recessive CSTA mutasjoner være assosiert med en acral peeling hud tilstand [18,19]. Her beskriver vi en rekke studier som undersøker Dsg2 og CSTA i keratinocyte vedheft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle dyreforsøk ble godkjent av etikkomiteen som driver henhold til Thomas Jefferson universitetssykehus Intern Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjente protokoller (642B og 642D).
Generering av Inv-Dsg2 transgene mus
tidligere etablerte transgene mus som uttrykker Dsg2 i differensierings~~POS=TRUNC lag av epidermis under kontroll av den involucrin (Inv) promoter (Inv-Dsg2) [5]. Kort fortalt musen
Dsg2
.
Flag
cDNA ble subklonet inn i pH3700-PL2 foreldre vektor epitop på
ikke anbefale restriksjonssete nedstrøms av involucrin promoter. Genotyping og karakterisering av transgene mus som ble tidligere beskrevet i detalj [5]. Wild-type kontroll og Inv-Dsg2 transgene kullsøsken av ca 6 uker gammel ble brukt til disse studiene.
Microarray analyse
Mus hudvevet, lagret i RNAlater (Qiagen, Valencia, CA), ble pulverisert med en dødelig og støter og homogenisert i en Dounce homogenisator. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) og RNeasy (Qiagen) ifølge forhandlerens protokoller. Komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert fra 2 pg RNA ved å bruke heksa-tilfeldige primere og M-MLV-revers transkriptase (SuperScriptIII System, Invitrogen). Førstetråds-cDNA ble syntetisert fra 5 ug total RNA (2 vill-type og transgene 2 prøver) ved revers transkripsjon og brukes til å generere biotin-merket cRNA ved
in vitro transkripsjon
. De mikromatriser ble deretter behandlet ved hjelp av streptavidin-Alexa 647 konjugert. Etter hybridisering, vasket lysbilder ble skannet for å skaffe fluorescerende signaler for hvert sted med en ScanArray XL-5000 confocal scanner (PerkinElmer, Boston, MA). For å kvantifisere fluorescensstyrkene for hver flekk på tabellen, 16-bits bilder, ble analysert ved Quant Array 3.0-programvaren (PerkinElmer). Etter bildebehandling, ble data analysert av GeneSpring 11,5 programvare (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Bakgrunnsverdier basert på signalintensitet rundt hvert sted ble trukket, og resultatene ble normalisert ved quantile normalisering og bruker baseline transformasjon median på alle prøvene. Microarray data ble sendt til Gene Expression Omnibus (Tiltredelse Nummer: GSE62814)
Volcano tomter ble brukt til å identifisere differensielt uttrykte gener (større enn eller lik 2 ganger og statistisk signifikans av p 0,05) ved bruk av Student
t
-test (uparet) og ingen flere tester korreksjoner. Den forskjellig uttrykt genet Listen ble lastet inn Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA 9,0) programvare for nettverksanalyse.
RT-PCR og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyse av
Dsg2
,
Csta1
,
Csta2
,
Csta2l1
, og
Csta3
cDNA ble syntetisert fra 1 mikrogram av RNA med høy kapasitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, California). Exon-spenner qPCR primere ble utformet som følger:
Dsg2
, frem 5′-GAG GAA TTG AGT GCA GCA CAT AC-3 «, reverse 5»-CTT GCT TCC ACC GTC AAG G;
Csta1
: fremover 5′-TGC TAA CAA GGT CAG ACC TCA G-3 «, reverse 5′-CCA TGG TTT TGT CAG TCT GGT-3»;
Csta2
: fremover 5’TGA ATG Tags GAC GTG GTT GC-3 «, reverse 5′-GGG ATC AGG TCA AGT TGG AA-3»,
Csta2l1
: fremover 5′ TGT CTT AAG TGG TAT TTC CAG TGA AAA CGA C-3 «, reverse 5’CAT CTC TTT ACA ATG GGG GGG GG-3»;
Csta3
: fremover 5’GCC CAT CAA TGA GTC AAG AAA-3 «, reverse 5′-GGC CTC TGA AGA CTT TCA TGT G-3» og for intern kontroll
GAPDH
: frem 5′-CCC ATC ACC ATC TTC CAG GAG CGA-3 «, reverse 5′-TCC ACC CTT CAA GTG GGC CCC-3». cDNA ble amplifisert i PCR-buffer som inneholdt 1 enhet Taq DNA-polymerase (Qiagen), 200 uM dNTP, 1 enhet Q-oppløsning, 0,5 pM av primere. Amplifikasjon av hver av de cDNA var en innledende denatureringstrinn ved 94
° C i 3 minutter og 35 sykluser med denaturering ved 94
° C i 30 sekunder, annealing ved 58
° C i 1 minutt og forlengelse ved 72
° C i 1 minutt, fulgt av den siste syklus av forlengelse ved 72
° C i 7 min.
genekspresjon nivåene ble analysert ved QRT-PCR-analyse ved å bruke 1 pl av cDNA og SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) i henhold til en standard amplifikasjonsprotokoll på en ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems).
GAPDH
uttrykk ble brukt til å normalisere data. Primersekvensene ansatt for QRT-PCR for
Dsg2
,
Csta1
,
Csta2
,
Csta2l1
, og
Csta3
er inkludert ovenfor.
Immunohistochemistry og Immunoblotting
Med mindre annet er angitt er alle kjemikalier var fra enten Sigma (St. Louis, MO) eller Fisher (Waltham, MA). For histologi, ble hudvev fast ved romtemperatur over natten i en 10% formalinoppløsning. Vev ble dyppet i parafin, seksjonert (4 mm), montert på glassplater, og farget med Hematoxylin og eosin. For farging, ble formalin-fikserte paraffin-innleiret vev oppvarmet til 60 ° C i 1 time og deparaffinized i xylen (3 ganger), 100% EtOH (2 ganger), 95% EtOH (2 ganger), 75% EtOH, 50% EtOH, og H
2o [20]. Antigener ble hentet av mikrobølger i Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA-oppløsning, 0,05% Tween 20, pH 9,0). Vevene ble deretter blokkert i blokkeringsbuffer (5% normalt geiteserum, 1% BSA, 0,1% Ttriton X-100 i PBS) i 1 time ved romtemperatur (RT) og deretter inkubert med Cystatin A-antistoff (1:50; AB4065, Millipore , Temecula, CA), Dsg2 AB10 (1: 10.000) og Flag M2 (1: 500, Sigma) i blokkeringsbuffer, over natten ved 4
° C. Vevene ble vasket i PBS (2 ganger) og inkubert med Alexa Fluor anti-kanin IgG-488 og anti-mus IgG 594 (1: 400; Molecular Probes, Oregon) i 1 time ved romtemperatur i mørket. Kjerner ble farget med DAPI (1: 1000, Sigma) i 1 minutt ved romtemperatur i mørket, etterfulgt av vasking i PBS
For Western blot, hudvev ble flash-frosset i flytende nitrogen, pulveriseres med dødelig og pistill. og homogenisert i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoksykolat, 0,1% SDS, protease-inhibitor (PI) cocktail (Roche Diagnostics, Indianapolis, iN), 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og fosfatase-inhibitor cocktail (Fisher). protein~~POS=TRUNC konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP ble bestemt (Pierce BCA-kit, Pierce Biotech, Rockford, IL) og immunblotting ble utført som beskrevet tidligere [21] med ~ 20 ug protein i hvert kjørefelt . løses over 4-20% SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) Primære antistoffer brukt var: Flag M2 (1: 2000, Sigma), Actin (1: 5000, Calbiochem, San Diego, CA); Cystatin A (1: 1000, Millipore, Temecula, CA), human Dsg2 (1: 100; monoklonalt Ab 10D2), DSP I /II (1: 250, Clone 5-11F [22]); vinculin (1: 1000; . Abcam, Cambridge, UK) Signaler ble påvist ved tilsetning av sekundært antistoff HRP-konjugert (1: 5000; Jackson Labs, Bar Harbor, ME), visualisert ved chemiluminescence (ECL, Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey). Alternativt kan signaler ble påvist ved å bruke spesifikke geite-anti-muse-IR-Dye 800 CW (1:. 20 000; LI-COR Cat 926-32210) eller geite-anti-kanin IR Dye 800 CW (1:. 20 000; LI-COR Cat 926 -32211) og videre analysert og kvantifisert ved Odyssey IR bildesystem (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE). Western blot analysert av chemiluminescence ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare utviklet ved National Institutes of Health (nettsted: https://rsbweb.nig.gov/ij/). Statistisk analyse ble undersøkt ved hjelp av Student
t
test med en
p
verdien av 0,05 ansett som signifikant (*
p
0,05; **
p
0,01; ***
p
. 0,001), hvor tallfestede målinger fra tre uavhengige eksperimenter ble normalisert til Actin lasting kontroll
Cell kultur og siRNA knockdown av
Dsg2 Hotell og
CSTA
A431 (epidermoid carcinoma fra American Type Culture Collection, Bethesda, MD) celler ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (P /S). A431-celler ble dyrket til ~ 60% konfluens på 6-brønners kulturskåler, serum-sultet i 4 timer med 0,5% FBS og 1% P /S før inkubering med 100 nM egge siRNA kontroll (D-001810-10, Dharmacon, Thermo Scientific, Lafayette, CO) eller samlet siRNA til
Dsg2 product: (L-011645-00, Dharmacon) og
CSTA product: (L-010020-00, Dharmacon) ved hjelp Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA) og Opti-Mem-medium (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Celler ble returnert til normalt medium etter 18 timer og inkubert i 72 timer. Celler ble lysert i 9 M urea deretter preparert for Western blot-analyse som beskrevet ovenfor. HaCaT celler ble behandlet med siRNA ved omvendt transfeksjon som per produsentens instruksjoner ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX. For immunfluorescens, ble dyrkede celler fiksert i MeOH -20 ° C i 10 minutter og permeabilisert i 1% TX-100 i 5 minutter. Etter uspesifikke nettstedene ble blokkert, ble cellene inkubert med antistoff 10D2 for Dsg2 eller CSTA antistoff (se ovenfor).
I noen eksperimenter, celler behandlet med scrRNA eller
CSTA
siRNA ble sådd på BioFlex 6-brønners plater som inneholder en fleksibel gummimembran belagt med pronectin (Flexplates, Flexcell International, Hillsborough, NC, USA). Celler ble dyrket til ~ 80% konfluens, og monolagene ble understreket mekanisk med en Flexcell FX-4000-strekksystem (Flexcell International, Hillsborough, NC, USA) som tidligere beskrevet i detalj [17] (Blaydon et al., 2011). Celler ble strukket i 0-4 timer og deretter fiksert og farget for Dsg2 (1: 500; Kanin AB10, [23]), og keratin 14 (1: 100; Klon LL001, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Celler ble også lysert i Laemmli buffer for Western blotting.
knockdown av Dsg2 av shRNA
A431 celler stabilt transfektert med pSuper Retro-puro vektor som bærer spesifikke shRNA rettet mot nukleotider til GFP (shGFP) eller Dsg2 (shDsg2) ble etablert som tidligere beskrevet i detalj [24]. Kort fortalt, to oligonukleotider ( «5-GAT CCC CGA GAG GAT CTG TCC AAG AAT TCA AGA GAT TCT TGG ACA GAT CCT CTC TTT TT-3 «og» 5-AGC TTA AAA AGA GAG GAT CTG TCC AAG AAT CTC TTG AAT TCT TGG ACA GAT CCT CTC GGG-3 «) ble syntetisert, glødet, og ligert inn pSuper Retro-puro (Oligo-Engine, Seattle, WA). Retrovirus produksjon og infeksjon ble utført i Phoenix celler. Transfekterte A431 celler ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS og puromycin (2 mikrogram /ml).
Dispase baserte celledissosiasjon analysen
For å vurdere virkningene av cystatin A og Dsg2 på celle adhesjon, ble Mock og shDsg2 A431-celler sådd ut på seks-brønners kulturskåler ved en tetthet på 2 x 10
5-celler /brønn og ble deretter behandlet med 50 nM egge siRNA kontroll eller siRNA til
CSTA
som beskrevet over. Etter 72 timer ble cellene vasket med Hanks Balanced Salt Solution og inkubert med dispase (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) i 5 min. Den løftede celle Arkene ble utsatt for dispase baserte dissosiasjon assay ved å pipettere fem ganger ved anvendelse av en 1 ml pipette. Cellefragmenter ble fiksert i 3% formalin løsning og farget med krystallfiolett. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger. Vi merker oss her, at disse forsøkene ble utført uten å legge ekstra kalsium.
Resultater
Microarray analyse sammenligne villtype og Inv-Dsg2 transgen muse huden
Vi viste nylig at overekspresjon av Dsg2 under kontroll av promoteren involucrin i huden av transgene mus (Inv-Dsg2) resulterte i hyperplasi av epidermis og forbedret følsomhet overfor tumorfremkallelse [5]. Videre Inv-Dsg2 transgene musene også godartede papillomer og var mer utsatt for kjemisk indusert totrinns hud kreftutvikling. Disse funnene bedt oss om å utføre en sammenligning av genuttrykk profiler mellom Inv-Dsg2 transgene og kontroll mus. For å unngå bakgrunns svingninger og variasjoner, våre Dsg2 gene mus krysset tilbake minst 5 generasjoner C57BL6 bakgrunn. Vi har valgt å bruke full tykkelse huden for å observere eventuelle endringer i genuttrykk i dermis som kan ha blitt introdusert av de overliggende epidermis. Således tilbake hud fra kullet ved 6 uker etter fødselen ble anvendt
H . E-fargede vevssnitt av transgene hudprøver oppviste omfattende hyperplasi sammenlignet med den til villtype hud (S1A fig.). Ekspresjon av transgenet ble bekreftet ved Western blot-analyse, hvorved flagget antistoffet detektert den 160 kDa Dsg2.Flag protein i transgene, men ikke i villtype-mus hud (S1B fig.). I tillegg immunofluoresence mikroskopi bekreftet ekspresjon av Flag-tagged Dsg2 protein i overfladiske epidermis av den transgene, men ikke villtype-mus (S1C fig.). Disse resultatene viser, som tidligere beskrevet [5], som ektopisk ekspresjon av Dsg2 induserer epidermal hyperplasi uten å endre den endogene ekspresjon av Dsg2. I både mus og humane interfollicular epidermis, er Dsg2 uttrykkes ved signifikant lavt nivå i basalcellelaget, og at ekspresjonsnivået avtar ytterligere med utvikling [5,25]. Hos voksne vev, er bare en liten signal detekteres når eksponeringsnivået er forbedret. Forsøk ble gjort for å co-immunfarging for Dsg2 og CSTA bruke anti-Dsg2 antistoffer. Men på grunn av naturen av disse antistoffene, lav uttrykk for endogen Dsg2, og bakgrunnen blir for høy (data ikke vist), valgte vi å bruke anti-Flag antistoffer for å påvise Flag-merket Dsg2 transgenet. Dsg2-Flag er uttrykt i den overfladiske epidermis under kontroll av promoteren involucrin av de transgene mus som tidligere er beskrevet i detalj [5].
Total RNA prøver isolert fra huden av to transgene og to villtype mus ble brukt til å generere biotinmerkede prober cRNA og deretter hybridisert til oligonukleotid- mikromatriser representerer 21,619 musegener (fig. 1A). En sammenligning av de gjennomsnittlige genet signalene viste omtrent 492 gener endret ved mer enn to ganger i respons til Dsg2 ekspresjon (Tabell 1 og Tabell S1). En vulkan tomten avslørte at 275 transkripsjoner ble oppregulert og 217 nedregulert med statistisk signifikans (p 0,05, vises i rødt, figur 1B.). Disse 492 gener modulert i respons til Dsg2 ble videre analysert ved oppfinnsomhet Analysis Program (Qiagen), som beskriver de 5 beste genet nettverk i henhold til deres grad av relevans til nettverket Kvalifiserte Molekyler i vår datasettet (S2 tabell). Denne analysen viste sterk tilknytning til cellesyklus (S2A fig.) Og Kreft Regulering baner (S2B fig.). Et betydelig antall av gener involvert i ulike faser av cellesyklusregulering ble oppregulert (rød) som reaksjon på Dsg2 (og videre oppsummert i Tabell S3). Tilsvarende mange gener som er involvert i tumordannelse ble også oppregulert i respons til Dsg2 inkludert, den mitotiske sjekkpunkt protein kinase (
BUB1
) (S1 Table) og distal-mindre 4-homeobox (
DLX4
) og kreft mottakelighet protein (
BRCA1
) (S2B fig.). Interessant imidlertid to medlemmer av gaffelhode familien av transkripsjonsfaktorer,
FOXC1 plakater (-9,0 ganger) og
FOXC2 product: (-11,7 ganger), ble nedregulert i Inv-Dsg2 transgene mus. FOXC2, spesielt, induserer epitelial-mesenchymale overgang og spiller en rolle i øyelokk lukke [26,27]. Knockdown av FOXC2 uttrykk i brystkreftceller opphever sin metastatiske potensial [28], impliserer sin rolle i kreftutvikling. Rollen til FOXC2 i huden homeostasis og kreftutvikling er ikke kjent.
(A) Total RNA ble isolert fra huden av 2 villtype og 2 Inv-Dsg2 transgene mus, revers transkribert, biotinmerket og brukes på en mus cDNA microarray. Den dendogram (varme kart) viser at 492 gener var enten oppregulert (rød /oransje) eller nedregulert (blå /grønn) i transgene (T1 og T2) og kontroll (W1 og W2) mus. (B) Volcano plottet viser log2 (endring) i x-aksen versus-log10 (p-verdi) i y-aksen. Poengene har en fold-endring mindre enn 2 (log2 = 1) er vist i grått. De vertikale grønne linjer avgrense hvor foldendring tilsvarer 2 (høyre linje) eller lik-2 (venstre linje). Den horisontale grønne linjen avgrenser hvor p-verdien er 0,05, med poeng over streken med p 0,05 og poeng under streken med p 0,05. Avbildet i rødt er genene som viser en større enn 2 ganger endring med en p 0,05 i transgene epidermis sammenlignet med kontroll. Pilene viser gener av interesse. (C) Kvantitativ sanntids RT-PCR-analyse viser et gjennomsnitt på 34,33 ± 1,32 gangers økning i Dsg2 RNA-ekspresjon i Inv-Dsg2 transgene (Tg) sammenlignet med villtype (WT). I tillegg RNA uttrykk for transgene i forhold til kontroll var:
Csta1
, 113,24 ± 2.23;
Csta2
, 1227,04 ± 1,26;
Csta2l1
, 1,11 ± 0,47;
Csta3
, 26,97 ± 0,44 (Bar = gjennomsnitt ± SD, (* p 0,05, ** p 0,01; *** p 0,001;. Students
t
test)
Tabell 2 viser de ti beste genene som ble modulert i respons til Dsg2. Denne listen består av koder for proteiner involvert i tumordannelse inkludert L-treonin dehydrogenase (
TDH
, 39,2 ganger ) og cystein-rik sekretorisk protein (
CRISP3
, 8,8 ganger) det mest overraskende funn var den forbedrede uttrykk for CSTA (
Csta1
, 18,4 ganger;.
Csta2
, 5,7 ganger, og
Csta3
, 12,4 ganger) og flere medlemmer av S100 familie av kalsiumbindende proteiner (
S100A8
, 7,9 ganger;
S100A9
, 4,1 ganger, og
S100A4
, 2,3 ganger) (figur 1B,.. tabell 3) S100A8 og S100A9 proteiner danner et kompleks som kalles calprotectin, som viser antimikrobiell aktivitet og er vist å beskytte epitelceller mot invaderende patogener [29]. Videre genekspresjon av fire medlemmer av cyclin familien av proteiner ble også øket, inkludert cyklin A2 (
Ccna2
, 5,8 ganger), cyklin B2 (
Ccnb2
, 5,4 ganger), cyklin B1 (
Ccnb1
, 4,6 ganger), og cyclin E1 (
Ccne1
, 2,6 ganger), mens uttrykk for ett medlem, cyclin A1 (
Ccna1
, -2,0 fold ) ble funnet å bli redusert (tabell 3). Den cyclin familien av proteiner som regulerer cyklin-avhengige kinaser og regulerer progresjon av celler gjennom cellesyklusen [30]. Dette funnet er i tråd med våre tidligere resultater som viser at Dsg2 forbedrer celleproliferasjon. CSTA har vist seg å ha anti-apoptotiske aktivitet [31], er oppregulert i flere epitel-avledede maligniteter, inkludert SCC [32], og er mutert i arvet celle-celle adhesjon defekt epidermale lidelser [17-19]. Videre inhiberer katepsiner CSTA [33,34], som også er deregulert i hudkreft [35-37]. For disse grunner, fokuserte vi resten av denne studien på CSTA. Den funksjonelle relevansen av S100 og cyclin proteiner vil bli undersøkt i detalj i en fremtidig studie.
Bekreftelse på Dsg2-modulering av CSTA uttrykk
De microarray resultatene ble bekreftet ved å undersøke ekspresjon av muse-mRNA CSTA (1, 2, 2L1 og 3) ved hjelp av RT-PCR (S3 fig.) og real-time qPCR (fig. 1C). Først ble totalt RNA isolert fra huden av to individuelle representative villtype og Inv-Dsg2 transgene mus, ble cDNA generert og anvendt som et templat for PCR bekrefter oppregulering av
Dsg2
,
Csta1
,
Csta2
, og
Csta3
i transgene i forhold til å styre mus (S3 fig.). Ingen endring i RNA uttrykk ble observert med
Csta2l1 Hotell og
GAPDH
. Csta2l1 er høyt uttrykt i føtal lever, benmarg, og milt og er her brukt som en negativ kontroll for hud [38]. RT-PCR data ble ytterligere validert av sanntids qPCR ved hjelp av hud biopsier fra tre villtype og tre transgene mus (Fig. 1C). Igjen, oppregulering av
Dsg2 plakater (34,33 ± 1,32) ble observert i huden fra transgene mus i forhold til huden fra kontrolldyrene. Ved sanntid qPCR, observerte vi en økning i
Csta1 plakater (113,24 ± 2.23),
Csta2 plakater (1227,04 ± 1,39), og
Csta3 plakater (26,97 ± 0,44) , men ikke
Csta2l1 plakater (1,11 ± 0,47). Med unntak av
Csta2l1
, alle endringer fra transgene sammenlignet med kontrollprøver var statistisk signifikante. Interessant, foldendring forskjellen oppnås ved sanntid qPCR var vesentlig annerledes enn innhentet fra microarray analyse. Det er ikke uvanlig, og er blitt observert i andre systemer [39]. I sammendraget, bekreftet qPCR analyse microarray data som viser at ektopisk uttrykk for Dsg2 i epidermis forårsaket en økning i RNA uttrykk for mus
CSTA
familie av proteiner og at dette forsterkes uttrykket er regulert av overekspresjon av Dsg2 i huden.
Deretter hud lysater fra nyfødte og voksne kontrollmus (n = 3 hver) ble immunoblottet for CSTA avslørende høyt nivå i nyfødt hud, men dramatisk redusert i voksen hud (fig. 2A), bekreftende med tidligere observasjoner [40]. Interessant, observerte vi både cytoplasma og kjernefysiske farging for CSTA hos nyfødte mus huden ved immunfluorescens (Fig. 2B). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i CSTA nivå mellom villtype og Inv-Dsg2 transgene nyfødte mus (ikke vist). Imidlertid, siden CSTA var lav i huden av voksne mus, ektopisk ekspresjon av Dsg2 dramatisk forbedret CSTA nivå (Fig. 2C). Flagget antistoffet detektert Flag-tagged Dsg2 protein i transgene, men ikke villtype mus (Fig. 2C). Lignende resultater ble observert ved hjelp av Dsg2 spesifikt antistoff 10D2 viser at ektopisk uttrykk for Dsg2 i overfladiske epidermis endret ikke den endogene Dsg2 nivå (data ikke vist). På grunn av beskaffenheten av antistoffene, var vi ikke i stand til å utføre co-farging for Dsg2 og CSTA. Men forholdene ble optimalisert for å immunfarging for the Flag-merket Dsg2 (anti-Flag antistoffer) og CSTA (Fig. 2D). I Dsg2 Tg hud, ble CSTA uttrykt i celler, uavhengig av transgene uttrykk, således som tyder på en ikke-autonome effekt. Farging for CSTA ble også påvist i corneocyter av villtype mus og økte i transgene mus (Fig. 2D). Selv CSTA ikke ble oppdaget av Western blot hjelp totale hud lysatene, kan vi ikke utelukke at det i forhomede konvolutt, kan CSTA være svært tverrbundet og dermed resistente mot lysering i SDS /DTT lysebuffer.
(A ) Western blot analyse av hud lysatene fra tre nyfødte og tre voksne C57BL6 mus viser høy uttrykk for CSTA hos nyfødte, men nesten umulig å oppdage i voksen hud. Aktin ble anvendt som en kontroll for lik belastning. (B) Immunofluorescent flekker bekrefter Western blotting resultater som viser høy grad av CSTA i nyfødt villtype mus hud. Forstørret bilde i innfelt viser cytoplasma samt atom farging for CSTA. (C) Western-analyse for Dsg2 og CSTA i voksen villtype og Inv-Dsg2 transgene mus hud. Resultatene viste uttrykk for Flag-merket Dsg2 og CSTA i transgene, men ikke villtype mus. Actin viste lik belastning. (D) Immunofluorescens ble utført på voksen hud av villtype og transgene mus avslørende økte nivåer CSTA i transgene hud. Kjerner ble kontra farget med DAPI (blå).
I motsetning til i menneske med bare en
CSTA
genet, er det flere
CSTA
gener hos mus [41 ]. Mens microarray analyse oppdaget tre
Csta1
,
Csta2 Hotell og
Csta3
, det er ukjent hvilken isoform er uttrykt i mus huden. Videre er det ikke kjent hvilken muse CSTA er anerkjent av de kommersielt tilgjengelige antistoffer siden epitoper for disse ikke er kartlagt. Men spekulerer vi at antistoffene kan gjenkjenne alle Cstas på grunn av høy sekvens homologi mellom menneske og mus og mellom de forskjellige muse isoformer.
Dsg2 modulerer CSTA uttrykk
For å finne ut om Dsg2 modulerer menneskelig CSTA i keratinocytter, ble A431 celler behandlet med siRNA spesifikk for Dsg2 (siDsg2), CSTA (siCSTA) eller egge RNA (scrRNA). Tre dager etter transfeksjon med scrRNA og siCSTA, Western blot-analyse viste at knockdown av CSTA ikke påvirker ekspresjonen av Dsg2 (S4 fig.). I motsetning til en dramatisk reduksjon av Dsg2 ved siDsg2 men ikke scrRNA, resulterte i liten, men reproduserbar reduksjon av CSTA (Fig. 3A, B). For ytterligere å bekrefte effekten av Dsg2 på CSTA uttrykk, ble stabile A431 cellelinjer med knockdown av Dsg2 bruker kort hårnål RNA (shRNA) etablert [24]. Immunoblotting avslørte at Dsg2 var signifikant nedregulert i shDsg2 celler, sammenlignet med shGFP celler (Fig. 3C, D). * P
