Abstract
Cellular heterogenitet er en integrert del av kreftutvikling og progresjon. Progresjon kan være forbundet med fremveksten av celler som viser høy fenotypisk plastisitet (inkludert «de-differensiering» til primitive utviklingsland), og aggressive atferdsegenskaper (inkludert høye tumorigene potensialer). Vi har observert at mange biomarkører som brukes til å identifisere kreftstamceller (CSC) kan merke celleundergrupper i en avansert klinisk stadium av lungekreft (ondartet pleural effusjon, eller MPE). Dermed kan CSC-biomarkører være nyttig for live sortering funksjonelt forskjellige celle undergrupper fra enkelte svulster, noe som kan gjøre det mulig etterforskerne å hone på det molekylære grunnlaget for funksjonell heterogenitet. Vi viser at CD44
hi (CD44-høy) cancer-celleundergrupper vil vise høyere klonal, kolonidannende potensial enn CD44
lo-celler (n = 3), og er også tumorigen (n = 2/2) når transplantert mus xenograft modell. De CD44
hi undergrupper uttrykke ulike nivåer av embryo (de-differensiering) markører eller kromatin regulatorer. I arkiv lungekreft vev, ALDH markører co-lokalisere mer med CD44 i plateepitelkarsinom (n = 5/7) enn Adeno karsinom (n = 1/12). OED kreftceller og lungekreft cellelinje (NCI-H-2122) utviser kromosomavvik og 1p36 sletting (n = 3/3). Siden MIR-34a kart til 1p36 sletting området, ble lave MIR-34a uttrykk nivåer påvist i disse cellene. Den kolonidannende effektivitet av CD44
hi-celler, karakteristisk egenskap av CSC, kan inhiberes ved mir-34a erstatning i disse prøvene. I tillegg til svært tumorigent CD44
hi cellene er anriket for cellene i G2 fasen av cellesyklus
Citation. Basak SK, Veena MS, Oh S, Lai C, Vangala S, Elashoff D, et al. (2013) The CD44
høye Svulstfremkallende Delsett i Lung Cancer Biospecimens er beriket for lav MIR-34a Expression. PLoS ONE 8 (9): e73195. doi: 10,1371 /journal.pone.0073195
Redaktør: Mauricio Rojas, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 02.05.2013; Godkjent: 16 juli 2013; Publisert: 03.09.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Institutt for indremedisin, UCLA og Robert W. Green, Head and Neck Surgical Oncology Program ved UCLA. Tilskuddene midlene ble brukt til reagenser og lønn støtte av de involverte i studien forskere. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tumor heterogenitet kan være. karakterisert ved differensiell ekspresjon av celleoverflatemarkører, genetiske og epigenetiske forskjeller, og /eller forskjeller i nøkkelsignalmolekyler eller effektorer av cellefunksjon. Cellular heterogenitet kan være preget av forskjeller i de funksjonelle (atferds) egenskaper av celler (clonogenicity, kolonidannelse evne i myk agar, tumorigenesis etc.). Mens mange undersøkelser har valgt å knytte celleoverflatemarkører i kreftceller som finnes på den primære svulsten nettstedet med CSC-atferdsegenskaper, observerte vi at klinisk fremskredne stadier er spesielt beriket for celle undergrupper peiling CSC-biomarkører. Dermed postulerte vi at avansert stadium sykdommen ikke forbyr (og kan være en fordel) for å knytte spesifikke biomarkører med funksjonelle fenotyper. Følgelig vår tilnærming til biologiske funn understreker designe relevante funksjons- bioassay å karakterisere både celle fenotyper og molekylærbiologi underliggende startfasen, samt tumorprogresjon.
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødelighet hos både menn og kvinner; med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for 80-85% av tilfellene [1]. For å forstå biologien som ligger under denne høy dødelighet, har vi valgt et avansert stadium sykdommen modell (OED). Lungekreft pasienter med OED har betydelig høyere dødelighet enn de uten MPE, eller de som har cytologisk negative effusjon [2] – [4]. Dermed er OED-tumorbyrde yret med biologiske egenskaper som reduserer overlevelsen av kreftpasienter. Viktigere er OED bulk svulst befolkning består av heterogene subpopulasjoner [5]. Dels kan dette heterogenitet være preget av biomarkører som typisk assosieres med funksjoner av CSC (CD44, ALDH, cMET, CD166, MDR-1, uPAR, PTEN, oktober-4, BMI-en, hTERT, SUZ12, EZH2).
et mål med denne studien var å finne ut om vi kan identifisere en svulst celle undergruppe at du får en økt kompetanse for svulst forplantning og vedlikehold, og til å begynne å karakterisere de molekylære basene for disse egenskapene. Studerte vi først CD44 som en seleksjonsmarkør for celler anslått til å ha høy karsinogent potensial fordi det tidligere har identifisert CSC i forskjellige epiteliale kreftformer, inkludert bryst [6], hode og nakke, [7], [8], bukspyttkjertel [9], [10], og prostata maligniteter [11] – [15]. CD44 uttrykkes sterkt i forskjellige lungekreft subtyper, [16], og dens ekspresjon er relatert til dårlig prognose i pasienter [17]. Nyere studier i NSCLC cellelinjer også preger CD44
hi celler som CSC [16].
OED-primærkulturer inneholde en undergruppe av celler som sterkt uttrykker CD44 (CD44
hi). Når disse cellene er sortert fra OED-primærkulturer, viser de høye karsinogent potensial, inkludert engraftment av svulster i NOD /SCID IL2γR
null mus i begrensende fortynninger av celletransplantasjon. Disse egenskapene er karakteristisk for CSC. Fraksjoner av CD44
hi-celler er assosiert med forhøyet ekspresjon av en annen CSC-markør assosiert med xenobiotisk metabolisme, ALDH. Den CD44
hi /ALDH
hi fenotype er tydelig i både skvamøs celle (SCC) og adenokarsinom (AC) av lungene, noe som tyder på at tilsvarende markeringsprofiler kan merke adferds aggressive (høyt tumorigen) cellefraksjoner over de forskjellige » linjene «(histopatologiske undertyper) av lungekrefttilfellene [18].
OED svulster ofte vise hyperploidy og kromosomavvik. FISH-analyse påvises en felles spesifikk abnormitet i 1p36 region, hvilket antyder at denne regionen kan spille en viktig rolle i å bidra til aggressiv adferdsmessige egenskaper. Den 1p36 regionen har tidligere blitt identifisert for inneholder locus som koder for tumor suppressor mikroRNA (MIR-34a). Tap av MIR-34a uttrykk er innblandet i kreft progresjon [15], [19]; denne studien legger til at bevis. Meget tumorigene CD44
hi celler uttrykker lav MIR-34a, og MIR-34a erstatning hemmer koloni dannelsen av CD44
hi celler i myk agar. Cellesyklus analyse av CD44
hi celler indikerte at disse svært tumorigene celler ligge i G2 fasen av cellesyklus.
Materialer og metoder
Ondartet pleuravæske (OED) innsamling, bearbeiding og Cell Culture
Alle deltakerne i studien gjennomgikk skriftlig informert samtykke ved en prosess godkjent av Institutional Review board (IRB) på Veterans Affairs-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS) og studien ble godkjent av IRB -VAGLAHS. OED prøver (M-1, M-2 og M-3) ble samlet fra pasienter ved Veterans Affairs-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS). Celler dyrkes i nærvær av 20-30% MPE (primær dyrkningsmedium eller PCM) som tidligere beskrevet [5]. (Støtte Informasjon S1 og S2).
Kontroll etablerte cellelinjer
To etablerte cellelinjer GM 05399 (normal fibroblast) og H2122 (lungekreft) ble brukt i studien. Den fibroblastcellelinje GM 05399 ble hentet fra Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ). Cellelinjen ble avledet fra en 1-åring hvit mann. Cellelinjen opprettholdes i vårt laboratorium i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) i nærvær av 10% føtalt bovint serum (FBS) [20]. Den H2122 lunge adenokarsinom cellelinje ble generert av Adi Gazdar fra en ondartet pleural effusjon, og kjøpt fra Ilona Linnoila og Herb Oie fra NCI. Det ble deretter satt inn ATCC (NCI-H2122 [H2122] ATCC® CRL-5985 ™) [21]. Cellelinjen opprettholdes i vårt laboratorium i RPMI-1640 medium i nærvær av 10% FBS [22], [23]. Begge cellelinjene er offentlig tilgjengelig
Antistoffer
Følgende antistoffer ble brukt for flowcytometri FACS /Sorter. Mouse anti-Human IgG2b CD44-FITC, (BD Biosciences # 555478); FITC Mus IgG2b κ isotypekontrollantistoff, BD Biosciences # 555742); PE-merket muse-anti-human CD44, (BD Pharmingen # 555479); PE Mus Mus IgG2b κ isotypekontrollantistoff, BD Biosciences 555743. Anti-CD166-FITC (Musemonoklonalt; IgG1 Setrotech # MCA 1926F, primær umerket anti-cMET (mus IgG2a, Abcam # 49210), anti-uPAR (mus IgG, Santa Cruz Biotech # 13522), sekundært antistoff som brukes for studien brukte var: Goat (Fab «) 2 anti-mus IgG (H + L) -PE-Cy.5.5 (Caltag laboratorier # M35018)
Immunohistochemistry (. IHC)
Primær human lungekreft vev (plateepitelkarsinom: SCC og adenokarsinom. AC) eller human lunge kontroll vev (human normal alveolær og bronchiolar vev) ble innhentet fra UCLA Avdeling for patologi kjernefasilitet xenografttumorer avledet fra CD44
hi celler injisert i NOD /SCID (IL2rγ
null) mus ble kirurgisk fjernet, skåret i 0,3-0,5 mm stykker og festet i etanol (Fisher Scientific) eller Z-fix (Anatech, MI). for IHC, ble §§ 3-5 μ seksjoner kuttet og deparaffinized og behandlet for antigen gjenfinning [5] og farget for markør uttrykk. Utgangspunktet vevssnitt ble farget med enkel markør antistoff farging (CD44 eller ALDH). Når forholdene ble optimalisert for enkelt antigen farging deretter den doble antigen farging (CD44 og ALDH) av vevssnitt ble oppnådd. Parafininnstøpte vevssnitt ble deparaffinized og vannes ut. Etter antigen gjenfinning (10 mM natriumcitratbuffer, pH 6,0 ved hjelp av damp 25 minutter) og blokkering, ble endogene peroksydaser quenchet (3% H
2o
2 på 1% natriumazid med PBS i 30 minutter i romtemperatur) . Lysbilder ble inkubert med primært kanin polyklonale antistoff mot ALDH1A1 (Abcom Inc. Cat ab51028 #), over natten ved 4 ° C. Platene ble vasket med PBS og inkubert med seg + System-HRP Labelled Polymer-anti-kanin (DAKO Cat # K4003) i 30 minutter. Platene ble inkubert i DAB (Vector Peroxidase Substrate Kit # SK-4100 med nikkel Sol) i 10-20 minutter, og deretter ble objekt vasket 5 minutter 3 ganger med PBS. For dobbelt farging med CD44 (R 20 celler ble tellet ved slutten av 10 dagers dyrking. Resultatene er uttrykt som prosent kloning effektivitet.
spheroid Dannelse i Soft Agar analysen
Ordnet CD44
Hei og CD44
lo celler ble sådd ut i 1000 celler /brønn i tre paralleller i seks-brønners kulturplater inneholdende 0,35% toppagar lagt over 0,5% basis agar (DNA Grade) inneholdende PCM. Kolonier ble talt på 3 uker etter plating, representerer resultatene betyr fra tre uavhengige eksperimenter.
tumorigenicity i NOD /SCID (IL2rγ
null) Mus
Alle mus arbeide relatert protokoll for studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved UCLA /VAGLAHS. CD44
hei og CD44
lo celler ble sortert etter FACS og injisert på ulike celle doser (300 /mus, 3000 /mus og 30000 /mus) på høyre og venstre flanke henholdsvis i NOD /SCID (IL2γ
null) mus i 100 ul saltvann. Musene ble overvåket for tumorvekst ved begge kantene. Resultatene er representert som gruppe gjennomsnitt av tumorvolumet, som beskrevet [24].
MIR-34a Transfeksjon Studier
For å analysere virkningene som MIR-34a har på kolonidannelse effektivitet i myk agar assay de CD44
hi celler ble transient transfektert med enten MIR-34a (AM17100, Applied Biosystems /Ambion) eller negativ kontroll (kryptert) oligonukleotid. Tilsvar CD44
lo celler ble transient transfektert med enten anti-MIR-34a-hemmer (# AM17000, Applied Biosystems /Ambion) eller negativ kontroll anti-Mir oligonukleotid (# AM17010, Applied Biosystems /Ambion). Transfeksjon ble gjennomført med CD44
hi eller CD44
lo celler ved hjelp Lipofectamin 2000 (Invitrogen) i 6 brønners plater med 50.000 celler /brønn med 100 pmol av Mir, anti-MIR og kontroll egge /oligonukleotider. Etter 2 dager med transfeksjon ble cellene samlet opp og analysert med hensyn på bløt agar-kolonidannende effektivitet som beskrevet ovenfor.
fluorescerende in situ hybridisering (FISH) Analyse av MPE eksempel
FISH-studiene ble utført i henhold til etablert protokollen [25]. LSI 1p36 Proben ble merket med spektrum oransje og LSI 1q25-proben ble merket med spektrum grønt og hybridisert til metafase marginene som tidligere beskrevet [25], [26]. Kort sagt ble metafasemarginer stilles ved standardprosedyrer cytogenetisk. Merkede prober ble hybridisert og vaskinger ble utført under identiske betingelser for stringens. Objektglassene ble hybridisert ved 37 ° C over natten med 1-4 ng av sonden, 50% formamid, 10% dekstran, 2 x SSC, og 50 ng Cot en DNA for å undertrykke repetitive sekvenser. Metafase kromosomer ble kontra med 4,6-diamidino 2-phenylindole (DAPI) i Vectashield løsning (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Karyotypering av kromosomer ble utført i henhold til etablerte protokoller.
Omvendt Transcriptase- Kvantitativ PCR (RT-qPCR) Påvisning av mir-34a i OED Prøver
Total RNA ble isolert fra prøvene ved hjelp TRIzol. MIR-34a ble målt ved Step One Plus Real-time PCR system (Applied Bio-systemer, CA) ved hjelp av Taq-Man mikroRNA Analyser (Applied Biosystems, Foster City, California) og normalisert ved RNU48 nivåer. 3 pl av 20 ng /ul av total RNA ble brukt til å utføre revers transkriptase (RT) reaksjon (30 minutter ved 16 °, 30 min ved 42 ° C, 5 min ved 85 °) ved anvendelse av 10 mM dNTPs, MultiscribeRT enzym, 10 x RT buffer, RNase-inhibitor, Taqman RT primer og vann i totalt reaksjonsvolum på 15 ul. For qPCR, 10 pl av 2 x Taqman universell PCR masterblanding (Ingen AmpErase UNG fra ABI), 7 pl vann, 1 ul av Taqman primer (MIR-34a og RNU48) og 2 ul for cDNA for hver reaksjon ble benyttet, etter amplifikasjonsprotokoll (10 min ved 95 grader, 15 sek for 95 grader, 60 sek på 60deg for 40 sykluser) ved hjelp av Step One Plus real-time PCR system (Applied Biosystems, CA).
Surface Marker Merking og Cell Cycle Analysis
Celler ble farget med CD44-FITC og PI (propidium jodid) for cellesyklus analyse (modifisert fra UCLA /Flow-cytometri kjernefasilitet protocol). I korthet, en x 10
6 enkeltcellesuspensjon ble vasket med PBS /2% PCM, pelletert, og merket med mus anti-human CD44-IgG2b-FITC-antistoff (BD Biosciences # 555478) i 45 min. ved romtemperatur i mørke, ble kontroll-antistoff anvendt som negativ kontroll. Prøvene ble resuspendert i 1 ml buffer inneholdende 10 mikrogram /ml PI og 11,25 Kunitz enheter av RNase og inkuberes i minst 30 minutter ved 4 ° C i mørke og analysert på strømningscytometer i løpet av 30 min av PI farging .
Statistical Analysis
data er representert som gjennomsnitt ± SD og ble analysert med tosidig
t
test av Excel og gjentatt tiltak variansanalyse (ANOVA) ble brukt for sammenligning mellom grupper av SAS 9.3. En
P
verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
CD44 uttrykk Profilen til OED Avledet tumorceller
OED-tumorceller kan isoleres. og utvidet i kortsiktige primærkulturer i nærvær av OED væske og autologe ikke-kreftceller [5]. Heterogene populasjoner, inkludert kandidat CSC, er til stede i MPE- svulst befolkningen, som reflekteres av den variable uttrykk for CSC-biomarkører: c-MET, uPAR, MDR1, CD166, CD44, og ALDH. Derfor, i tillegg til
intra
tumor morfologisk heterogenitet, er det forskjeller i overflaten CD44 merking intensiteter, og disse forskjellene kan utnyttes til å skille celle undergrupper [5].
primærkulturer fra tre forskjellige MPE-prøver (M-1, M-2 og M-3), inneholder morfologiske varianter (flat, oval og avrundede former) ved lysmikroskopi (figur 1 A, B). Ved 4
th uke med kultur, hefttumorcellene viser en mer homogen morfologi mønster i kultur (figur 1C). Dyrkede celler jevnt uttrykkelig CD44 i alle tre tumorprøver (figur 1D), men merking intensiteten er svært variabel både mellom og innenfor den samme prøven. Følgelig, sammenlignet med celler merket med sekundært antistoff alene, prøvene er 96%, 99% og 98% positiv for CD44; imidlertid Mean fluorescensstyrkene (MFI) av CD44 merking er henholdsvis 10 861, 5295 og 2120. Således kan overflaten merking intensiteten av CD44 ekspresjon varierer fra 2 til 5 ganger blant tumorprøver, og det er vanligvis en stor variasjon i gjennomsnittsoverflate CD44 merking
innenfor
individuelle prøver.
tumor celler fra M-1, M-2 og M-3. (A) 100 x (2-3 uker). (B) 400 x (2-3 uker). (C) senere stadier av kultur 100 x (6-10 uker). (D) CD44- FACS uttrykk mønster og MFI. (E) Sortering av CD44
hei og CD44
lo celler (5-10%). De sorterte cellene CD44
hei og CD44
lo ble vasket og sådd ut i PCM for 2-3 dager å evaluere sine morfologiske forskjeller. (F) Morfologi av sortert CD44
hi celler og sortert (G) CD44
lo cellene var lik (100 ×). Renheten av CD44
Hei og CD44
lo celler var ≥98%, som avslørt av post slags analyse (data ikke vist).
Fravær av morfologiske forskjellene mellom CD44
hei og CD44
lo Cells
OED-primærkulturer få en mer homogen morfologisk mønster av vekst over tid. For å avgjøre om små forskjeller i kultur morfologi kunne skille CD44
hei fra CD44
lo kulturer, M-1, M-2 og M-3 prøver ble merket med anti-CD44 antistoff og sortert etter FACS, med porter satt til 5% av cellene ved høy CD44 markøren og lav CD44 markør uttrykket (fig. 1E). Renheten av CD44
Hei og CD44
lo celler var ≥98%, som avslørt av post slags analyse (data ikke vist). De sorterte cellene CD44
hi (figur 1F) og CD44
lo (figur 1G) ble vasket og sådd ut i PCM for 2-3 dager å evaluere sine morfologiske forskjeller. Disse studiene tyder på at det ikke er skille forskjellen i kultur morfologi forbundet med overflate CD44 uttrykk.
CD44
hi Cells vise Høy Colony Forming Evne
For å undersøke om CD44
hi cellene er funksjonelt forskjellig fra de CD44
lo celler i kolonidannende effektivitet, vi sortert og dyrket i disse undermengder fra de tre prøvene (M-1, M-2 og M-3). 100-500 celler av CD44
hi eller CD44
lo celler ble sådd ut i individuelle brønner i 12-brønners plater. Selv om vi ikke er i stand til å oppdage signifikante forskjeller i innledende plating effektivitet, men vi ser at CD44
hi celler er mer kompetente på å danne holoclones enn CD44
lo celler (
t
test og ANOVA: P 0,05) (figur 2A). Dermed en iboende biologisk forskjell mellom CD44
hei og CD44
lo celler synes å en iboende differensial kompetanse i forming holoclones.
De sorterte cellene CD44
hei og CD44
lo fra OED prøvene ble analysert i tre paralleller for sin (A) klonal effektivitet (Eksempel M-1: kolonier CD44
hei = 35,8 (SD = 5,04) vs CD44
lo = 21,7 (SD = 6,2) (P = 0,03) Prøve M-2 kolonier CD44
hei = 59,8 (SD = 3,2) vs CD44
lo = 40,6 (SD = 4,1) (P = 0,003), Sample M-3 kolonier CD44
hei = 53,4 ( SD = 5,3) vs CD44
lo = 33,9 (SD = 3,6) (P = 0,006)); Gjennomsnittlig effekt av CD44
hi versus CD44
lo er 17,6 (95% KI: 8,31, 26,89: p = 0,015). (B) kolonidannende evne i myk agar. (Prøve M-1: kolonier CD44
hei = 16,6 (SD = 1,1) vs CD44
lo = 8 (SD = 1,1) (P = 0,0006) Prøve M-2: kolonier CD44
hei = 27 (SD = 7) vs CD44
lo = 12 (SD = 3) (P = 0,02), Sample M-3: kolonier CD44
hei = 24,3 (SD = 6,1) vs CD44
lo = 12,6 (SD = 2,5) (p = 0,03)). Gjennomsnittlig effekt av CD44
hi versus CD44
lo er 11,8 (95% KI: 3,41, 20,14; P = 0,026). Kolonner, mener fra tre uavhengige forsøk; SD, *,
P
0,001, sammenlignet med CD44
lo grupper, (student
t
test). (C) soft agar kolonier avledet fra CD44
hi celler (100 ×) og (D) CD44
lo celler (100 ×). (E) Expression profilen til BMI-en, hTERT, SUZ12, EZH2 og oktober-4 i sorterte CD44
Hei og CD44
lo celler ble analysert ved revers transkriptase-qPCR. I prøve M-3 bare BMI-1 uttrykkes på et høyt nivå i CD44
hi populasjonen enn den CD44
lo-cellepopulasjon. I prøven M-2 svakt høyere uttrykk av hTERT i CD44
hi celler enn CD44
lo celler. Den CD44
hi befolkning på prøve M-1 uttrykt høyt nivå av BMI-en, hTERT, SUZ12, EZH2 og oktober-4, enn CD44
lo befolkningen.
CD44
hi Cells vise Høy spheroid forming Evne i Soft agar kulturer
en annen surrogat tiltak som vanligvis brukes for å karakterisere CSC er en differensial kompetanse på å danne «forankrings uavhengige» kolonier i myk agar [12]. CD44
hi og CD44
lo celler fra prøvene (M-A-1, M-10-26 og M-8-15) ble vurdert ved utsåing av de sorterte celler i agarose supplert med PCM. De CD44
hi celler fra alle tre prøvene jevnt utviser høyere spheroid formasjon effektivitet enn CD44
lo celler (
t
test og ANOVA: P 0,05) (figur 2B). De mer robuste CD44
hi kolonier er også kvalitativt skiller seg fra vestigial kolonier dannet av CD44
lo celler (Figur 2C versus 2D). Dermed CD44
hi celler har større kompetanse på å danne kolonier i soft agar enn CD44
lo celler avledet fra samme lungekreft biospecimen.
CD44
hi Cells Trinnløs Vis Molecular Funksjoner som karakter~~POS=TRUNC CSC
Markører som preger
kandidat
CSC (hTERT, SUZ12, oktober-4 uttrykk etc.) er tydelig i celle pellets isolert fra OED prøvene [5]; således, CSC er en sannsynlig komponent av OED-tumor blanding. Slike CSC markørene er variabelt består av embryonal eller polycomb proteinkomponenter og deres uttrykk kan forutsi merking av celle undergrupper som besitter høy tumorigen eller kolonidannende potensialer [27]. For å finne ut om disse
kandidat
CSC markører var begrenset til spesifikke CD44 sortert undergrupper, vi skjermet den CD44
hei og CD44
lo celle undergrupper for differensial mRNA uttrykk; RT-PCR forsterkning av BMI-en, hTERT, SUZ-12, EZH2 og OCT4 ble utført. Indeksert til beta-tubulin-mRNA, er det en markert variasjon i uttrykket av disse markørene innenfor CD44-sortert celleundergrupper (figur 2E). For eksempel er BMI-1 og hTERT mRNA mer sterkt uttrykt i CD44
hi-celler enn de CD44
lo celler i prøven M-3 og M-2 respektivt. Bare i prøven M-1, forventede fordelinger av CSC markører (høy BMI, hTERT, SUZ12, EZH2 og oktober-4) er tydelig i CD44
hi celler enn de CD44
lo celler.
disse resultatene indikerer at 1) molekylære markører som koder for modifiseringsmidler av kromatinstruktur eller embryonal gener kan være til stede i både sterkt tumorigene og ikke-tumorigene delmengder av individuelle lungecancercellepopulasjoner, og 2) at det er markert variasjon i den differensielle ekspresjonen av disse kandidat «CSC-biomarkører» i lungekreft biospecimens.
CD44
hi Cells danne svulster i NOD /SCID (IL2rγ
null) Mus
Som spesifikke molekylære markører kan ikke pålitelig differensiere tumorgene fra ikke-tumorigene celleundergrupper, kan vi skille disse undergrupper på grunnlag av atferdsmessige fenotyper? Den CD44
Hei og CD44
lo celle undergrupper fra enkelte tumorcellepopulasjoner konsekvent vise forskjeller i tilhenger holoclone og myk agar-kolonidannelse. En nøkkel eksperimentelle mål på «CSC», derimot, er ved påvisning av høyere karsinogent potensial i musemodeller. Det er vist at NOD /SCID (IL2rγ
null mus er følsomme modell for å evaluere for høyt tumorigene CSC- atferds fenotyper [16], [28]. For å underbygge observerte forskjellene i kolonidannende og spheroid forming evner CD44
hei vs CD44
lo celler med
in vivo
tumorigenesis undersøkte vi deres evne til å danne svulster i NOD /SCID (IL2rγ
null) mus.
Begrense fortynninger (30000 ; 3000; 300) av sortert CD44
hei og CD44
lo celler fra M-1 og M-2 MPES ble injisert i høyre og venstre flankene henholdsvis av NOD /SCID (IL2rγ
null) mus. CD44
hi tumorceller av M-1 prøven dannet tumorer i 3/3 mus ved både 30 000 og 3000 injisert celle doser, og i en av 3 mus injisert med 300 tumorceller (figur 3 A, B, C). den latenstid av svulster var 50-90 dager, 90-150 dager og 150 dager, til 30.000, 3.000 og 300 CD44
hi celler henholdsvis (figur 3E) Dermed kinetikken av svulstdannelse ved høyt tumorigent CD44
hi celler var doseavhengig. Den CD44
hi kreftceller fra utvalgs M-2 genererte svulster i 2 av 3 mus på 30.000 kreftceller med en latenstid på 90-100 dager, en høyere latenstid enn observert i CD44
hi cellene i prøven M -1 (Figur 3E). Derfor, selv om CD44
hi celler konsekvent viser høyere tumorigen potensialer enn CD44
lo celler av samme prøven, kan enkelte vevsprøver vise ulike vekstkinetikk i evalueringen av CSC eiendommer i atferds bioassay.
(A) tumorigenitet og latenstid på CD44
hi celler (M-1) injisert med på 30000; 3000 og 300 celler. Mus injisert med CD44
hi (høyre flanke) dannes svulster og CD44
lo celler ikke danner tumor (venstre flanke). Tallene (1/3, 2/3 eller 3/3) representerer antall dyr med tumor /gruppe på bestemte tidspunkt for måling. Periode av dager etter tumor-implantering er uttrykt langs X-aksen og tumorvekst volumet er uttrykt som mm
3 langs Y-aksen. Usorterte foreldreprimærsvulster implantert med 500.000 celle /mus viste ingen tumorvekst selv etter 3 måneder med tumorcelle implantasjon (data ikke vist) (B) mus med svulster på høyre flanke injisert med CD44
hi celler og ingen svulst det ble oppdaget på venstrekanten injisert med CD44
lo celler (C) resected svulster som dannes av CD44
hi celler i mus. (D) FACS analyse av enkeltceller hentet fra mus svulster avledet fra CD44
hi celler i M-1 OED prøven. Tumorcellene viser uttrykk for CD44, cMET, uPAR og CD166 markører. (E) tumorigenitet og latenstid på CD44
Hei og CD44
lo celler av prøvene M-1 og M-2 i NOD /SCID (IL2rγ
null) mus.
Spesielt, CD44
lo celler fra enten primær kultur gjorde
ikke anbefale danner svulster i venstre flankene av mus under hele overvåkingsintervall (fig. 3 B og E). Videre har vi også gjorde
ikke
observere svulstdannelse med injeksjon av 5 × 10
5
usorterte
celler, selv om denne populasjonen antagelig inneholdt ~5-10% (eller 25,000 50.000) CD44
hi celler. Dette interessant observasjon tyder på at CD44
hi celler kan bli utsatt for hemmende innflytelse mot tumorvekst av celler som har en lavere intensitet overflate CD44 uttrykk i samme svulst befolkningen.
For å teste om implantert CD44
hei celler bidratt til heterogene svulster (som tyder på multipotent differensiering), innpodet svulster generert fra CD44
hei fra M-1 celler ble utryddet, fordøyd, og marker celleoverflaten analyse ble utført ved FACS på enkeltcellesuspensjoner. Tumorceller forble sterkt positive for CD44 markøren, med 98,2% av cellene positive flekker, selv om CD44-MFI var enda høyere enn den opprinnelig implanterte cellene. Heterogenitet blant celler ble vist ved den variable ekspresjon av andre vanligvis forbindes CSC biomarkører (figur 3D), [cMET (40,4%), uPAR (47,6%) og CD166 (27,4%)]. Celler som bærer disse markørene ble også tidligere påvist i primær OED biospecimen prøver, med varierende fraksjoner [5].
