Abstract
Bakgrunn
epidermal vekstfaktor reseptor tyrosin kinase hemmere har vært effektive i ikke-småcellet lungekreft pasienter. Imidlertid ervervet resistens utvikler seg etter hvert hos de fleste pasienter til tross for en første positiv respons. Emerging bevis tyder på at det er en molekylær forbindelse mellom ervervet resistens og den epiteliale-mesenkymale overgang (EMT). N-cadherin er involvert i EMT og i den metastase av kreftceller. Her, analyserte vi N-cadherin uttrykk og funksjon i erlotinib bestandig lungekreft cellelinjer.
Metoder
H1650 cellelinjer ble brukt til å etablere underlinjen motstandsdyktig overfor erlotinib (H1650ER). Deretter induksjon av EMT ble analysert ved hjelp av farging og vestlige blotter i H1650ER celler. N-cadherin uttrykk i resistente celler ble undersøkt ved hjelp av FACS og western blot. I tillegg ble en invasjon analyse utført for å karakterisere de resistente celler. Effekten av N-cadherin på celleproliferasjon og invasjon ble analysert. Foreningen av N-cadherin uttrykk med EMT fenotype ble undersøkt ved hjelp av immunhistokjemisk analyse av 13 arkivert, lunge adenokarsinom vev, før og etter behandling med erlotinib.
Resultater
I H1650ER celler, N- cadherin uttrykk ble oppregulert, parallelt med redusert uttrykk for E-cadherin. Den markerte histologiske endringer og utviklingen av en spindellignende morfologi antyder at H1650ER celler gjennomgikk en EMT, ledsaget av en reduksjon i E-cadherin og en økning i vimentin. En endring i EMT status mellom pre-og etterbehandling ble observert i 11 av 13 tilfeller (79%). I biopsi av resistente kreftformer, ble N-cadherin uttrykk økt i 10 av 13 tilfeller. Induksjon av EMT var konsistent med aggressive egenskaper. Hemming av N-cadherin uttrykk av siRNA ble testet for å redusere spredning og invasjon av H1650ER celler
in vitro
.
Konklusjoner
Våre data gir bevis for at induksjon av EMT bidrar til ervervet resistens mot EGFR-TKI i lungekreft. Det tyder på at N-cadherin er en potensiell molekylære mål i behandling av NSCLC
Citation. Zhang X, Liu G, Kang Y, Dong Z, Qian Q, Ma X (2013) N-cadherin uttrykk er assosiert med Oppkjøp av EMT Phenotype og med Enhanced Invasion i Erlotinib-Resistant Lung Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (3): e57692. doi: 10,1371 /journal.pone.0057692
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu, Italia
mottatt: 22 juli 2012; Godkjent: 28 januar 2013; Publisert: 08.03.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Kontrakts tilskudd sponse: Science Research Project i Henan-provinsen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste årsaken til død på grunn av ondartede karsinomer, og bruk av tradisjonelle kjemoterapeutiske medikamenter mot lungekreft er bare moderat effektive [1] – [3]. Nylige fremskritt ved hjelp av tyrosin-kinase-inhibitorer som spesifikt blokkerer den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) har gitt en markert fordel for undergrupper av pasienter med tumorer havn spesifikke genetiske abnormaliteter [4] – [7]. Disse stoffene har ført til imponerende forbedringer i progresjonsfri overlevelse (PFS) sammenlignet med kjemoterapi. Imidlertid medikamentresistens til slutt fremkommer gjennom ulike mekanismer [8] – [12]. Dette ervervet resistens har blitt tilskrevet to hovedmekanismer. Én foreslått mekanisme er fremveksten av en ondartet klon med en sekundær mutasjon i EGFR kinase domene (T790M), som opphever den inhiberende aktiviteten av TKI [13] – [14]. En annen 15 til 20% gjennomgå forsterkning av MET-reseptor-tyrosinkinase, som aktiverer nedstrøms intracellulære signal uavhengig av EGFR [15] – [16]. I tillegg dukker opp tyder på at oppkjøpet av EMT fenotype er knyttet til ervervet resistens mot EGFR tyrosinkinasehemmere (TKI) [17] – [20]. EMT er karakterisert ved den kombinerte tap av epiteliale cellekoplings proteiner, slik som E-cadherin, og forsterkningen av mesenchymale markører, slik som vimentin. I EMT prosessen, epitelceller mister sine funksjoner, få mesenchymale egenskaper, og blir bevegelige og invasiv [21].
N-cadherin, en mesenchymale cadherin forbundet med EMT, er avgjørende i kreft progresjon, med respekt både metastaser og kjemoterapi motstand. E-cadherin og N-cadherin aksje mange strukturelle og funksjonelle egenskaper. Begge molekylene etablere kalsiumavhengig homofilist celle-celle adhesjon med sine ekstracellulære domener og er forbundet med catenins ved deres intracellulære domener [22]. Et trekk ved EMT er reduksjonen av celle-celle adhesjon, spesielt reduksjon av E-cadherin, som er avgjørende for å opprettholde den fenotype.
Denne studien evaluerte hvorvidt induksjon av EMT var relatert til ervervet resistens observert under erlotinib behandling og for å avgjøre hvilken rolle N-cadherin hos pasienter med NSCLC før og etter erlotinib behandling.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinje H1650 ble hentet fra den kinesiske Academy of Science (Shanghai, Kina) og ble dyrket i en fuktig 5% CO2 inkubator ved 37 ° C, i en DMEM løsning som inneholder 10% FBS, penicillin og streptomycin. Den erlotinib-resistent cellelinje (H1650ER) ble etablert ved å utsette parentale celler til økende konsentrasjoner av erlotinib, opp til 10 uM, i flere måneder. De resistente cellene ble kontinuerlig holdt i et medium som inneholder 10 mikrometer av erlotinib før hvert forsøk.
Reagenser og antistoffer
Mus anti-E-cadherin antistoff (sc-21791) og monoklonale anti- vimentin antistoff (SC-53464), muse-anti-β-aktin-antistoff (SC-47778), kanin anti-N-cadherin antistoff (SC-59987), fluoresceinisotiocyanat-konjugert geit-anti-mus-antistoff (SC-53800), og PE-konjugert geit-anti-mus-antistoff (SC-53464) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Akt (# 9272), S473 p-Akt (# 4060), EGFR (# 2239), og p-42/44 MAPK (# 4695) ble alle kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). EGFR [pY1068] (CB11007889) og kanin anti-Erk antistoff (CB1241938) ble kjøpt fra Affinity BioReagents (Golden, CO.).
Cell Proliferation Assay
celleproliferasjon analyser ble målt ved hjelp av celle~~POS=TRUNC leder-8-analyse (CCK-8; Dojindo Laboratories, Santa Clara, CA), som bruker den bioreduction av 2- (2-metoksy-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2, 4-disulfofenyl) -2H-tetrazolium-natrium (WST-8) til orange-farget formazan å måle cellenes levedyktighet. I korthet ble 100 ul H1650 og H1650ER celler, ved 2 x 10
4 /ml, ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av erlotinib i 96-brønners kulturplater i 48 timer. Deretter ble kulturmediet i en 96-brønners erstattet med friskt medium inneholdende 5% CCK-8-reagens; etter en time, ble absorbansen ved 450 nm målt, og verdiene ble korrigert ved å trekke fra absorbansen av kontrollbrønnene som ikke inneholdt celler.
Immunhistokjemi
Vev fra 13 tilfeller av lunge adenokarsinom, fra både før og etter erlotinib behandling, ble samlet mellom januar 2008 og juli 2011 i Henan provincal Folkets sykehus, og i parafin. Svulstvev lysbilder ble de-paraffinized og dehydrert ved hjelp Slide Brite (Sasco Chemical Group, Inc.). Antigen gjenfinning ble utført ved bruk av 0.05 M glycin-HCl-buffer, pH 3,5, inneholdende 0,01% (vekt /volum) EDTA, ved 95 ° C i 20 minutter og farget med et antistoff mot human E-cadherin, vimentin og N-cadherin, hvilken er samme som for in vitro analyser ,. Evalueringen av farging av disse delene ble gjort blind for to trente patologer som var uvitende om den kliniske bakgrunn av prøvene. Intensiteten av E-cadherin, vimentin og N-cadherin ble scoret og plassert inn i fire kategorier etter farging: 0 til 0%; 1 for 1-33%; 2 for 34-66%; og 3 for 67-100%. Alle de 13 menneskelige vev som er involvert i vår studie ble utført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen 1964 og alle senere revisjoner. Studien ble godkjent av etikkomiteen i Henan-provinsen folks sykehus, ble skriftlig informert samtykke innhentes fra alle fag.
Små interfering RNA (siRNA) Transfeksjon
Liten interfering RNA (siRNA) spesifikk for N-cadherin ble kjøpt fra Invitrogen. Sekvensen som brukes for N-cadherin interfererende RNA (siRNA) var 5′-CUAACAGGGAGUCAUAUGGUGGAGC-TdT-3 «. For å minimere ikke-spesifikke virkninger av interfererende RNA, ikke-målsøkende kontroll siRNA, også anskaffet fra Invitrogen, ble anvendt som negativ kontroll. SiRNA transfeksjon reagens (Invitrogen) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Forsøket ble gjentatt minst tre ganger, uavhengig av hverandre.
Matrigel Invasion Assay
Celler ble behandlet med N-cadherin-spesifikke sirnas i 48 timer for å knockdown N-cadherin uttrykk. Invasjonen ble observert ved bruk av transwell kultur setter inn med en diameter på 6,5 mm og 8 mikrometer pore filtre (Greiner Bio-One SAS, Courtaboeuf, Frankrike). Deretter, 3 x 10
4-celler i 100 pl RPMI-medium, med 1% FCS ble sådd ut i det øvre kammeret, og 600 ul RPMI med 10% FCS ble tilsatt til det nedre kammer. Celler ble tillatt å migrere i 24 timer ved 37 ° C. Etter fjerning av cellene på den øvre side av transwell ble celler på undersiden farget med 0,1% krystallfiolett-oppløsning (Becton Dickinson) og ble lysert med 10% eddiksyre for kvantifisering av densitometrisk måling ved 550 nm. Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Western Blot analyse
Proteiner fra cellelysatene, som ble fremstilt ved hjelp av RIPA-buffer [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% TritonX-100 0,1 % natriumdodecylsulfat og 1% Nadeoxycholate (pH 7,4)] supplert med protease-inhibitorer (1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 ug /ml pepstatin A, 10 ug /ml aprotinin og 5 ug /ml leupeptin), ble påvist ved hjelp av SDS-PAGE og deretter elektrooverført til Immobilon membraner (Invitrogen); disse membranene ble deretter undersøkt med spesifikke antistoffer. De sekundære antistoffer anvendt pepperrot-peroksidase-konjugert antistoff og membranen ble utviklet ved hjelp av en ECL-sett (Thermo). Dette eksperimentet ble gjentatt minst tre ganger, uavhengig av hverandre.
klonogene Assay
H1650 og H1650ER celler ble behandlet med 0,05% trypsin og sådd ut i 6-brønns plater ved 1 x 10
4 celler per brønn i 0,35% agarose i DMEM-medium lagvis på toppen av 0,7% agarose i det samme medium. Kolonidannelse ble observert etter 2-3 uker i kultur. Etter farging med 0,005% krystallfiolett, ble koloniene tellet under et mikroskop. Forsøk ble utført i tre eksemplarer. Antall celler ble talt og i gjennomsnitt for å bestemme kloningseffektiviteten.
Fluorescerende Immunocytochemistry
Celler dyrket på dekkglass ble vasket tre ganger med PBS. De ble fiksert i 10 minutter med kald metanol og vasket tre ganger med PBS. Objektglassene ble deretter blokkert i en oppløsning av PBS, 10% bovint serum, og 0,1% Tween 20 i 1 time. Cellene ble inkubert med primært antistoff til enten E-cadherin eller til vimentin ved 2 pg /ml i 1 time, og deretter ble cellene vasket to ganger med PBS, og inkubert med sekundære antistoff fortynnet i PBS, 5 eller 10% bovint serum, og 0,1% Tween 20. etter inkubasjon på dekkglass i 1 time ved 37 ° C glassene ble vasket som beskrevet ovenfor, og montert på lysbilder i medium som inneholder DAPI.
flowcytometrisystemer Analysis
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP var dissosiert bruker 0,05% trypsin; de ble vasket med PBS og 100 ul alikvoter av 10
5-celler i PBS ble plassert i 96-brønners V-bunn-plater og inkubert ved RT i 1 time med IgG. Cellene ble vasket to ganger med PBS. Etter de vaskinger med PBS, ble bundet antistoff detektert ved bruk av geite-anti-humant-PE eller geite-anti-human-Cy3, og analysert ved hjelp av FACS (LSRII, Becton Dickinson).
Statistical Analysis
SPSS 13,0 statistisk pakke (SPSS Inc., Chicago, IL) ble anvendt for dataanalyser. Signifikansen av forskjellen mellom kovariatene ble bestemt ved to-halet v2 test. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
1. Oppkjøpet av Erlotinib Resistance i H1650 cellelinjer Utstilt Variable signalveien Activation
erlotinib bestandig lungekreft cellelinje H1650 (H1650ER), opprinnelig stammer fra foreldre H1650 cellelinje, viste en økt avhengighet av EGFR system for vekst, som tidligere beskrevet [23]. Ved å dyrke denne cellelinje i nærvær av en konstant høy konsentrasjon av erlotinib over en periode på flere måneder, har vi vært i stand til å isolere cellelinjer som er i stand til å vokse ved erlotinib konsentrasjoner opp til 10 uM. Langsomme økning i vekst fant sted, noe som indikerer at en cellelinje motstandsdyktig overfor erlotinib hadde blitt utviklet. Vekstkurvene er vist i fig. 1A.
(A) Erlotinib-resistente celler (H1650ER) ble etablert av langvarig eksponering for økende konsentrasjoner av erlotinib. H1650 parentale celler og H1650ER ble sådd i 96-brønns plater ved en tetthet på 103 celler i 100 ul per brønn, dyrket over natten, og ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av erlotinib i 72 timer i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. De overlevende fraksjoner ble bestemt ved CCK-8-analyse. Absorbans ble målt ved 450 nm. Alle forsøk ble utført in triplo og S.D.s ble beregnet. *, P 0,01. (B) H1650 paren og H1650ER celler ble dyrket i 3 dager med eller uten erlotinib behandling (10 umol /L). Hel-cellelysater ble utarbeidet og analysert ved Western blot med de angitte antistoffer.
Deretter undersøkte vi mekanismen av resistens mot EGFR-TKI erlotinib. Ved hjelp av Western blot, analysert vi lysatene fra begge foreldre H1650 og H1650ER celler behandlet i 6 timer med erlotinib. Erlotinib behandling effektivt blokkert EGFR og Akt fosforylering i foreldre H1650 celler, men ikke i H1650ER celler. I disse resistente celler, P-Akt var oppregulert og ble vurdert som en kandidat til engasjement i mekanismen av ervervet resistens. I motsetning til den vedvarende Akt fosforylering, ble Erk fosforylering nedregulert ved erlotinib behandling i de resistente celler. Resultatene antydet at erlotinib-resistente celler vedtatt en ny mekanisme for å aktivere PI3K /Akt pathway (Fig. 1B).
2. N-cadherin Overuttrykte induserer Epitelial-mesenchymale Transition (EMT) i Erlotinib-resistente H1650ER Cells
For å identifisere markører for erlotinib motstand, sammenlignet vi genuttrykk i sammenkoblede foreldre og resistente cellelinjer. N-cadherin uttrykk ble sterkt forhøyet i H1650ER cellelinjer, som vi bekreftet av FACS og western blot. (Fig. 2A, B). Deretter morfologiske forskjeller mellom foreldre H1650 og de resistente H1650ER cellelinjer ble lett observeres (fig. 2C). På molekylært nivå, ble disse slående morfologiske egenskaper assosiert med en økt ekspresjon av mesenchymale protein vimentin og en redusert ekspresjon av epiteliale markør E-cadherin (fig. 2D, E). Sammen viser disse funnene at oppkjøpet av erlotinib motstand induserte molekylære endringer som var i samsvar med EMT.
(A) oppregulert uttrykk for N-cadherin ble oppdaget av FACS analyse. (B) Cellelysater fra H1650 og H1650ER celler ble oppdaget av Western blot; lysatene ble også vurdert for nivået av N-cadherin protein. (C) Et H1650 parentale celler og de resistente H1650ER celler ble vurdert for morfologiske endringer som er forenlig med en EMT. Skala barer: 25 mikrometer. (D) Redusert ekspresjon av E-cadherin og økt ekspresjon av vimentin ble detektert ved anvendelse av Western blot. (E) Immunofluorescens farging ble utført for å validere endringer av markørproteiner fra enten epiteliale eller mesenkymale fenotyper. Skala barer: 25 mikrometer
3.. Up-modulering av N-cadherin Expression og EMT ble funnet i biopsi av Resistente Kreft
Å identifisere uttrykk for N-cadherin og EMT biomarkører i EGFR-mutant NSCLC vevsprøver, utført vi biopsier på pasienter før erlotinib behandling og på den tiden at stoffet motstand ble kjøpt. Tretten pasienter hadde tumorvev tilgjengelig både før og etter TKI behandling. Karakteristikken av de 13 pasientene er vist i tabell 1. Immunhistokjemisk farging av vevsprøver ble brukt til å analysere proteinet ekspresjon av epiteliale markør E-cadherin og mesenchymale markør vimentin. Epiteliale markører ble påvist i nesten alle snitt fra NSCLC pasienter før erlotinib behandling, mens mesenchymale markører ble påvist i to av 13 tumorvev. I resistente kreftformer, ble ekspresjon av E-cadherin ble redusert i 5 av 13 biopsier. Videre, i 11 (84,6%) av 13 svulster, økt vimentin uttrykk etter erlotinib motstand ble kjøpt; således, totalt 11 prøver viste tegn til en EMT i respons til induksjon av legemiddelresistens.
Av det totale antallet tilfeller, 12 ut av 13 tilfeller var negative for N-cadherin med unntak av en adenokarsinom sak som hadde samlings N-cadherin uttrykk før erlotinib behandling. På den annen side, ble ekspresjonen av N-cadherin økning i 10 av 13 biopsier i resistente kreftformer. Immunhistokjemisk ekspresjon ble sammenfattet i tabell 2. Representative immunhistokjemiske stainings er vist i figur 3A.
(A) Tap av E-cadherin og en økning i både vimentin og N-cadherin ekspresjon ble observert i disse tumorene (nedre panel), sammenlignet med sine tilsvarende primære tumorer (øvre panel). Skala barer: 100 mikrometer. Forstørrelse, × 200.
4. Evnen til vekst og invasjon ble økt i H1650ER Cells
Induksjon av EMT var konsistent med aggressive egenskaper, for eksempel økt klonogene vekst, cellemotilitet og invasjon. For ytterligere å karakterisere H1650ER-celler, sammenlignet vi veksten av foreldre og resistente cellelinjer under anvendelse av en celle-telling assay; prosenten av levedyktige celler ble beregnet i forhold til de ubehandlede kontroller (fig. 4A). Vi utførte også en Matrigel-belagte kammer analyse som viste økt celle invasjon av H1650ER celler i forhold til foreldre celler (Fig. 4B). Videre fant vi at H1650ER celler fått en mer tumorigent fenotype, som dokumentert av økt klonogene vekst (Fig. 4C).
(A) Vekstkurver av H1650, H1650ER celler og alle andre celler ble utført i rutine kultur medium. Verdiene viser den midlere celleantall ± S.D. av triplikate brønner ved hver tids-punkt og representere tre individuelle eksperimenter. Feilsøylene viser SD; *, P 0,01; **, P 0,001. (B) Foreldre celler og H1650ER celler ble sådd ut på Matrigel-belagte polykarbonat filtrene til å analysere sine invasive potensialer. Skala barer: 25 mikrometer. Resultatene ble oppnådd fra tre forsøk, og stolpene representerer S.D.s; *, P 0,01. (C) parentale celler og H1650ER cellelinjer ble også dyrket i bløt agar for å teste deres evne til å danne kolonier etter 15 dagers inkubasjon. Original forstørrelse, × 10. Resultatene ble hentet fra tre eksperimenter.
5. Down-modulering av N-cadherin Expression i H1650ER Cells resulterte i redusert Invasion
H1650ER celler som uttrykker høye nivåer av N-cadherin var ned modulert av transient transfeksjon med siRNAs. Disse effektive sirnas produsert betydelige reduksjoner i N-cadherin-proteinet (figur 5A.) Sammenlignet med to kontrollcellelinjer: villtype-cellelinje og cellelinje transfektert med lipofektamin. På samme tid, N-cadherin stanse redusert AKT-fosforylering (Fig. 5B). Den nedregulering av N-cadherin-ekspresjon ble assosiert med redusert invasjon evner i Matrigel-belagte kammer sammenlignet med villtype-celler eller mock-transfekterte celler (fig. 5C).
(A) N-cadherin ekspresjon i H1650ER celler transfektert med sirnas rettet mot N-cadherin etter 48 timer. Proteinekspresjon målt ved flow-cytometri, en representant eksperiment. (B) Muligheten av invasjonen evalueres etter transfeksjon i 48 timer, ved anvendelse av en Matrigel-belagt kammeret og 20% FCS som kjemotiltrekkende. Skala barer: 25 mikrometer. (C) Endringer i AKT og fosfo-AKT kinase aktivitetsnivå ved N-cadherin siRNA stanse ved Western blot.
Diskusjoner
Her presenterer vi bevis som viser at ervervet resistens mot, EGFR-tyrosinkinase inhibitor, erlotinib i lungekreft er mediert av epitel-mesenchymale overgang (EMT). I denne studien, har vi funnet at H1650 lungekreftceller utviklet resistens mot erlotinib og gjennomgikk EMT fenotypiske forandringer, som var i overensstemmelse med redusert ekspresjon av epiteliale markør E-cadherin og økt ekspresjon av mesenchymale markører vimentin. Videre, i disse kliniske prøver, forbehandling kreft utstilt adenokarsinom histologi med bevart membran farging for E-cadherin, mens positive uttrykk for vimentin ble oftere anerkjent i avanserte, etter behandlingsperioden kreft, noe som indikerer at noen svulster gikk EMT. Spesielt våre data indikerer at EMT er assosiert med erlotinib motstand i NSCLC, som tidligere rapportert [24] – [25]
Aberrant uttrykk for cadherins eller cadherin svitsjing, er en av de viktigste hendelsene i EMT. i visse typer kreft [26] – [27]. Inaktivering av E-cadherin er en viktig begivenhet i tumorprogresjon [28] – [29]. Unormal aktivering av en cadherin, slik som N-cadherin, vil være en etterfølgende hendelse som fremmer angiogenese, hjernemetastaser, og er assosiert med dårlig overlevelse [30] – [31]. I vår studie, er N-cadherin nivå oppregulert i H1650ER celler. Immunhistokjemi viste også at N-cadherin uttrykk var signifikant oppregulert i tilbakevendende, etter behandlingsperioden lungekreft prøver som er samlet inn fra 10 av 13 pasienter. Videre siRNA-mediert knockdown av N-cadherin reduserer veksten og invasjonen av H1650ER celler
in vitro
. Den avvikende N-cadherin uttrykks status både
in vitro Hotell og
in vivo
lyser vår hypotese om at de viktige rollene til N-cadherin bor ikke bare i EMT, men også i tumormetastase og erlotinib motstand. Men mer expremental data har behov for å bekrefte vår hypotese. Som ikke alle lunge adenokarsinom er sentitve til TKI, som bare noen få cellelinjer er følsomme for TKI, slik som A549, PC9, HCC827, Calu-3, HCC4006 de skjuler den oppkjøpte mutasjon i EGFR-genet [21], [32 ] – [35]. I de begrensede sensitive cellelinjer, forskning på forholdet mellom N-cadherin og motstand er enda mindre. Yamauchi M, et al [32] fant også N-cadherin uttrykk var signifikant oppregulert i gefitinib bestandig PC9 /ZD celler som kjøpte resistent mutasjon T790M i EGFR-genet, andre celler som uttrykker N-cadherin ble funnet resistente overfor erlotinib (A549, H157 og H322), og at inhibering av N-cadherin ekspresjon ved hjelp av siRNA førte til en betydelig reduksjon i levedyktighet i A549 og H322-celler.
Andre forskere har rapportert at N-cadherin styrer motilitet og migrering av kreftceller ved å undertrykke Akt fosforylering [36] – [37]. Etter avtale med delansvar p-Akt aktivering i invasjonen av enkelte kreftcellelinjer som uttrykker N-cadherin, fant vi at erlotinib blokkert EGFR og ERK-fosforylering men ikke Akt fosforylering i erelotinib bestandig H1650ER celler. Vedvarende Akt fosforylering i erlotinib-resistente lungekreftceller tyder på at disse cellene innta en alternativ mekanisme for aktivering av PI3K /akt for å overleve [38] – [39]. Vi foreslår at Akt aktivering kan være knyttet til N-cadherin oppregulering, som ble støttet av resultatene at vedvarende Akt fosforylering i erlotinib-resistente lungekreftceller kan bli overvunnet ved en N-cadherin-inhibitor. Dette synes å være i samsvar med den aktuelle litteratur. Tanaka H et al. viser at N-cadherin stanse reduserer AKT fosforylering, mens N-cadherin overekspresjon øker AKT aktivitet i prostatakreftceller [40]; Tilsvarende Walle H et al. viser at N-cadherin uttrykket er assosiert med Akt aktivering og høy invasivitet i humane blærekreft cellelinjer [41]. Så det ser ut til at N-cadherin er ikke bare en biomarkør for TKI motstand etter eksponering for EGFR-hemmere, men også et fungerende molekyl.
I sammendraget, gir vår studie en ytterligere innsikt i de som er involvert i NSCLC og TKI mekanismer motstand, avslører at oppregulering av N-cadherin i H1650 ER celler fører til økt tumorcellemigrasjon, invasjon og karsinogent potensial. Våre resultater tyder også på at vedlikehold av EMT fenotype i H1650ER celler kan være relatert til den vedvarende ekspresjon av N-cadherin. Derfor kan N-cadherin tjene som et lovende nytt mål for behandling av kreft med ervervet motstand mot EGFR TKI. Fordi N-cadherin er uttrykt på celleoverflaten, vi grunner også om terapeutiske mål ved hjelp av N-cadherin-spesifikke monoklonale antistoffer ville ha effekt på disse kreftceller med ervervet resistens mot EGFR tyrosin kinase.
Takk
forfatterne er takknemlige for Zheng Wang (Department of Respiratory Medicine, Hefei No.1 Folkets sykehus, Hefei, Anhui, Kina) og Xiao Li (Department of Respiratory Medicine, Henan Provincial Folkets sykehus, Zhengzhou, Henan, Kina) for kommentarer til manuskriptet.
