Abstract
Kreft er ofte forbundet med kakeksi, kardiovaskulære symptomer og autonom feilregulering. Vi testet om ekstrakardiale kreft påvirker direkte innervasjon av venstre ventrikkel myokard. Mus injisert med Lewis lunge carcinoma celler (tumor gruppe, TG) eller PBS (kontroll gruppe, CG) ble analysert etter 21 dager. Hjertefunksjon (ekkokardiografi), serumnivåer av TNF-α og IL-6 (ELISA), strukturelle forandringer av kardiomyocytter og deres innervasjon (design-baserte stereology) og nivåer av innervasjon-relatert mRNA (kvantitativ RT-PCR) ble analysert. Gruppene var ikke forskjellige i forskjellige funksjonsparametere. Serumnivåer av TNF-α og IL-6 ble forhøyet i TG. Den totale lengden av aksoner i venstre ventrikkel ble redusert. Antall tette kjerne vesikler pr axon profilen ble redusert. Redusert myofibrillar volum, økt sarcoplasmic volum og økt volum av lipid dråper var et tegn på metabolske endringer i TG cardiomyocytes. I hjertet, ble mRNA nivået av nervevekstfaktor redusert mens det av β1-adrenerge reseptoren ble uforandret i TG. I stel ganglion av TG, ble mRNA-nivåer av nervevekstfaktor og neuropeptid Y reduseres og at av tyrosinhydroksylase ble økt. I sammendrag, induserer kreft et systemisk pro-inflammatorisk tilstand, en betydelig reduksjon i myocardial innervasjon og en katabolsk fenotype av kardiomyocytter i musen. Redusert uttrykk for nervevekstfaktor kan forklare den reduserte hjerteinfarkt innervasjon
Citation. Mühlfeld C, Das SK, Heinzel FR, Schmidt A, Post H, Schauer S, et al. (2011) Kreft induserer kardiomyocytt Ombygging og Hypoinnervation i venstre ventrikkel av musen Heart. PLoS ONE 6 (5): e20424. doi: 10,1371 /journal.pone.0020424
Redaktør: Gian Paolo Fadini, Universitetet i Padova, Italia
mottatt: 10 februar 2011; Godkjent: 26 april 2011; Publisert: May 26, 2011
Copyright: © 2011 Mühlfeld et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Excellence Cluster Hjerte System (WK) og av Verein zur Förderung der Krebsforschung i Gießen eV (CM). SD ble finansiert delvis av doktorgradsutdanningen molekylærmedisin ved Medical University of Graz. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft kakeksi er et komplekst klinisk syndrom manifestert som progressivt tap av kroppsvekt, med eller uten redusert matinntak, og det er korrelert med en dårlig prognose [1]. Den patologiske involvering av hjerte under disse betingelser, ble beskrevet som en ny enhet ved Burch et al. [2] og kalt den «cachectic hjerte». I tillegg til endringer i ECG og redusert hjertestørrelse i brystet x-stråler, blir cachectic hjertet karakterisert ved tap av epikardiell fett, økning i Lipofuscin granuler og reduksjon i kardiomyocytt tverrsnittsarealet til tross for generelt normal hjertefunksjon [3], [4] . I tillegg er proteinmasse redusert som følge av økt protein katabolisme [5].
Interessant, er kreft assosiert med funksjonelle endringer i det kardiovaskulære systemet, for eksempel redusert hjertefrekvens variasjon i akutte leukemi pasienter [6], økt hvile puls, redusert hvile blodtrykk og øket postural fall i blodtrykket i bronkial carcinoma pasienter [7], og økt forekomst av kardiovaskulær autonom insuffisiens som bedømt ved en rekke elektro og kliniske tester hos brystkreftpasienter [8], [9] . Nylig har en link vært en teori mellom kreft utmattelsessyndrom (en kombinasjon av åndenød, mosjon begrensning og muskelsvakhet) og klinisk ikke-overt hjertesvikt, noe som tyder på at trøtthet symptomer å oppstå fra autonom dysfunksjon [10]. Selv om disse studiene klart peker til en involvering av hjerte innervasjon i kreft kakeksi, er systematiske studier på dette temaet mangler så langt.
innervasjon av ventriklene består hovedsakelig av postganglionic sympatiske aksoner selv, til en mindre grad, også sensoriske og postganglionic parasympatiske aksoner er til stede [11], [12]. At lyset mikroskopisk nivå, er immunhistokjemi for å visualisere unmyelinated hjertenervefibrene. Hver nervefiber kan bestå av ett eller flere axoner, antall som bare kan bestemmes ved elektronmikroskopi. Foruten den klassiske neurotransmitter noradrenalin, sympatiske neuroner inneholder også nevropeptider som er produsert i den perikarya og lagret i vesikulær strukturer som benevnes store tette kjerne vesikler (LDCV). LDCV er anterogradely transporteres gjennom aksonet og blir sluppet på briste eller høyfrekvent skyte [13]. I tilfelle av hjerte sympatiske aksoner, LDCV overveiende inneholde neuropeptid Y (NPY) [14].
Her har vi antatt at kreft kakeksi er forbundet med kvalitative og /eller kvantitative strukturelle forandringer i myokardial innervasjon. For å teste denne hypotese, vi brukte en musemodell av tumor cachexia og undersøkt dens egenskaper med hensyn til serum cytokinnivåer og hjertefunksjon. I denne modellen, utførte vi en detaljert lys og elektronmikroskopanalyse av venstre ventrikkel og anvendt konstruksjonsbaserte stereological metoder for å kvantifisere forskjellige karakteristikker av kardiomyocytter og deres innervasjon. I tillegg ble mRNA uttrykk nivåer av ulike proteiner knyttet til hjerte innervasjon kvantifisert i hjertet og stel ganglion, en stor ganglion leverer sympatiske fibre til hjertet.
Resultater
Dyr
fra det tidspunkt av tumorimplantasjon til slutten av forsøket etter 21 dager, TG musene tapte 2,32 ± 0,82 g mager kroppsvekt, mens musene i CG oppnådd 2,11 ± 0,37 g mager kroppsvekt (p 0,001) validere musemodellen som en modell for svulst kakeksi. Tumorene seg selv hadde en gjennomsnittlig vekt på 3,3 ± 0,57 g. Det var ingen signifikante forskjeller i vekt av venstre ventrikkel mellom gruppene, men forholdet mellom venstre hjertekammer og kroppsvekten var signifikant høyere i TG på grunn av redusert kroppsvekt (tabell 1).
ekkokardiografi
Tabell 2 viser data innhentet av ekkokardiografi i bedøvede, normotermisk mus. Ingen av de parametrene signifikant forskjellig mellom TG og CG indikerer en bevart hjertefunksjon i svulsten gruppen på hvilebetingelser.
TNF-a og IL-6 nivåer
serumnivåer av TNF-α og IL-6 ble signifikant forhøyet i TG sammenlignet med CG (tabell 3).
Kvantitativ RT-PCR
i hjertet, uttrykk for β1-adrenerge reseptoren var uendret i TG vs. CG. I tillegg ble ekspresjon av nervevekstfaktor (NGF) ble redusert i TG sammenlignet med CG. Ekspresjonsnivåene av begge TNF-reseptorer (TNF-R1, TNF-R2) ble tredoblet eller mer, henholdsvis i TG vs. CG.
I stelganglier av TG, ekspresjonen av NPY ble signifikant redusert mens ekspresjon av tyrosinhydroksylase, det hastighetsbegrensende enzym for noradrenalin syntese ble tredoblet. NGF var signifikant nedregulert i tumorbærende mus, men endringene var mindre omfattende enn endringene i senderen uttrykk. Begge TNF reseptorene ble betydelig forbedret i TG vs. CG (tabell 4).
cardiomyocyte morfologi
I lys mikroskopisk nivå, hjertemuskelen dukket normalt med godt bevarte cardiomyocytes, mye åpne kapillærene på grunn perfusjon fiksering og glatt bindevev i interstitium. Det var ingen tegn til hjerte atrofi eller interstitiell fibrose. Denne observasjonen ble støttet av det totale volum og antall av kardiomyocytter som avvek ikke signifikant mellom de to gruppene (figur 1). På elektronmikroskopnivået, viste de to gruppene bemerkelsesverdige forskjeller med hensyn til deres myofibriller og deres sarcoplasm. Som angitt ved de representative mikrografer og stereological data, ble volumfraksjonen av myofibriller signifikant redusert mens det sarkoplasmavolumfraksjonen ble betydelig forbedret i TG (figur 2). Den absolutte volum av sarcoplasm ble betydelig forbedret, mens reduksjon i det totale volumet myofibril ikke nådde statistisk signifikans (p = 0,06), sannsynligvis fordi andre faktorer som kardiomyocytt volum og venstre ventrikkel volum innføre en høyere variasjon i dataene. Det ble ikke observert forskjeller i atom og mitokondrielle volum tetthet eller volum (data ikke vist). Videre er det i TG et høyere antall av større størrelse lipid dråper i sarcoplasm ble lagt merke som er reflektert ved en høyere totalvolum av lipid-dråper i den venstre ventrikkel (figur 2). Denne økningen i lipid dråper, men er altfor lav til å forklare økningen i total sarkoplasmavolumet.
Semithin tverrsnitt (1 mikrometer tykkelse) farget med toluidinblått ikke viste noen forskjeller i dimensjoner cardiomyocytes mellom kontroll (A) og tumor-bærende mus (B). Imidlertid subcellulære organiseringen av kardiomyocytter først på mindre tett i den tumor-gruppen. Parafinlengdeseksjoner (5-7 um tykkelse) farget med Masson-Trichrome Goldner er ikke ga bevis for en forbedret kollagenavsetning i de tumorbærende mus (D) sammenlignet med kontrollmus (C). Scale bar for A og B = 10 mikrometer. Målestokken for C og D = 20 um.
elektronmikrografer av myokardium fra kontroll (A, C, E) og tumor-bærende mus (B, D, F). A og B viser at det økte volumet av sarcoplasm og tap av myofibriller i mer eller mindre i lengderetningen inndelte muskelceller. Scale bar = 5 mikrometer. C og D viser klart økningen i oljedråpe (ld) størrelse og antall i tumoren i gruppen diagonalt snittede myocytter. Scale bar = 1 mikrometer. E og F viser nervefibre som inneholder tre axoner (stjerne) hver. Det var ingen åpenbare forskjeller i morfologi. De nærliggende myocytter er mer eller mindre på tvers av kuttet. Forkortelser:. Cap = kapillære, mf myofibrils, mi = mitokondrier
Lipotoxicity
De biokjemiske analyser av triglyserider innhold bekreftet økningen i lipider i cardiomyocytes. Malondialdehyd og andre tiobarbitursyre-reaktive substanser er svært reaktive forbindelser som er brukt som markører for oksidativt stress. Ved hjelp av to tester for å måle disse stoffene, fant vi ikke en signifikant forskjell mellom CG og TG (tabell 5). Endepunktet av den toksiske virkningen av lipider i hjertet er kardiomyocytt apoptose. Imidlertid gjorde caspase aktivitet ikke skiller mellom gruppene (tabell 5). I tillegg fant vi ikke noen morfologisk bevis for kardiomyocytt apoptose ved elektronmikroskopi.
Total lengde og morfologi av hjerteinfarkt axoner
Figur 3 viser morfologi av hjerteinfarkt innervasjon og stereological data fra axon karakterisering. Den totale lengden av aksoner forgrenede mellom kardiomyocytter ble redusert til mindre enn halvparten i TG i forhold til CG. Men den relative hyppigheten av nervefibre med et bestemt antall axoner ikke variere mellom gruppene. Det var heller ingen forskjeller i størrelsen på nerve fiberdiametre, selv om det var en tendens til mer hyppig forekomst av aksoner med mindre diameter i de tumor mus. Interessant nok ble antallet neuropeptid lagring LDCV per axon profil redusert med omtrent 50% i forhold til TG CG.
Hverken volumet av kardiomyocytter (A, åpne sirkler) eller volumet av det mellomliggende rom (A, fylte kvadrater) var forskjellig mellom gruppene. I tillegg ble antallet av kardiomyocytter var lik mellom gruppene (B). Volumet av sarcoplasm (C, fylte firkanter) var signifikant økt i tumoren gruppen mens volumet av myofibriller (C, åpne sirkler) hadde en tendens til å være mindre. Et større volum av lipid-dråper ble funnet i kardiomyocytter fra tumorbærende enn av kontrollmusene (D). Legg merke til logaritmisk skala på y-aksen (D). Den totale lengden av aksoner ble redusert til omtrent halvparten i tumoren gruppen (E), mens den relative hyppigheten av nervefibre med et visst antall axoner var ikke forskjellig mellom de to gruppene (F). Antallet LDVC pr axon profilen ble redusert i den tumor-gruppen (G), mens diameteren av aksonene var lik i begge grupper (H). Hver sirkel eller firkant representerer dataene for et enkelt dyr. Den vannrette streker viser gruppen mener.
Diskusjoner
Denne studien testet hypotesen om at kronisk eksponering for et stort ekstrakardiale svulst forårsaker strukturelle og funksjonelle endringer av hjerteinfarkt innervasjon i mus. Hypotesen var basert på flere rapporter om funksjonelle endringer av hjertet i pasienter som lider av forskjellige former for kreft [6] – [9] og observasjon av degenerative strukturelle lesjoner av kardiomyocytter i kreft kakeksi [2]. I overensstemmelse med vår hypotese, ble det observert en markert reduksjon av den totale lengde av aksoner innervating venstre ventrikulære kardiomyocytter og antall neuropeptid lagring organeller, LDCV, i disse aksoner. Videre observerte vi en nedgang på myofibrillar volum, men økt sarcoplasm og lipid dråpevolum inne cardiomyocytes. De strukturelle endringer ble ledsaget av redusert uttrykk nivåer av NGF i hjerte og stel ganglion, redusert ganglie NPY uttrykk, men forsterket tyrosinhydroksylase ekspresjon.
musemodell av Lewis lungekarsinom anvendt i denne studien er veletablert for mange år [15] og er kjent for å forårsake en signifikant tumor kakeksi [16]. I denne studien tiden mellom implantasjon av tumorceller og ofring av dyrene var 21 dager; denne varighet var tilstrekkelig til å indusere en tumorbyrde på 12-15% av total kroppsvekt og en cachectic tilstand som simulerer klinisk scenario av cancer cachexia. Til tross for forandringer i kroppsvekt hjertene til TG mus hadde en lignende våt masse som de av CG mus som står i kontrast til andre undersøkelser ved hjelp av solide tumorer [17]. Disse forskjellene kan skyldes lavere tumorbyrden, varighet av eksperimentet, musestamme eller tumorcelletype. Som diskutert nedenfor, stereological resultatene indikerer klart en katabolsk fenotype av kardiomyocytter selv om hjerte atrofi i betydningen av redusert masse ikke forekomme. Den funksjonelle ytelsen til hjertet ble vurdert ved ekkokardiografi parametere under hvilebetingelser. Overall, hjertefunksjon ikke skiller mellom CG og TG. Dette er i kontrast til en fersk studie på mus inokulert med colon-26 adenokarcinomceller av Tian og medarbeidere [17] som rapporterte en betydelig reduksjon i brøk matfett i tumorbærende mus i forhold til å styre mus. Men deres studie viste også en annen hjerteinfarkt morfologi inkludert fibrose og uorden av mitokondriell cristae som ikke ble observert i denne studien. Derfor er det synes å eksistere generelle forskjeller i dyremodeller mellom deres og vår studie. I samsvar med andre undersøkelser ved hjelp av Lewis-lungekarsinom [18], ble det observert en systemisk pro-inflammatorisk tilstand som kjennetegnes ved forhøyede serumnivåer av IL-6 og TNF-α. I human cancer cachexia, er en rekke av cytokinnivåer forhøyet med TNF-α være nøkkelen cytokin [19]. Det overskytende cytokiner kan stamme både fra tumorceller og fra immunceller stimuleres ved direkte eller indirekte signaler av den tumor [19]. Pro-inflammatoriske cytokiner, spesielt TNF-α, er kjent for å interagere med nervesystemet og kan således påvirke neuronal metabolisme og overlevelse [20] – [22], men våre data gir ikke et årsak-virkning-forhold mellom inflammasjon og neuronal fenotype som andre patofysiologiske hendelser er til stede i svulsten kakeksimodell som kan påvirke hjerteinfarkt innervasjon (f.eks vektreduksjon).
de viktigste funnene i denne studien er en reduksjon i hjerteinfarkt innervasjon og en nedgang i LDCV pr axon profil til omtrent 50% av kontrollverdiene. Disse morfologiske data er godt støttet, og supplert av QRT-PCR-analyse som viser en redusert ekspresjon av NPY i nevronene i stel ganglion mens mRNA-nivåene av tyrosinhydroksylase er forbedret i TG. I tillegg ble NGF mRNA uttrykk nivåer redusert i hjertet og stel ganglion. Nedgangen i den totale lengden av aksoner forgrenede mellom kardiomyocytter er indikativ for atrofiske endringer i det autonome nervesystemet til hjertet. Denne nye funn bekrefter vår hypotese og sterkt støtter involvering av hjerteautonome nervesystemet i kreftsykdom. En reduksjon i den totale lengden av axoner kan stamme i) fra et tap av nevroner i ganglion, ii) fra et tap av arborisation av hver neuron eller iii) fra tapet av individuelle axon lengde. Vårt studium viser at reduksjon av den totale axon lengden er hovedsakelig på grunn av en reduksjon i nervefibertetthet, ikke på grunn av et redusert antall axoner pr nerve fiber. Imidlertid ble det observert redusert nervefibertettheten gjennom hele ventrikkelen uten flekker av fullstendig denervering. Således kan resultatet enten stammer fra en degenerativ prosess som starter i periferien av axon grenene eller er basert på en strukturell og /eller metabolsk affeksjon av nervecellekroppen. Studier i homozygot mus med null mutasjoner i NGF eller NGF-reseptor-tyrosin-kinase-genet har vist at vedlikehold av neuroner og deres arborisation i det sympatiske nervesystemet avhenger av tilførselen med NGF fra målvevet [23]. Den reduserte uttrykk for NGF i hjertet og stel ganglion gjør det svært sannsynlig at mangel på NGF spiller en kausal rolle i reduksjon av hjerteinfarkt innervasjon. Interessant er det også bevis for at de metabolske funksjoner av nervecellene blir forstyrret som angitt ved reduksjonen i antallet LDCV og den reduserte NPY mRNA-ekspresjon. I motsetning til katekolaminer inneholdende små blærer, disse LDCV inneholder nevropeptider som syntetiseres i soma av nervecellene og er anterogradely transporteres til periferien av aksonene. I hjertet, LDCV hovedsakelig inneholder NPY, som har vasoconstrictory effekter og tjener trofiske funksjoner på kardiomyocytter [24]. Det induserer kardiomyocytt proteinsyntesen [25] og stimulerer hypertrofi [26]. Reduksjonen av NPY-holdige LDCV kan i det minste delvis være ansvarlig for redusert innhold av myofibriller inne i kardiomyocytter. Interessant, selv om NPY ble antatt å spille en viktig rolle i anoreksi og kakeksi basert på den sentrale reduksjon av disse betingelser [16], målinger av NPY-plasmanivå i humane kontroll og kreftpasienter har ikke vist forskjeller [27]. Likevel er det fortsatt diskutert om å påvirke dette systemet kan dempe kreft kakeksi [28]. Den viktigste signalstoffet i det sympatiske nevroner (noradrenalin) syntetiseres fra tyrosin gjennom ulike trinnene som er enzymatisk katalyserte. Det hastighetsbegrensende enzym, tyrosin-hydroksylase, ble funnet å være oppregulert i stel ganglion i TG som synes å være en teller-reguleringsmekanisme av den reduserte innervasjon av myokard. Reduksjonen av axon filialer i venstre ventrikkel kan derfor oppveies av økt catecholamine produksjon og dermed kan forklare hvorfor vi ikke oppdage eventuelle funksjonelle forskjeller under hvile forhold. På den annen side, viser en helt denerveres hjerte en meget konstant takt frekvens, men ingen funksjonell svekkelse i henhold til hvile [29], slik at funksjonelle forandringer forbundet med tap av eller forstyrret myokardial innervasjon kan heller bli åpenbare etter stressbetingelser eller ved analyse av spesifikke parametre slike som hjertefrekvensvariasjon. Dessverre, på grunn av kompleksiteten i modellen (kardiomyocytt atrofi, skjelett muskelatrofi, anemi) er det neppe mulig å utføre en stresstest som ville klart skille mellom endringer i myocardial innervasjon og andre ekstrakardiale facors.
kardiomyocytt rommet i tumor mus ble hovedsakelig karakterisert ved en reduksjon av myofibriller, og en økning i sarcoplasm og lipid dråper. Undersøkelser av patologien av humant myokardium, oppnådd fra hjertene til pasienter som hadde dødd av kreft kakeksi, hadde demonstrert redusert tverrsnittsareal av kardiomyocytter og en økning i Lipofuscin granuler [2], [3]. Delvis på grunn av artsforskjeller, disse resultatene avvike fra de som ble oppnådd i denne studien. For eksempel, i motsetning til mennesker hvor alder henger sammen med et økende volum av lipofuscin, dette ikke forekommer i stor grad i murine kardiomyocytter, sannsynligvis på grunn av den korte levetiden til mus. Den reduserte tverrsnittsareal av kardiomyocytter som beskrevet av Burch et al. [2] er et tegn på hjerte atrofi. Men i vår modell var det ingen reduksjon i det totale volumet eller antall kardiomyocytter. Dette kan være på grunn av en mer avansert sykdomstilstand i den menneskelige hjerte, til tidsforløpet mellom sykdom begynner og analyse (21 dager i mus versus måneder eller år hos mennesker), og selvfølgelig på grunn av forskjeller i kompleksiteten av sykdommen (ingen metastaser i musen, bare mild kakeksi). Hos kaniner utsatt for kreft kakeksi, var det ingen apoptotiske kardiomyocytter i motsetning til andre organer hvor en stor mengde celler som gjennomgikk apoptose [30]. På ultra nivå, imidlertid, et tap av myofibriller ble observert, som ble fulgt av en økning i sarkoplasmavolum. Nedgangen i myofibrils er en indikasjon på en ubalanse mellom proteindegradering og syntese favorisere proteinkatabolisme [5]. På grunn av uforandret volum av kardiomyocytter endringene i myofibrillære /sarkoplasmavolum ikke kan induseres ved cellulær ødem. En interessant observasjon strukturell var økningen i lipid-dråper som ble bekreftet ved biokjemiske målinger av triglyserider. I tumor kakeksi, er fettsyrer frigjøres fra fettvev og akkumuleres i andre celletyper, hvor de kan forårsake lipotoxic effekter [31], [32]. Cardiac lipotoxicity innebærer generering av reaktive oksygenarter og utbruddet av apoptotiske reaksjonsveier [33]. I dagens analyse ble lipidperoksidering vurdert ved å måle malondialdehyd og tilhørende forbindelser, og apoptose ble evaluert ved en caspase aktivitetsanalysen og morfologisk evaluering. Siden ingen av disse parametrene var signifikant forskjellig mellom TG og CG, konkluderer vi at observasjonene av denne studien ikke er relatert til lipotoxicity. Selv om den nøyaktige funksjonelle betydningen av de observerte ultra endringer av kardiomyocytter gjenstår å undersøkes, er det meget sannsynlig at disse endringene er i direkte forhold til mangelen på trofiske NPY stimulus til ved NPY Y5-reseptoren [34] og kan bli funksjonelt relevant hvis metabolske etterspørsel av hjertet øker. På grunn av den relativt store hjerte plastisitet disse endringene kan ikke nødvendigvis føre til en betydelig svekkelse av hjertefunksjonen [35].
I sammendraget, denne studien for første gang viser at kreft kakeksi er assosiert med merkede strukturelle endringer av det autonome innervasjon av hjertet, inkludert både svekkelse av den strukturelle integriteten til nervecellen (svekket total axon lengde) og organelle tap. Samtidig, mengden av lipid og antallet og volumet av lipiddråper økt i kardiomyocytter og myofibrillære volum ble redusert, noe som er i samsvar med konseptet med en kontinuerlig trofisk støtte av kardiomyocytter av autonome nerveceller.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen (GZ 66,010 /0085-II /10b /2009) ble godkjent av den østerrikske komité for etikk dyreforsøk (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung).
Dyr
Kvinne C57BL /6J mus ble opprettholdt på en vanlig lys-mørke-syklus (12 timer lys, 12 timer mørke) og holdt på en standard laboratoriefor diett (4,5% vekt /vekt fett). Mus som benyttes for injeksjon av tumorceller, så vel som kontrolldyrene var 8-9 uker gamle. Under forsøk matinntak samt kroppsvekt ble overvåket daglig
tumorimplantering
Mus ble tilfeldig delt inn i to grupper:. Tak ikke-tumorbærende mus (CG, n = 18) og mus som ble injisert med Lewis lunge carcinoma celler (TG, n = 18). Carcinoma celler ble holdt i cellekultur i DMEM høy glukose-medium supplert med 10% (v /v) FBS, 2 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin. Deretter 2 × 10
6 LLC celler hentet fra en eksponentielt voksende cellekultur, ble subkutant injisert under dyrets nakke. Søsken mus ble injisert med PBS ved det samme sted å tjene som narre kontroller. Både kontroll- og tumor-bærende mus ble avlivet etter 21 dager. I separate sett av eksperimenter ble musene som brukes (i) for ekkokardiografi (n = 4 i tumor-gruppe, n = 5 i kontrollgruppen) og stereology (n = 5 i tumor-gruppe, n = 6 i kontrollgruppen), (ii ) for måling av hjerte lipidinnhold, kaspase-aktivitet, lipidperoksidasjon og serum cytokinnivåer (n = 6 i hver gruppe), og (iii) for måling av kropps, venstre ventrikkel og tumorvekten og for polymerase kjedereaksjon av venstre ventrikkel og stel ganglion ( n = 6 i hver gruppe). Forskjeller i antall dyr som brukes for ekkokardiografi og stereology er forårsaket av utelukkelse av dyr som sluttet å puste spontant under anestesi (ekkokardiografi) eller som ikke var skikkelig festet ved vaskulær perfusjon (stereology).
Ekkokardiografi
2D guidet M-mode ekko (30 MHz) ble hentet fra kort og lang akse utsikt på nivå med de største LV-diameter ved hjelp av en VS-Vevo 770 High Resolution Imaging System (Visualsonics, Toronto, Canada) er utstyrt med en 30 MHz RMV (real time microvisualization) scan hode. Mus ble lett bedøvet med 2% isofluran og fikk lov til å puste spontant. Brystet ble barbert, akustisk kobling Gelen ble påført, og en varmepute ble brukt for å opprettholde normothermia. Mus ble fotografert i et grunt venstre lateral decubitus stilling. Venstre ventrikkel ende-diastolisk og end-systolisk dimensjoner ble målt fra originale tracings ved hjelp av ledende konvensjoner American Society of Ekkokardiografi. Venstre ventrikkel prosent fraksjonell forkortning ble beregnet som tidligere beskrevet [36].
TNF-α og IL-6 ELISA
Blodprøver ble tatt fra bedøvede kontroll- og tumor-bærende mus ved retro-orbital punktering. Serumet ble frosset ved -20 ° C. Serumnivåer av TNF-α og IL-6 ble målt ved bruk av TNF-a ELISA ReadySETGo (88-7324, eBiosciences, San Diego, USA) og mus IL-6 ELISA ReadySETGo (88-7064), eBiosciences, San Diego, USA) . Platen ble endelig lese på 450 nm.
Triglyserider måling
Triglyserider ble hentet fra hjerte vev av kontroll og tumor-bærende mus bruker hexane:isopropanol og såpe bruker 1% triton-x oppløst i kloroform. De organiske løsemidler ble fordampet bruker N
2 gass og triglyserider ble målt ved hjelp av Triglyceride FS kit (DIASYS, Tyskland) i henhold til leverandørens manual. Triglyseridnivåer ble normalisert til vevet i vekt.
Måling av lipidperoksidasjon og caspase aktivitet
For å vurdere tilstedeværelsen av lipotoxic effekter på cardiomyocytes, lipidperoksidasjon ble bestemt ved å måle malondialdehyde og apoptose ble bestemt ved måling av kaspase-aktivitet.
hjertevevet ble vasket grundig med heparin-PBS-oppløsning inneholdende 1 mM EDTA og homogenisert i 500 mL av homogeniseringsbuffer (0,25 M sukrose, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM deferoxamine mesylat , 1 mM PMSF) ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å bruke RC-DC-proteinanalyse (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) fra supernatanten. Lipidperoksidasjon ble målt i supernatanten med Oxiselect MDA addukt ELISA kit (STA-332, Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) og TBARS analyse (STA-330, Cell Biolabs) i henhold til produsentens protokoll.
for måling av kaspase 3/7 aktivitet, ble 15 til 25 mg hjertevevet homogenisert i 300 ul homogeniseringsbuffer (25 mM Hepes pH 7,5, 5 mM EGTA, 1 mM Pefabloc SC, 1% protease inhibitor cocktail [vol /vol ]) (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 4 ° C. Lysatet ble sentrifugert ved 13.000 g i 20 min ved 4 ° C. Supernatanten ble oppsamlet, og proteininnholdet ble målt ved bruk av DC-proteinanalyse (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kaspase-aktivitet ble bestemt ved inkubering av 50 ug protein i 100 ul av kaspase-Glo®3 /7-reagens (Promega, Madison, WI, USA) i 1,5 timer ved 20 ° C og luminescens ble bestemt ved anvendelse av et luminometer (BMG LUMIstar Optima Labtec, Offenburg, Tyskland).
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra hjerter og stelganglier av kontroll og tumorbærende mus (n = 6 hver) med Trizol reagens (Invitrogen , Carlsbad, California, USA) i henhold til produsentens protokoll. Ett mikrogram av total RNA ble transkribert reversert inn i cDNA ved anvendelse av den høye kapasitet cDNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Kvantitativ sanntid polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) ble utført ved anvendelse av genspesifikke primere kjøpt fra MWG-Biotech (Ebersberg, Tyskland) (Tabell 6). 18 s RNA ble benyttet som intern kontroll. Alle reaksjoner ble utført i tre paralleller. Kvantitativ RT-PCR ble utført på en 7900T standard rea-ltime PCR system (Applied Biosystems) med SYBR grønt som deteksjon flurophore. Resultatene er presentert som relative uttrykk nivåer etter beregning basert på Delta C
T-metoden [37].
Tissue fiksering, prøvetaking og bearbeiding
Etter ekkokardiografi, mus ble antikoagulert med 500 IE heparin ip, bedøvet med isofluran og ble drept ved cervikal dislokasjon 3 minutter senere. Hjertet ble deretter skåret ut, montert i et Langendorff-apparat, perfusert med 4% paraformaldehyd i fosfatbuffer retrograd gjennom aorta i 10 minutter og holdt i paraformaldehyd ved 4 ° C inntil videre behandling.
