Abstract
nedregulering av mikroRNA-196b (MIR-196b) har blitt rapportert, men dens bidrag til livmorhalskreft progresjon gjenstår å bli undersøkt. I denne studien, vi først vist at Mir-196b nedregule var signifikant assosiert med dårligere sykdomsfri overlevelse (DFS) for livmorhalskreft pasienter behandlet med kombinert kjemoterapi-stråling. For det andre, ved hjelp av en tri-modal tilnærming for målet identifikasjon, fant vi ut at homeobox-B7 (HOXB7) var en
bona fide
mål for MIR-196b, og i sin tur, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) var en nedstrøms transkripsjon regulert av HOXB7. Rekonstituering av MIR-196b ekspresjon ved transient transfeksjon resulterte i redusert cellevekst, clonogenicity, migrering og invasjon
in vitro
, samt redusert tumor angiogenese og tumorcelle-proliferasjon
in vivo
. Concordantly, siRNA knockdown av HOXB7 eller VEGF phenocopied de biologiske effektene av MIR-196b over-uttrykk. Våre funn har vist at MIR-196b /HOXB7 /VEGF pathway spiller en viktig rolle i livmorhalskreft progresjon; dermed rettet mot denne veien kan være et lovende terapeutisk strategi for fremtidig forvaltning av denne sykdommen
Citation. Hvordan C, Hui ABY, Alajez NM, Shi W, Boutros PC, Clarke BA, et al. (2013) mikroRNA-196b Regulerer Homeobox B7-vascular endothelial growth factor Axis i livmorhalskreft. PLoS ONE 8 (7): e67846. doi: 10,1371 /journal.pone.0067846
Redaktør: Rolf Müller, Philipps-universitetet, Tyskland
mottatt: 11 januar 2013; Godkjent: 21 mai 2013; Publisert: 04.07.2013
Copyright: © 2013 Hvordan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Ontario Institute for Cancer Research (Grant Nummer: 10NOV-399). Christine Hvordan er en CIHR Strategisk Training Fellow i Excellence in Radiation Research for det 21. århundre (EIRR21) Program, og er støttet av Lawrence, Ila og William Gifford Scholarship Fund. Det gis også støtte fra Campbell Family Institutt for kreftforskning og Helsedepartementet og langsiktig planlegging. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
på verdensbasis er livmorhalskreft den tredje hyppigst diagnostisert kreft og den fjerde største årsaken til kreft dødelighet hos kvinner, med anslagsvis 530.000 nye tilfeller og 275.000 dødsfall hvert år [1]. Selv om livmorhalskreftforekomst og dødelighet har falt i løpet av de siste tretti årene i USA [2], har fem års overlevelse holdt seg under 40% for pasienter diagnostisert med stadium III eller IV sykdom [3]. Ny innsikt er nødvendig for å bedre forstå mekanismene som bidrar til sykdomsutvikling, for å utforme bedre behandling for pasienter med lokalavansert livmorhalskreft.
Micro-RNA (mirnas) er korte, ikke-kodende RNA som regulerer genekspresjon post-transkripsjonelt [4], [5], og avvikende miRNA ekspresjon er vist å være viktig i mange humane ondartede sykdommer [6]. Gene mål som bidrar til tumorprogresjon er blitt beskrevet for flere mirnas [7], [8], [9]; men er fortsatt den biologiske funksjonen til de fleste miRNAs fortsatt ukjent. En av de store utfordringene for miRNA målet identifikasjon er evnen til mirnas å binde mRNA mål med ufullkommen komplementaritet; følgelig et enkelt miRNA potensielt kan regulere flere hundre eller tusen gener [10]. Dessverre, for tiden tilgjengelig
i silico
miRNA mål prediksjon algoritmer har høy falske funn og falske negative priser [11], [12]; dermed mandat eksperimentell validering av miRNA mål.
nedregulering av MIR-196b i livmorhalskreft har tidligere blitt rapportert [13], men dens rolle i tumorprogresjon i denne sykdommen er ikke tidligere undersøkt. Heri, rapporterer vi nedregulering av MIR-196b i primære humane livmorhalskreft vev og cellelinjer. Videre identifiserte vi HOXB7 transkripsjonsfaktor som en roman, direkte og spesifikke mål i en MIR-196b, som i sin tur regulerer VEGF i livmorhalskreft. Viktigst, MIR-196b nedregulering var assosiert med dårligere DFS hos pasienter behandlet med kjemoterapi-stråling, fremhever den biologiske betydningen av MIR-196b i livmorhalskreft progresjon.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienter, ifølge en protokoll som er godkjent for denne studien ved University Health Network forskningsetikk styret. Forsøk med dyr ble utført i henhold til protokoll godkjent av Animal Care Committee (ACC) i Ontario Cancer Institute, University Health Network (Animal Bruk Protokoll: 342,18).
Cellelinjer og trans
menneske~~POS=TRUNC cervical cancer-cellelinjer (ME-180, Siha, og HT-3) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATTC), og dyrket i α-MEM supplert med 10% FBS ved 37 ° C, 5% CO
2. Alle celler ble godkjent hvert halvår ved Senter for anvendt Genomics (Hospital for Sick Children, Toronto, Canada) bruker AmpF /STR Identifier PCR Amplification Kit (Applied Biosystems), og fast bestemt på å være fri fra
Mycoplasma
forurensning bruker MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza). ME-180 og Siha-celler ble transfektert ved bruk av LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) fremover transfeksjon protokoll, i henhold til produsentens instruksjoner. Pre-MIR negativ kontroll # 1 (NC), Pre-MIR-196b (Ambion), All Stars negativ kontroll (siNEG), siHOXB7 og siVEGF (Qiagen) ble alle tilført ved en endelig konsentrasjon på 30 nmol /L.
miRNA Expression Profilering av cellelinjer
Total RNA ble isolert fra Siha, ME-180 og HT3 livmorhalskreft cellelinjer ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. FirstChoice® Total RNA: Human Normal Cervix Tissue (Ambion) fra 3 forskjellige vev donorer ble benyttet som normale komparatorer. Expression nivåer av 377 mirnas og 3 snoRNAs (kontroller) ble analysert i livmorhalskreft cellelinjer og vanlige livmorhalsen vev ved hjelp av TaqMan® Low Density Array (TLDA) Menneskelig mikroRNA Panel (Applied Biosystems), med Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR system, som vi tidligere har beskrevet [14].
miRNA Expression Profilering av pasient Vev
Flash-frosne punsj biopsier ble hentet fra pasienter med lokalavansert livmorhalskreft som var planlagt å motta primærbehandling med standard kjemoterapi-stråling, som består av ekstern-bjelke strålebehandling mot primær cervical tumor og bekken lymfeknuter (45-50 Gy total, i 1,8 til 2-Gy daglige fraksjoner med 18-til-25-MV fotoner), kombinert med ukentlige doser cisplatin (40 mg /m
2 totalt 5 doser). FIGO (International Federation of Gynekologer og Fødselsleger) staging ble bestemt ved hjelp av en kombinasjon av: forbehandling evaluering under narkose, computertomografi (CT) skanner av magen og bekkenet, bryst røntgen og magnetisk resonans imaging (MRI) av bekkenet. MRI ble også anvendt for å bestemme lymfeknute status; bekken og para-aorta lymfeknuter ble klassifisert som positive for metastatisk sykdom hvis MR korte aksen dimensjon var 1 cm og tvetydige hvis det var 8 til 10 mm. Etter biopsi, ble prøvene plassert i en optimal skjære temperatur (OCT) lagringsmedium for histopatologisk undersøkelse, deretter flash-frosset i flytende nitrogen. H E-fargede vevssnitt ble kuttet fra oktober-embedded materiale og evaluert av en gynekologisk patolog (B Clarke). Totalt celle-innhold (stromaceller og tumorceller) ble beregnet for alle vevsprøver ved hjelp av et lysmikroskop, og bare prøver inneholdende 70% tumorceller ble vurdert for videre analyse (n = 79). De kliniske egenskapene til disse 79 pasientene er vist i tabell 1. Median oppfølgingstid for dette kullet var 3 år. Flash-frosne normale livmorhalsen vev oppnådd fra 11 pasienter som gjennomgikk hysterektomi for godartede årsaker fungerte som normalt komparatorer.
To deler av 50-micron tykkelse ble kuttet fra oktober-innebygd flash-frosset vev og plassert i en nukleasefritt microtube. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av Norgen total-RNA Purification Kit (Norgen Biotek), i henhold til produsentens instruksjoner. Global miRNA uttrykket ble målt i livmorhalskreft og normal cervix vev med TaqMan® Low Density Array (TLDA) Menneskelig mikroRNA En Array v2.0 (Applied Biosystems) ved bruk av Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System, som allerede er beskrevet [14 ].
Kvantitativ real-time PCR-analyse av miRNAs og mRNA
Total RNA ble isolert fra cellelinjer ved hjelp av Total RNA Purification Kit (Norgen Biotek), i henhold til produsentens instruksjoner. Ekspresjonen av MIR-196b ble målt ved hjelp av kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR) ved anvendelse av standard TaqMan mikroRNA Assay (Applied Biosystems). Kort, RNA var første revers transkribert ved bruk av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription (RT) Kit og en stilk-løkke primer spesifikk for MIR-196b (Applied Biosystems) [15]. De 2
-ΔΔCt metoden ble brukt til å beregne relative nivåer av MIR-196b uttrykk, ved hjelp RNU44 som referanse genet [16].
RT produkter ble forsterket med MIR-196b-spesifikke primere, som vi som tidligere er beskrevet [14]. Uttrykket nivåer av tidligere beskrevet (c-myc, BCL2, HOXA9, MEIS1) og kandidat mRNA mål for Mir-196b (ANKHD1, CTDSP2, FGFR1, HDAC, HOXA7, HOXB7, KRT8, PUM2, SLC9A6, SMC3, SMG7, SR140), og HOXB7 (VEGF, Ku70, Ku80, DNA-PK, FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, THBS2) ble også målt ved QRT-PCR. Ett mikrogram av total RNA ble revers-transkribert ved hjelp av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Kvantitativ RT-PCR ble utført ved hjelp SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) og PCR-primere (Tabell S1) utformet ved hjelp Primer 3 Input. De 2
-ΔΔCt metoden ble brukt til å beregne relative nivåer av genekspresjon, med GAPDH som referanse genet [16].
Cell levedyktighet, spredning og kolonidannende Analyser
levedyktighet av transfekterte celler ble bestemt ved trypan blå eksklusjon assay. ME-180 og Siha-celler ble transfektert i tre eksemplarer med 30 nmol /L av pre-MIR-196b, NC, siHOXB7, siVEGF, eller siNEG og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2. Ved 48 og 72 timer etter transfeksjon ble cellene trypsinert, farget med Trypan blått og telt ved bruk av et hemocytometer. Celleformering ble undersøkt ved hjelp av CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS Assay) (Promega Biosciences), i henhold til produsentens instruksjoner. For kolonidannelse analysene ble celler transfektert med 30 nmol /L av pre-MIR-196b, Pre-MIR negativ kontroll # 1, siHOXB7, siVEGF, eller siNEG og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2. Ved 48 timer etter transfeksjon, ble cellene sådd ut på nytt ved lav tetthet i 6-brønns plater i triplikat. Celler ble inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 10-12 dager, deretter fiksert og farget med 0,1% krystallfiolett i 50% metanol. Antallet kolonier som inneholder minst 50 celler ble talt opp, og de overlevende fraksjonen ble beregnet ved å sammenligne med celler transfektert med negativ kontroll.
Cell migrasjon og invasjon Analyser
BD BioCoat Matrigel invasjonen Chambers og Setter kontroll (BD Biosciences) ble anvendt for å analysere migrering og invasjon av transfekterte celler. Chambers inneholdt en polyetylentereftalat membran med 8 mikrometer porer. ME-180 og Siha-celler ble transfektert med 30 nmol /L av pre-MIR-196b, NC, siHOXB7, siVEGF, eller siNEG og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2. Ved 24 timer etter transfeksjon, 1,5 x 10
5-celler ble sådd ut på nytt inne i hvert kammer med medium inneholdende lavt serum (1% FBS). Kamrene ble plassert i en 24-brønners plate med høy serum (20% FBS) medium i hver nedre kammer for å tjene som en chemo-lokkemiddel. Celler ble inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 til 48 timer, og deretter ble membranene vasket, farget, og montert på objektglass. En lysmikroskop ble anvendt for å telle antallet trekkende eller invaderende celler. Relative migrering ble beregnet ved sammenligning med celler transfektert med den negative kontroll. Prosent invasjon ble beregnet som antall celler som invaderte gjennom Matrigel innsatsen, dividert med antall celler som overføres gjennom reguleringsinnsatsen.
Cell Cycle Analysis
cellesyklusanalyse ble utført på ME-180 og Siha celler etter transfeksjon med 30 nmol /L av pre-MIR-196b eller NC, for å måle fraksjonen av celler i sub-G
1 fasen av cellesyklusen. Celler ble høstet og vasket to ganger i FACS-buffer (PBS /0,5% BSA), resuspendert i 1 ml FACS-buffer, og deretter løst opp i 1 ml iskald 70% etanol. Etter 1 time med inkubering på is ble cellene vasket en gang og resuspendert i 500 ul FACS-buffer inneholdende 40 pg /ml RNase A (Sigma) og 50 ug /ml propidiumjodid og deretter inkubert i mørke ved romtemperatur i 30 minutter. Celler ble analysert i BD FACSCalibur (Becton Dickinson) ved hjelp av FL-2A og FL-2W-kanaler. Flowcytometri data ble analysert ved hjelp FlowJo 7.5 programvare (Tre stjerne).
In vivo eksperimenter
seks- til åtte uker gamle alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) hunnmus ble benyttet for xenograft eksperimenter, i henhold til retningslinjene fra Care komiteen Animal, Ontario Cancer Institute, University Health Network. -Celler ble transfektert med forhånds MIR-196b eller NC og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2. Ved 48 timer etter transfeksjon ble cellene høstet og 5 x 10
5 levedyktige celler ble fortynnet i 100 ul vekstmedium. Celler ble injisert intramuskulært i den venstre gastrocnemius muskel av hunn SCID-mus. Tumor pluss ben diameter ble målt to ganger i uken, og musene ble avlivet da 15 mm ble oppnådd. Tumorer ble fjernet 25 dager etter implantasjon og umiddelbart fiksert i 10% bufret formalin i 24 timer, plassert i 70% etanol i 24 timer, innstøpt i parafin, seksjonert og (5 uM) for immunfarging. I tillegg til hematoxylin og eosin (H ii) mRNA oppregulert minst to ganger i livmorhalskreft vev i forhold til normal cervix vev, ved hjelp av to uavhengige offentlig tilgjengelige microarray datasett [17], [18]; og iii) mRNAer nedregulert på minst 0,5-ganger ved både 24 og 72 timer etter transfeksjon med 30 nmol /L av pre-MIR-196b, hvor transkripsjonsnivåer ble målt ved anvendelse av Whole Human Genome 4 x 44 K En farge Array (Agilent).
luciferaserapportørplasmid analysen
villtype eller mutante fragmenter av 3′-utranslaterte område (UTR) av HOXB7 inneholder spådd bindingssetet (posisjon 220-226) for MIR-196b ble individuelt forsterket av AmpliTaq Gold-DNA-polymerase (Applied Biosystems) ved å bruke primere som er oppført i tabell S1. PCR-produktene ble renset, så klonet nedstrøms fra Firefly
luciferase
genet i pMIR-RAPPORT vektor (Ambion) på
Spe
jeg og
Hind
III restriksjons , for å produsere den pMIR-HOXB7 eller pMIR-HOXB7-mut vektor. ME-180 og Siha celler ble ko-transfektert med 100 nmol /L av pre-MIR-196b eller NC, og 100 ng av reporter vektor av interesse. Som en referanse kontroll, 50 ng av PRL-SV vektor (Promega) som inneholder
Renilla luciferase
genet ble også tilført med hver tilstand. Firefly og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble målt til 24 timer etter transfeksjon med Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner.
Immunoblotting
Celler ble transfektert med enten 100 nmol /L av pre-MIR-196b eller NC, og totale proteinekstrakter ble høstet på is etter 48 og 72 timer. Proteiner av interesse ble undersøkt med kanin anti-HOXB7 (1:500 fortynning, Invitrogen) eller mus anti-GAPDH (1:10,000 fortynning, Sigma), og oppdaget med IRDye fluorescerende sekundære antistoffer (1:20,000 fortynning, LI-COR). GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Immunoblotter ble skannet og kvantifisert ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Celler ble transfektert med 30 nmol /L av siHOXB7 eller siNEG, og nivået av utskilt VEGF ble målt til 48 og 72 timer etter transfeksjon, ved hjelp av human VEGF DuoSet ELISA (R 0,001; fig. 1A). Viktigere, pasienter med lavere enn median MIR-196b uttrykk nivå ved diagnosetidspunktet opplevd verre DFS i forhold til de med høyere MIR-196b uttrykk (
P
= 0,02; hazard ratio = 0,39, Fig. 1B). MIR-196b uttrykk var ikke signifikant korrelert med tumorstørrelse (
P
= 0,12), FIGO stadium (
P
= 0,14), eller lymfeknutestatus (
P
= 0,60 ). Global miRNA uttrykket profilering ble gjennomført på tre livmorhalskreft cellelinjer (ME-180, Siha og HT-3) bekreftet også nedregulering av MIR-196b i livmorhalskreft. Fra de 55 mirnas som ble deregulert minst 2 ganger i alle tre cellelinjer i forhold til 3 normale cervix vev, MIR-196b var blant de mest signifikant nedregulert mirnas (Fig. 1C), i tråd med en tidligere utgitt miRNA uttrykket profilering studie [13].
A) MIR-196b uttrykk nivåer ble målt ved hjelp av QRT-PCR i 79 primærlivmorhalskreft prøver, sammenlignet med 11 normale cervix epitelvev kontroller. B) Kaplan-Meier analyse av DFS hos pasienter med livmorhalskreft. Rød, pasienter med høyere enn median MIR-196b uttrykk nivå (n = 39); blå, pasienter med lavere enn median MIR-196b uttrykk (n = 39); en pasient ble fjernet fra overlevelsesanalyse på grunn av manglende overlevelse informasjon. C) Basal nivåer av MIR-196b i tre livmorhalskreft cellelinjer (Siha, ME-180, og HT-3), som i forhold til normal cervix epitelvev, analysert ved QRT-PCR. **
P
. 0,01
For å undersøke om MIR-196b nedregulering ble epigenetiske bestemt, i tillegg til kromosom tap [19], ME-180 og Siha celler ble behandlet med den demethylating midlet 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-DCT). Denne behandlingen resulterte i kun en minimal økning i MIR-196b uttrykk, noe som indikerer at arrangøren metylering var usannsynlig å være en viktig mekanisme for MIR-196b under-uttrykk (Fig. S1 A). Videre undersøkelse av offentlig-butikken microarray datasett av genuttrykk i grunnskolen livmorhalskreft vev viste ingen signifikante endringer i uttrykket av dicer, drosha, DGCR8, exportin-5, eller noen subenheter av RNA Polymerase II, som alle er involvert i miRNA biogenesis og behandling (data ikke vist).
MIR-196b over-uttrykk betydelig redusert celleviabilitet, Clonogenicity, spredning og Invasion
for å vurdere den biologiske betydningen av MIR-196b nedregule celler ble transfektert med 30 nmol /L NC eller pre-MIR-196b. Oppregulering av MIR-196b uttrykk ble oppholdt i opptil 72 timer etter transfeksjon (Fig. S1B). Transfeksjon med pre-MIR-196b førte til signifikant redusert cellelevedyktighet sammenlignet med kontroller etter 48 og 72 timer etter transfeksjon (ME-180:25% etter 48 timer, 41% etter 72 timer, Siha: 29% etter 48 timer; 54 % ved 72 h) (fig. 2A). I tillegg MIR-196b løpet uttrykk resultert i betydelige reduksjoner i clonogenicity (ME-180:57% i forhold til NC, Siha: 64% sammenlignet med NC) (figur 2B.), Spredning (ME-180:36% ved 48 h , 35% ved 72 timer, Siha: 22% etter 48 timer, 21% etter 72 h) (figur 2C), og overføringen (32% i forhold til NC) pluss invasjon (32%
vs
.. 63% for NC) (fig. 2D). Celler behandlet med pre-MIR-196b viste en liten, men ikke statistisk signifikant, økning i prosentandelen av celler i sub G
1 befolkningen, ledsaget av en liten reduksjon i G
0-G
en befolkning (fig. S1C).
A) Relativ levedyktigheten til ME-180 og Siha celler ble vurdert ved 48 og 72 timer etter transfeksjon med pre-MIR-196b (30 nmol /L), sammenlignet med negativ kontroll pre-MIR (30 nmol /L), ved hjelp av trypanblått-analysen. B) Clonogenicity av ME-180 og Siha celler ble vurdert ved transfeksjon med 30 nmol /L av pre-MIR 196b eller negativ kontroll forhånds MIR. Ved 48 timer etter transfeksjon, ble cellene høstet deretter talt og på nytt utsådd ved lav tetthet i 6-brønns plater. Etter 10 dagers inkubering, ble cellene fiksert og farget, og antallet kolonier (mer enn 50 celler) ble tellet. C) Relativ spredning av ME-180 og Siha celler ble undersøkt ved 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon med pre-MIR-196b (30 nmol /L), sammenlignet med negativ kontroll forhånds MIR (30 nmol /L) ved bruk av MTS-analysen. D) Representative bilder (til venstre) og histogrammer (til høyre) viser vandrende evne (øverst) og invasivitet (nederst) av ME-180 celler som ble transfektert med 30 nmol /L av pre-MIR 196b eller negativ kontroll pre-Mir, høstet på 24 timer etter transfeksjon, ble deretter talt og på nytt utsådd i invasjonskamrene. Celle migrasjon (øverst), og invasjon (nederst), vurdert til 48 timer etter seeding i Transwell kamre. Alle data representerer gjennomsnitt ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. NC, pre-MIR negativ kontroll; *
P
0,05; **
P
. 0,01
MIR-196b Over Expression Trykt Tumor Angiogenese og Tumor Cell Proliferation in vivo
Celler transfektert med pre-MIR-196b viste ingen statistisk signifikant forskjell i tumorvekst i mus, sammenlignet med NC-behandlede celler (fig. S2). Ved 25 dager etter implantasjon ble imidlertid CD31 immunofarging likevel observert å bli redusert til 69% i pre-MIR-196b-behandlede tumorer sammenlignet med kontrolltumorer (fig. S3, øverst). Videre dette ble assosiert med en beskjeden, men signifikant reduksjon i Ki-67 uttrykk (46%
vs
. 53% for celler behandlet med NC) (Fig. S3, midten), og en mindre, men ikke statistisk betydelig økning i TUNEL-farging (fig. S3, nederst). Derfor våre data antydet at pre-MIR-196b bidratt til redusert angiogenese og tumor celleproliferasjon.
MIR-196b Direkte Targets HOXB7
nedregulering av MIR-196b i livmorhalskreft vev og cellelinjer, og de betydelige fenotypiske effekter av MIR-196b over-uttrykk både
in vitro Hotell og
in vivo
, indikerte at MIR-196b synes å være en viktig formidler av livmorhalskreft progresjon . Dermed ble en tri-modal strategi [8] benyttes for å identifisere potensielle mRNA mål som kunne står for disse fenotypiske endringer (Fig. S4). Denne metoden identifiserte 15 overlappende kandidat mål (ANKHD1, CALM3, CLK2, CTDSP2, FGFR1, HDAC, HOXA7, HOXB7, KRT8, PCCB, PUM2, SLC9A6, SMC3, SMG7, SR140). For målet validering, ble ME-180 celler transfektert med pre-MIR-196b eller NC, og transkripsjonsnivåer på 24 timer etter transfeksjon ble målt med QRT-PCR for 12 kandidat mål (egnede primere ble ikke laget for de andre 3 transkripsjoner ), pluss 4 tidligere beskrevet mål for Mir-196b (c-myc, BCL2, HOXA9, MEIS1). Ingen av de tidligere beskrevne målene ble vesentlig endret etter MIR-196b over-uttrykk (Fig s5a). Bare fem av de 12 testede kandidat mål var signifikant nedregulert etter MIR-196b over-uttrykk (Fig S5b.); HOXB7 ble valgt for ytterligere funksjonell evaluering siden det var den kandidaten målet som viste størst grad av nedregulering (40% sammenlignet med kontroller). Videre er HOXB7 medlem av
Hox
genet cluster, en familie av gener som er rapportert å være dysregulerte i forskjellige maligniteter [20], og Mir-196 familien er kjent for å målrette pattedyr
Hox
gener [21].
En luciferase bindingsanalysen bekreftet at Mir-196b direkte og spesifikt samhandlet med 3′-UTR av HOXB7. I forhold til å kontrollere celler transfektert med pMIR-RAPPORT, celler transfektert med pMIR-HOXB7 viste redusert luciferase aktivitet (ME-180:68%, Siha: 71%) ved samtidig transfektert med pre-MIR-196b (figur 3A.). Denne hemmende virkning ble fullstendig opphevet med pMIR-HOXB7-mut, som inneholdt en mutasjon i MIR-196b-bindingssete. I tillegg til transfeksjon med pre-MIR-196b resulterte i signifikant redusert HOXB7 mRNA transkript (ME-180:49% etter 48 timer, 62% etter 72 t; Siha: 55% etter 48 timer, 69% etter 72 h) (Fig . 3B), og protein (74% etter 48 timer;. 80% ved 72 timer) (figur 3C) nivåer ved 48 og 72 timer etter transfeksjon. Det syntes å være en større gangers endring i HOXB7 på mRNA-nivå i forhold til proteinet, noe som ikke er overraskende siden mirnas kommuniserer direkte med mRNA-transkripter og ikke proteiner. I tillegg kan proteinet oversettelse bli påvirket av en rekke mekanismer som oppstår oppstrøms, slik som kjerne eksport av RNA-transkripter og rekruttering av ribosomale subenheter.
A) Relativ luciferaseaktivitet av ME-180 eller Siha celler ved 24 timer etter ko-transfeksjon med pMIR-RAPPORT, pMIR-HOXB7 eller pMIR-HOXB7-mut vektorer og pre-MIR-196b eller NC (30 nmol /L). B) Relativ HOXB7 mRNA uttrykk nivåer i ME-180 eller Siha celler etter transfeksjon (48 og 72 timer) med pre-MIR-196b eller NC (30 nmol /L), målt ved QRT-PCR. Expression nivåer ble normalisert til GAPDH uttrykket. C) Representant Western blot bilde (øverst), og relativ kvantifisering av HOXB7 protein nivåer (nederst) etter transfeksjon (48 og 72 timer) med pre-MIR-196b eller NC (30 nmol /L). Alle data som representerte gjennomsnittet ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. OD, optisk tetthet; NC, pre-MIR negativ kontroll; *
P
0,05; **
P
. 0,01
VEGF er en Relevant Nedstrøms Target av HOXB7
Siden HOXB7 er en transkripsjonsfaktor, var det nødvendig å finne ut hvilket gen (e) reguleres ved HOXB7 kunne være relevant i denne sammenheng for livmorhalskreft. Derfor,-celler ble transfektert med 30 nmol /L av siHOXB7 eller siNEG, og mRNA-nivåer av kjente HOXB7 mål som Ku70, Ku80, DNA-PK, FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, thrombospoindin 2 (THBS2) og VEGF [22] , [23], [24], [25] ble målt ved 48 timer etter transfeksjon. VEGF vist størst grad av nedregulering (43%) etter HOXB7 knockdown (Fig. S6a). Concordantly, betydelig reduksjon i VEGF mRNA (ME-180:63% etter 48 timer, 33% etter 72 timer; Siha: 69% etter 48 timer, 41% etter 72 h) (Fig. 4A) og utskilt protein (ME-180 :82% etter 48 timer, 77% etter 72 t; Siha: 84% etter 48 timer, 75% etter 72 h) (figur 4B) nivåer ble observert ved både 48 og 72 timer etter transfeksjon med siHOXB7, bekrefter at VEGF. var faktisk en relevant nedstrøms HOXB7 mål i denne sykdommen. Videre andre pro-angiogene kjente mål for HOXB7 (FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, THBS2) ble ikke signifikant endret etter HOXB7 knockdown (Fig. S6a) eller MIR-196b overekspresjon (Fig. S6E), noe som tyder på at HOXB7 mediert angiogenese
via
VEGF i denne sammenheng.
A) Relativ VEGF uttrykk på mRNA-nivå etter transfeksjon av ME-180 eller Siha celler med siHOXB7 eller siNEG (30 nmol /L), som bestemmes av QRT -PCR. Expression nivåer ble normalisert til GAPDH uttrykket. B) relative nivåer av utskilt VEGF protein etter transfeksjon av ME-180 eller Siha celler med siHOXB7 eller siNEG (30 nmol /L), som bestemmes av ELISA. Alle data som representerte gjennomsnittet ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. siNEG, All Stars negativ kontroll; *
P
0,05; **
P
. 0,01
knockdown av HOXB7 eller VEGF rekapitulert de biologiske effektene observert etter MIR-196b Over Expression
For ytterligere å underbygge dette nyan rives vei av MIR-196b målretting HOXB7 som igjen reguleres VEGF, ME-180 og Siha celler ble behandlet med siHOXB7 eller siVEGF å avgjøre om disse tiltakene kan rekapitulere effekten av MIR-196b over-uttrykk. Knockdown av HOXB7 og VEGF transkripsjon og proteinnivåer ble vedvarende i opptil 72 timer etter siRNA transfeksjon (Fig. S6B, S6C, og S6D). Det ble observert at cellelevedyktigheten ble redusert betydelig etter transfeksjon med enten siHOXB7 (ME-180:77% ved 48 timer, 66% etter 72 timer; Siha: 80% etter 48 timer, 70% etter 72 h). (Fig 5A, venstre ) eller siVEGF (ME-180:78% ved 48 timer, 60% etter 72 timer; Siha: 77% etter 48 timer, 68% etter 72 h) (figur 5A, til høyre), i likhet med effektene som observeres etter transfeksjon med. pre-MIR-196b (ME-180:25% etter 48 timer, 41% på 72 timer, Siha: 29% på 48 timer, 54% ved 72 h) (2A fig.). Clonogenicity sunket betraktelig etter enten siHOXB7 (ME-180:69%, Siha: 71%) (figur 5B, til venstre.) Eller siVEGF (ME-180:78%, Siha: 75%) (Fig. 5B, høyre) transfeksjon, som tidligere observert for pre-MIR-196b transfeksjon (ME-180:57% i forhold til NC, Siha: 64% sammenlignet med NC) (figur 2B.). Celle migrasjon (Fig. 5C, øverst) ble også redusert betraktelig etter transfeksjon med enten siHOXB7 (60%) eller siVEGF (62%), i likhet med resultatene observert etter pre-MIR-196b transfeksjon (32%
vs.
NC) (fig. 2D, øverst). *
P
0,05; *
P
0,05;
