Abstract
Identifiseringen av kimcellelinje varianter disponerer for arvelig nonpolyposis tykktarmskreft (HNPCC) er avgjørende for klinisk behandling av bærere, men flere probands forbli negativ for slike varianter eller bjørn varianter av usikker betydning (vus). Her beskriver vi resultatene av integrerende molekylære analyser i 132 HNPCC pasienter som gir bevis for økt genetisk testing av HNPCC med tradisjonelle eller neste generasjon metoder. Pasientene ble screenet for: kimcellelinje allel-spesifikk uttrykk (ASE), nucleotide varianter, rearrangements og formidler metylering av mismatch reparasjon (MMR) gener; kimcellelinje
EpCAM
rearrangements; tumor mikro ustabilitet (MSI) og immunhistokjemisk (IHC) MMR protein uttrykk. Probands negative for patogene varianter av MMR gener ble undersøkt for kimcellelinje
APC Hotell og
MUTYH
sekvensvarianter. De fleste germline defekter identifisert var sekvensvarianter og rearrangements av MMR gener. Bemerkelsesverdig, ble endret germline ASE av MMR gener påvist hos 8/22 (36,5%) probands analysert, inkludert 3 tilfeller negative på andre visninger. Videre ASE gitt bevis for sykdomsfremkallende rolle og guidet karakterisering av en vus deles av 2 ekstra probands. Ingen kimcellelinje MMR-genet promoter metylering ble observert og bare en
EpCAM
omorganisering ble oppdaget. I flere tilfeller svulst IHC og MSI splittet fra germline screeningresultater. Spesielt,
APC
eller biallelic
MUTYH
germline defekter ble identifisert i 2/19 probands negative for patogene varianter av MMR gener. Våre resultater viser at ASE utfyller gDNA-baserte analyser i identifisering av MMR-defekter og i den karakteriseringen av vus påvirker genekspresjon, noe som øker antallet germline endringer detektert. En vesentlig del av probands negative for MMR genvarianter havner
APC
eller
MUTYH
varianter. Disse resultatene indikerer at kimcellelinje ASE analyse og screening for
APC Hotell og
MUTYH
defekter bør inkluderes i HNPCC diagnostiske algoritmene
Citation:. De Lellis L, Aceto GM, Curia MC, Catalano T, Mammarella S, Veschi S, et al. (2013) Integrative Analyse av arvelig nonpolyposis tykktarmskreft: bidraget fra Allele-spesifikt uttrykk og andre analyser til diagnostisk algoritmer. PLoS ONE 8 (11): e81194. doi: 10,1371 /journal.pone.0081194
Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: 27 juni 2013; Godkjent: 09.10.2013; Publisert: 20.11.2013
Copyright: © 2013 De Lellis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av midler fra det italienske utdanningsdepartementet, universitet og forskningsdepartementet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Arvelig nonpolyposis tykktarmskreft (HNPCC), også kjent som Lynch syndrom er den hyppigste formen for autosomal dominant predisposisjon for tykktarmskreft (CRC) [1]. Genetiske diagnose av kimlinje-defekt operatører i rammede familiene er grunnleggende for en effektiv klinisk observasjon og tillater målrettet chemoprevention som nylig ble vist å vesentlig redusere forekomsten av kreft hos disse pasientene [2]. Imidlertid er identifisering av sykdomsfremkallende germline defekter i dette syndromet ikke trivielt, som reflekteres av den brede svingninger i frekvensen av genetiske endringer som er identifisert i ulike studier, og ved det aktuelle antall varianter med usikker betydning (vus) oppdaget [3-6] . Den variable frekvensen av endringer detekterte reflekterer dels forskjeller i følsomhet av molekyl metoder benyttes og dels det faktum at kliniske diagnose ikke fullstendig hensyn til den underliggende genetisk heterogeniteten, selv om valget av probands er basert på strenge Amsterdam kriterier I (AC -I) eller Amsterdam kriterier II (AC-II) [7]. Flertallet av HNPCC pasienter er knyttet til kimcellelinje mismatch reparasjon (MMR) defekter og utvikle svulster med høye nivåer av mikro ustabilitet (MSI-H), kjennetegnet av MMR mangel. Kimcellelinje
MLH1
eller
MSH2
varianter er identifisert i de fleste av disse pasientene, mens varianter i andre MMR genene er påvist i en mindre del av tilfellene [1-6]. Spesielt, også germline delesjoner som påvirker den 3 «ende av epithelial cell adhesion molecule-genet (
EpCAM
) kan forårsake HNPCC gjennom hypermethylation og stanse av den nedstrøms
MSH2
promoter i EpCAM-uttrykkende vev [ ,,,0],8].
EpCAM
slettinger ble rapportert med en relativt høy frekvens (16-21%) i forskjellige studier utført i tilfeller negative for germline MMR defekter [9,10]. Den høyeste frekvensen (opptil 33%) av
EpCAM
rearrangements ble observert i undergruppe av MSI-H pasienter negative for germline MMR endringer og mangler MSH2 svulst uttrykk [11,12], men den generelle hyppigheten av disse rearrangements i serie med HNPCC probands, uselekterte for mutasjonsstatus eller MSH2 svulst farging, har ikke blitt evaluert.
I tillegg til MMR gener og
EpCAM
, andre gener spiller en rolle i dette genetisk heterogene syndrom. En relativt høy andel av familier møte AC har «familial kolorektal kreft typen X» (FCCTX), en kolorektal kreft aggregering uten tegn til kimcellelinje eller tumor-assosiert MMR defekter [4]. For de fleste av disse familiene er genetisk forandring ansvarlig for tykktarmskreft predisposisjon ikke kjent, men mangler i ikke-MMR gener, for eksempel
MUTYH
,
OGG1
eller
BMPR1A
, er tidvis oppdaget [13-15]. I denne forbindelse også
APC
varianter assosiert til svært svekkede fenotyper kan overlappe med HNPCC [16], noe som ytterligere utvide utvalget av CRC disponerende gener skal skjermes.
Basert på ovennevnte hensyn, tradisjonell genetisk testing i HNPCC fokusert på analyse av MMR-gener og flere diagnosealgoritmer ble foreslått for å optimalisere denne screening [17-21]. Imidlertid kan disse algoritmene begrense følsomheten av genetisk testing, underslår bærere av sykdomsfremkallende varianter i MMR gener. Nylig ble en svært processive gDNA analysen (ColoSeq, University of Washington, Seattle, Washington) basert på målrettet fangst og neste generasjons sekvensering (NGS) designet for å samtidig analysere MMR-relaterte og -unrelated gener i HNPCC [22]. NGS-basert testing kan overvinne noen av begrensningene i low-throughput metoder, men selv denne tilnærmingen har noen ulemper. For eksempel, ikke NGS ikke gi innsikt i den patogene rollen vus som er mer sannsynlig å bli oppdaget av disse svært processive metoder. Videre er genomisk baserte tilnærminger ikke laget for å definere den sykdomsfremkallende potensialet i
cis
– og trans-virkende varianter som påvirker genekspresjon. Disse begrensningene kan være delvis overvunnet av cDNA-baserte analyser, slik som analysen av allel-spesifikk ekspresjon (ASE) som har potensial til å avdekke germline defekter som disponerer for kolorektal kreft, selv når en sykdomsfremkallende variant ikke er fastslått eller rollen variantene detekterte er uklar [23-27].
i den foreliggende undersøkelse, viser vi resultatene av integrerende analyser som er utført på en serie av 132 italienske HNPCC pasienter ved hjelp av tidligere utviklet og nye analyser for screening av kimlinje og tumor defekter. Vi viser at kimcellelinje ASE analyse utfyller gDNA-baserte analyser i identifisering og karakterisering av defekter som predisponerer for CRC. Vår integrerende tilnærming viser også at inkludering av
MUTYH Hotell og
APC
i screening øker antall patogene varianter oppdaget. denne studien med tanke på antall pasienter som ble analysert, panel av gener skjermet og rekke metoder benyttes, gir indikasjoner for klinisk oversettelse av HNPCC genetisk testing som kan brukes på tradisjonelle eller NGS tilnærminger. Spesielt våre resultater støtte inkluderingen av ASE analyse og screening av polypose gener i algoritmer for genetisk diagnostikk av HNPCC.
Materialer og metoder
Pasienter og integrerende screening strategi
Vi studerte 132 urelaterte AC-i eller AC-II pasienter som tidligere ble rekruttert fra forskjellige italienske institusjoner. DNA og RNA ble ekstrahert som tidligere beskrevet [25]. Alle deltakerne i studien ga skriftlig informert samtykke etter verbal rådgivning og studien ble godkjent av etikkomiteen ved University of Chieti. Tumor MSI og IHC analyser ble utført i probands med tilgjengelige tumorprøver. Alle pasienter, uavhengig av resultatene av svulsten MSI og IHC analyser, gjennomgikk screening for germline nukleotidsubstitusjoner i MMR gener som beskrevet nedenfor. Probands negative for patogene nukleotidsubstitusjoner ble videre testet for utvidet germline rearrangements i
MSH2
,
MLH1 Hotell og
EpCAM
, etterfulgt av screening for kimcellelinje
MSH2
og
MLH1
promoter metylering. ASE-analyser av MMR-genene ble utført på pasienter med tilgjengelig RNA og heterozygot for minst én allelisk markør, uavhengig av hverandre fra resultatene av de ovenfor angitte screeninger. Pasienter som negative ved de ovenfor angitte analysene ble testet med hensyn til
APC
og
MUTYH
sekvensvarianter som er beskrevet nedenfor. Variasjonen data identifisert i denne studien har blitt sendt til den internasjonale foreningen for Gastrointestinale Arve Svulster (innsikt, https://www.insight-group.org/variants/database/) database.
Screening for germline nucleotide erstatninger i MMR gener
Pasientene ble opprinnelig screenet for sekvensvarianter i
MSH2 Hotell og
MLH1
hjelp enkelt strand konformasjon polymorphism (SSCP) analyse eller denaturering gradient gel elektroforese (DGGE) . Alle saker negative ved SSCP eller DGGE ble videre undersøkt for varianter i
MSH2
,
MLH1 Hotell og
MSH6
ved denaturering høy ytelse væskekromatografi (dHPLC) og automatisert sekvensering, som påvises noen ytterligere mutasjoner unnsluppet i den innledende screening (data ikke vist). Å forutsi potensielle skadelige effekter av romanen vus vi brukte følgende
i silikoaluminofosfater
verktøy: PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), sile (http: //sile. jcvi.org/), HSF (https://www.umd.be/HSF/), banan (https://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html), Mutation forsmak (http: //www. mutationtaster.org/), Alamut (https://www.interactive-biosoftware.com). Vi har også brukt MAPP-MMR (https://mappmmr.blueankh.com/) og PON-MMR (https://bioinf.uta.fi/PON-MMR/) prediksjon algoritmer som var spesielt godkjent for missense varianter i MMR gener .
Analyse av utvidet germline rearrangements i
MSH2, MLH1 Hotell og
EpCAM
Genomisk
MSH2 Hotell og
MLH1
rearrangements ble undersøkt ved multiplex ligation avhengig probe forsterkning (MLPA) i 78 pasienter negative ved første gangs analyse for sykdomsfremkallende sekvensvarianter eller med vus. Bekreftelse av rearrangementer ble oppnådd ved ikke-fluorescerende multipleks PCR koplet til HPLC (NFMP-HPLC) eller ved lab-på-en-brikke teknologi for analyse av kopitallvariasjoner (LOC-CNV), som beskrevet tidligere [28,29] . Siden den opprinnelige versjonen av
MSH2 /MLH1
MLPA kit (SALSA P003, MRC-Holland, Amsterdam, Nederland) benyttes ikke inkluderer sonder som tilsvarer
EpCAM
, har vi utviklet tre romanen NFMP -HPLC analyser for screening og bekreftelse av genomiske rearrangements påvirker 3 «enden av
EpCAM
og intergeniske
MSH2 Anmeldelser –
EpCAM
regionen (tabell S1). Disse analysene ble utført i en undergruppe av 33 tilfeller med vus eller negativ på tidligere screenings og for hvem DNA ikke hadde blitt brukt opp i tidligere analyser. Breakpoint analyse ble utført som tidligere beskrevet [28,29].
kimcellelinje
MSH2 Hotell og
MLH1
arrangøren metylering
bisulfitt DNA konverteringen ble utført i i 44 tilfeller negative ved innledende screening for sykdomsfremkallende sekvensvarianter og genomiske rearrangements bruker Imprinting DNA modifikasjon kit (Sigma, St. Louis, MO), i henhold til produsentens instruksjoner. Screening for kimcellelinje
MLH1
promoter metylering ble utført ved metylering spesifikk PCR (MSP) ved hjelp av en degenerert og en metylering spesifikk primer designet av Suter et al [30]. Videre har vi laget en kontroll PCR hvor degenerert primer som brukes for MSP ble koblet til en primer spesifikk for unmethylated DNA (tabell S2). DNA fra SW48 cellelinje ble brukt som positiv
MLH1
promoter metylering kontroll. Screening for kimlinje
MSH2
promoter metylering ble utført ved MSP hjelp av primere som var spesifikke for denaturert og unmethylated alleler, som beskrevet av Chan et al [31]. Positive kontroller for
MSH2
promoter metylering ble oppnådd ved hjelp av kontroll DNA som hadde blitt universelt denaturert ved hjelp av S-adenosylmethionine (SAM) og M.SssI CpG methyltrasferase (New England Biolabs, Ipswich, MA).
ASE analyse
ASE analyser av
MSH2
,
MLH1
eller
MSH6
ble utført av primer extension hos pasienter med tilgjengelige RNA og heterozygot for minst ett allel markør, uavhengig av deres mutasjonsstatus. ASE-analyser ble utført som tidligere beskrevet ved hjelp av enten
32P-merket eller umerkede primere koblet til analyse av Molecular Imager (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA) eller ved DHPLC (Transgenomic, Omaha, NE), henholdsvis [23,25 ]. Tre ASE analyser ble utført både med
32P-merkede primere og med den DHPLC-baserte metode, som ga sammenlignbare resultater (tabell S3). For hver ASE analysen ble det midlere forhold oppnådd med gDNA maler som anvendes for å normalisere data generert i primer-forlengelses eksperimenter utført ved bruk av cDNA-maler. Disse normaliserte cDNA /gDNA forhold ble betegnet som ASE verdier. Basert på tidligere studier, bare merket ubalanser i forhold allelet uttrykk som tilsvarer det dobbelte ubalanser i allele forholdstall ( 1: 2 eller 2: 1-forhold, noe som tilsvarer ASE verdier 0,5 eller 2, henholdsvis) ble konservativt vurdert bevis av en sykdomsfremkallende endring [23,25,26]. Disse ASE verdier avviker mer enn 3 SDS fra middelverdier observert i heterozygote kontroller for to CRC disponerende gener som vi tidligere har analysert basert på tilgjengeligheten av ASE markører hyppige i den italienske befolkningen (ASE av
MLH1
i kontroller, bety 1,04, SD 0,11, bruker rs1799977; ASE av
APC
i kontroller, mener 1.25, SD 0,21, bruker rs2229992) [24,25].
Totalt ASE i
MLH1
,
MSH2 Hotell og
MSH6
ble målt ved hjelp av 8 tidligere beskrevet [23,25] og 3 nye analyser. Primere for nye analyser er beskrevet i tabell S4.
Tumor MSI og IHC analyser
Tumor ble utført ved de samarbeidende institusjonene som rekrutterte pasientene. MSI ble analysert i de fleste av probands (93/102) med tilgjengelige tumorprøver, i henhold til internasjonale retningslinjer [32]. Immunhistokjemisk uttrykk for MSH2, MLH1 og MSH6 proteiner ble analysert for 73/102 tilfeller med tilgjengelige tumorprøver som tidligere beskrevet [13].
Screening for
APC Hotell og
MUTYH
nukleotidsubstitusjoner
Den kodende sekvensen og intron-exon grenser
APC Hotell og
MUTYH
ble analysert ved direkte sekvensering i 19 probands negative ved MMR-genet screening. Disse pasientene ble valgt basert på tilgjengeligheten av DNA og på tilstedeværelse av minst en polypp på diagnose i probands og /eller pårørende.
Resultater
Ulike innfallsvinkler ble brukt til å analysere 132 urelaterte HNPCC pasienter for sykdomsfremkallende defekter i MMR og ikke-MMR gener.
MSH2, MLH1 og MSH6 nucleotide varianter
Vi oppdaget 41 tidligere beskrevet og 15 nye MMR genvarianter (tabell 1 og tabell S5). Disse inkluderte 27 tap-av-funksjon nukleotid endringer (tull og rammeskifte) innføre tidlig avslutning kodon (PTCs), 14 varianter plassert på spleiseseter, 3 i-frame slettinger og 12 missense erstatninger. Åtte av spleisesete varianter ble eksperimentelt verifisert til å assosiere med endret skjøting, inkludert 7 analysert i tidligere studier [33-38] og en i denne studien (se nedenfor), mens 5 ble ansett patogene å være plassert på den nesten invariante dinukleotider hos intron ender (Tabell 1 og tabell S5). To i-frame slettinger og 9 missense varianter ble rapportert som sykdomsfremkallende eller potensielt patogene basert på
i silico
analyser, funksjonelle analyser, kvalitativ klassifiserings eller multifaktoriell prognosemodellen i tidligere rapporter [39-44], som spesifisert i tabell S5.
Pasienter
AC
MSI
MMR defekt IHC
kimcellelinje skader
en
nucleotide varianter og rearrangements
endret ASE
b
LCH-1IMSI-HMLH1
MLH1
c.301GA (p.Gly101Ser) GDLM- 2 # III-1IMSI-HMSH2
MSH2
c.942 + 3ATGDLM-7 # III-3IMSI-HMLH1 /MSH2
MSH2
Del exon 7LCH-8IMSI-HMSH2GDLV-11 # II-9IMSI- HMLH196 # 1636IIMSI-HMLH1GDLM-9 # II-2IMSI-HMSH2
MSH2
c.1549_1550delGCinsT (p.Ala517Tyrfs * 9)
MSH2
GDLG-18 # III-19IMSI-Hn.i.
MSH2
Del exon 3LCH-19IMSI-HMSH2
MSH2
c.2245GT (p.Glu749*)GDLG-20#II-1IMSI-HMLH1
MLH1
LCH-27IMSI-HMSH2
MLH1
GDLG-49#IV-2IMSI-HMSH2
MSH2
c.1024GA (p.Val342Ile) GDLV-52 # II-2IMSI-HMLH1
MLH1
LCH-57IMSI-HMLH1
MLH1
c.1989GT (p.Glu663Asp) LCH-58IMSI-HMSH2
MSH2
c.2005 + 3_2005 + 14del12LCH-59IMSI-HMSH2
MLH1
c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31) LCH-88IMSI-Hn.a.
MLH1
c .1731GA (p.Ser577Ser) LCH-93IIMSI-Hn.a.
MSH2
c.1046CG (p.Pro349Arg) 19 # 719IIMSI-HMSH2
MSH2
c.1444dupA (p.Arg482Lysfs * 6) 297 # 875IMSI-HMLH1
MLH1
c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 307 # 2619IMSI-HMLH1
MLH1
c.199GA (p.Gly67Arg) 309 # 3478IMSI-HMSH2
MSH2
Del eksoner 9-10311 # 2042IMSI-Hn.i.
MLH1
c.731GA (p.Gly244Asp) 338 # 1489IMSI-HMLH1 /MSH6
MLH1
c.382GC (p .Ala128Pro) 349 # 1581IMSI-HMSH2
MSH2
c.942 + 3AT363 # 2541IMSI-HMSH2
MSH2
Del eksoner 9-10412 # 3342IIMSI-HMSH2
EpCAM
Del ekson 3
– MSH2
ekson 7 459 # 2809IMSI-HMSH2
MSH2
Del 5’upstream region – ekson 8476 # R26IMSI-HMSH2
MSH2
Del eksoner 1-6667 # 2412IMSI-HMSH2
MSH2
c.942 + 3AT668 # 2371IMSI-HMLH1
MLH1
c.545 + 3AG670 # 2413IMSI-HMLH1
MLH1
c.1989GT (p.Glu663Asp) 727 # AAIMSI -HMSH2
MSH2
c.942 + 2TA814 # DGRIMSI-Hn.a
MSH2
c.. [376GγA (;) 2251G C] (p [Gly126Ser (;) Gly751Arg].) 986 # 3487IMSI-HMLH1
MLH1
c.1731 + 4AG 1068 # 3015IMSI-HMLH1
MLH1
c.1050delA (p.Gly351Aspfs * 16) 1070 # 2957IMSI-HMSH2
MSH2
c.2287G . C (p.Ala763Pro) 1080 # 2974IIMSI-Hn.a
MSH2
c.2089CT (p.Cys697Arg) 1251 # 3260IIMSI-HMSH2
MSH2
c.374C T (p.Gln125 *) 1256 # 3479IIMSI-HMSH2
MSH2
c.1786_1788delAAT (p.Asn596del) 1293 # 3286IMSI-HMLH1
MLH1
Del exon 61301 # 3323IIMSI-HMSH2
MSH2
c.2519_2530del12 (p.Val840_Cys843del) 1459 # 3324IIMSI-HMLH1
MLH1
c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) LES1 # LPIIMSI-Hn.a.
MLH1
c.731GA ( p.Gly244Asp) 298 # 668 /1584IMSI-HMSH2
MSH2
c.1077-2A C319 # 1004IMSI-HMSH2
MSH2
c.1046CG (p.Pro349Arg) 350 # 1933IMSI-HMLH1
MLH1
c.676CT (p.Arg226 *) 360 # 2916IMSI-HMLH1 /MSH6
MLH1
c.1731 + 4AG
MLH1
903 # 2630IIMSI-HMSH2
MSH2
Del exon 31218 # 3238IMSI-HMLH1
MLH1
DUP eksoner 2-31515 # 3442IIMSI-HMSH2
MSH2
c.1255CT (p.Gln419 *) 334 # 1170IMSI-HMSH2
MSH2
c.278_279delTT (p.Leu93Profs * 6)
MSH2
711 # 2495IIMSI-HMLH1
MLH1
c.1459CT (p.Arg487 *) 1205 # BAIIMSI-HMLH1
MSH2
c.1215CA (p.Tyr405 *) 1206 # GEIMSI-HMSH2
MSH2
c.1046CG (p.Pro349Arg) 357 # 2038IMSI-Hn.a.
MSH2
c. 2294delC (p.Ala765Valfs * 47) 600 # 2237IMSI-Hn.a.
MSH2
Del eksoner 4-61138 # 3149IMSI-Hn.a.
MLH1
c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 737 # 2838IMSI-Hn.a.
MLH1
c.1989GT (p.Glu663Asp) TO9726IMSI-Hn.a.
MLH1
c.2040CA (p.Cys680 *) GE9804IMSI-Hn.a .
MSH2
c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2) GE9726IMSI-Hn.a.
MSH2
c.2536CT (p.Gln846 *) SI9744IMSI-Hn.a.
MSH2
c.942 + 3ATGE9914IMSI-Hn.a
MLH1
c.677 + 1GAF102IMSI-Hn.a
MLH1
c.546-2A … GSI9606IMSI-Hn.a
MLH1
c.911AT (p.Asp304Val)LCH-4IMSI-Hn.i.LCH-12IMSI-Hn.i.LCH-85IMSI-Hn.a.LCH-47IMSI-Hn.a.871#R08IMSI-Hn.a.GE0101IMSI-Hn.a.GE9801IMSI-Hn.a.GE9903IIMSI-Hn.a.LCH-6IMSSn.a.LCH-13IMSSn.i.LCH-79IMSSn.a.296#776IMSSn.i.303#2547IMSSn.i.308#1260IMSSn.i.
MUTYH
C. [1145G A] [1395_1397delGGA] (p.[(Gly382Asp)];[(Glu466del)]313#1381IMSSn.a.342#2803IMSSn.i.365#2192IIMSSn.a.368#2506IMSSn.i.369#2169IMSSn.a.370#3105IMSSn.i.
APC
c.1100_1101delCT (p.Ser367Cysfs*10)633#3114IMSSn.i.728#2509IMSSn.i.818#2543IMSSn.i.933#R14IMSSn.a.1165#3159IMSSn.i.1193#3187IMSSn.i.SV0001IMSI-Ln.a.TO9913In.a.MLH1705#3035In.a.MLH1
MLH1
c.1367C A (p.Ser456 *) 1008 # 2829In.a.MSH2
MSH2
c.1757C G (p.Ser586 *) 1077 # 2979In.a.MLH1
MLH1
c.453 + 1GA1420 # 3343IIn.a.MSH2
MSH2
c.868GT (p.Glu290 *) LCH-15In.ani
MLH1
c.1918CT (p.Pro640Ser) LCH-23IIn .ana
MSH2
Del exon 1GDLG-29 # III-8IIn.ana
MLH1
c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) GDLG-31 # III-11In.ana
MLH1
c.954delC (p.His318Glnfs * 49)
MLH1
LCH-86In.ana
MSH2
c.212-1G A83 # 3103In.ana
MLH1
Del exon1
MLH1
601 # 2307In.ana
MSH6
c.3013CT (p.Arg1005 *) 1157 # 834In.ana
MSH2
c.119delG (p.Gly40Alafs * 24) 324 # R10In.ana
MLH1
c.1896GA (p.Glu632Glu) 337 # 2224In.ana
MLH1
c.1989GT (p.Glu663Asp) 359 # 2578In.ana
MLH1
c.1639_1643dupTTATA (p.Leu549Tyrfs * 44) 463 # 3031In.ana
MLH1
c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 602 # 2416In.ana
MLH1
c.1011delC (s. Asp338Ilefs * 29) 985 # 2683In.ana
MLH1
Del exon 61074 # 3001In.ana
MSH2
c.1059delG (p.Asn354Thrfs * 3) 1200 # 3221In.ana
MSH6
c.738_741delAAAA (p.Lys246Asnfs * 32) GE0201In.ana
MSH2
Del exon16GE9911In.ana
MLH1
c.1011delC (p.Asp338Ilefs * 29) TO0012In.ana
MLH1
c.1888_1892delATTGA (p.Ile630 *) TO0225In.ana
MLH1
c.2040CA (p.Cys680 *) GE0410In.ana
MSH2
c.942 + 3ATGE0330In.ana
MSH2
c.1216CT (p.Arg406 *) 162 # 2696In.ana
MLH1
c.1559-2A GLCH-10In.a.n.i.LCH-16In.a.n.a.LCH-51In.a.n.a.LCH-53In.a.n.a.54#982In.a.n.i.314#1200In.a.n.i.353#1114In.a.n.a.455#2186In.a.n.a.1082#2982In.a.n.a.F435In.a.n.a.GE0002In.a.n.a.Table . 1. Oversikt over MSI, IHC og mutasjonsstatus i 132 HNPCC urelaterte pasienter møte AC hoteller, NA, data ikke tilgjengelig; ni, IHC ikke informative.aNovel varianter er i fet skrift. Kimcellelinje MMR gendefekter for enkelte pasienter har tidligere blitt rapportert (se tabell 2 og tabell S3, S5, S6 og S7). Vi har også oppdaget flere varianter tidligere rapportert som ikke-patogen (se tabell S5) .bASE verdi 0,5 eller 2. CSV Last ned CSV
Vi utførte
i silico analyser
å antyde den funksjonelle effekten av 4 varianter (3 missense og en intronic) som det ikke slik informasjon var tilgjengelig fra tidligere rapporter. For tre romanen missense varianter en skadelig effekt på protein funksjon ble spådd av
i silikoaluminofosfater
verktøy, inkludert PON-MMR og MAPP-MMR (tabell S5).
I silikoaluminofosfater
verktøy indikert en potensiell effekt på spleising for romanen intronic varianten (
MLH1
c.1731 + 4AG) (se nedenfor) (tabell S5). En ytterligere variant, den nye
MSH2
i-ramme sletting (c.2519_2530del12, p.Val840_Cys843del), ble ansett som potensielt patogene fordi det fjerner 4 aminosyrerester høyt konservert i andre arter, og er plassert i den ATPase domene av MSH2 protein, hvor variasjonene ble tidligere rapportert å forårsake defekter i mismatch bindende eller frigi [45,46].
en pasient (814 # /DGR) ble funnet å bære to missense erstatninger i
MSH2 product: (c.376GA og c.2251GC) spådd å være sykdomsfremkallende (se tabell S5). Dessverre finnes det ikke noen slektninger til denne pasient var tilgjengelig for testing gen og fasen av de to variantene kunne ikke fastslås.
Totalt screening for sekvensvarianter i HNPCC relaterte gener tillot påvisning av 56 ulike erstatninger med en klar eller potensiell patogen betydning i 72 pasienter, inkludert 26 i
MLH1 plakater (46,5%), 28 i
MSH2 product: (50%) og to i
MSH6 plakater (3,5%) (tabell 1 og tabell S5).
Genomisk rearrangements av MSH2, MLH1 og EpCAM
Screening av
MLH1 Hotell og
MSH2
av MLPA, etterfulgt av bekreftende tester ved hjelp LOC-CNV og /eller NFMP-HPLC indikerte tilstedeværelse av genomiske rearrangements (inkludert 14 slettinger og en duplisering) i 15 av de 78 pasienter som ble analysert (19%) (Tabell 1 og Tabell S6). Genet påvirket av omorganisering var
MSH2
i 10 probands (13%) og
MLH1
i 5 probands (6,5%).
EpCAM
rearrangements ble undersøkt ved NFMP-HPLC hos pasienter uten påvisbare patogene varianter eller med vus. Videre
EpCAM
rearrangements ble evaluert i 3 pasienter (476 # R26, 459 # 2809 og 412 # 3342) som basert på MLPA og NFMP-HPLC screening hadde bevis for
MSH2
slettinger som involverer første ekson av genet (tabell S6). En av disse pasientene (476 # R26) hadde en sletting av
MSH2
eksoner 1-6 og NFMP-HPLC-baserte EpCAM analyser indikerte at omorganisering ikke utvide til
EpCAM-MSH2
intergeniske regionen (tabell S6). I en annen pasient (459 # 2809), tidligere rapportert å ha en sletting spenner eksoner 1-8 av
MSH2 product: [28], EpCAM analyser viste at slettingen inkluderte
MSH2
5 «oppstrøms region, men spart 3»-enden av
EpCAM
(figur S1). I den tredje pasienten (412 # 3342) slettingen påvirkes alt
EpCAM
eksoner som inngår i EpCAM-bestemmelser (eksoner 3, 8 og 9) (figur S1). Denne delesjon forlenges opp til ekson 7 av
MSH2
, som indikert ved MLPA og NFMP-HPLC (Tabell S6). Nei
EpCAM
rearrangements ble påvist i de andre pasientene analysert. Alle
MLH1, MSH2 Hotell og
EpCAM
rearrangements ble bekreftet av minst 2 uavhengige analyser basert på MLPA, NFMP-HPLC eller LOC-CNV. I 9 tilfeller bekreftelse av rearrangements kan også oppnås ved stoppunkt analyse eller RT-PCR (tabell S6), som tidligere rapportert [28,29].
kimcellelinje arrangøren metylering
kimcellelinje MMR-genet promoter metylering ble analysert i tilfeller negative ved innledende screening for patogene nukleotid varianter og genomiske rearrangements. CpG promoter metylering ble observert bare med positive kontroll DNA (SW48 cellelinje for
MLH1 Hotell og universelt denaturert kontroll DNA for
MSH2
, henholdsvis – data ikke vist).
kimcellelinje ASE analyse
Blant de 22 pasientene som kunne analyseres, vi observerte endret germline ASE av
MLH1
i 6 pasienter og av
MSH2
i 2 pasienter (Tabell 2 og Tabell S7). Av disse pasientene, to viste monoallelic uttrykk for
MLH1 plakater (GDLV-52 # II-2 og 83 # 3103) og 6 hadde markert ubalansert uttrykk for
MLH1 plakater (360 # 2916, GDLG- 20 # II-1, GDLG-31 # III-11 og LCH-27, verdier betyr ASE 4.7, 2.01, 2.24 og 2.64, henholdsvis) eller
MSH2 plakater (GDLM-9 # II-2 og 334 # 1170, mener ASE verdier 3,58 og 9,20, henholdsvis). De resterende pasientene hadde beskjedent ubalansert eller balansert ASE (Tabell 2 og Tabell S7). ASE verdier observert i de 22 probands er avbildet i figur 1. For referanse, viser også figuren de verdier som vi tidligere har målt i kontrollpersoner heterozygot for den hyppige c.655AG variant (rs1799977) av
MLH1 product: [ ,,,0],25].
Pasienter
en
Patogene germline varianter
ASE analyse
Gene
ASE markør
Konsekvens
normalisert ASE verdi (SE)
b
GDLM-2 # III-en
MSH2
c.942 + 3AT
MLH1
c. 655AGp.Ile219Val1.00 (0,07) LCH-8
MSH2
c.984CTp. (=) 1,09 (0,07)
MLH1
c.655AGp.Ile219Val0.97 (0,16) GDLG -18 # III-19
MSH2
Del ekson 3
MLH1
c.655AGp.Ile219Val0.91 (0,10) LCH-27
MLH1
c.655AGp.Ile219Val2. 64 (0,38) GDLG-31 # III-11
MLH1
c.954delC (p.His318Glnfs * 49)
MLH1
c.655AGp.Ile219Val2.24 (0,07) LCH-51
MLH1
c.655AGp.Ile219Val0.84 (0,10) LCH-59
MLH1
c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31)
MLH1
c. 655AGp.Ile219Val0.97 (0,11) GE9804
MSH2
c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2)
MLH1
c.655AGp.Ile219Val1.09 (0,05) 96 # 1636
MLH1
c.655AGp.Ile219Val1.17 (0,06) 334 # 1170
MSH2
c.278_279delTT (p.Leu93Profs * 6)
MSH2
c.278_279delTTp.Leu93Profs * 69.20 (3,97) 359 # 2578
MLH1
c.1639_1643dupTTATA (p.Leu549Tyrfs * 44)
MLH1
c.655AGp.Ile219Val1.33 (0,04) 314 # 1200
MLH1
c.655AGp.Ile219Val1.01 (0,03) 1082 # 2982
MLH1
c.655AGp.Ile219Val1.07 (0,02)
MSH6
c.540TCp. (=) 1,10 ( 0,12) 83 # 3103
c
MLH1
Del exon 1
MLH1
c.655AGp.Ile219ValLoss av G alleleTable 2. Resultater av primer extension ASE analyser utført i denne studien.
Ain Tabell S7 vi oppsummere resultatene av ASE analyser for ytterligere 8 pasienter inkludert i studien, som ASE resultatene hadde vært tidligere rapportert [23,25] .bMarkedly ubalansert ASE verdier er uthevet .cFor denne pasienten PE-analyse utført i den foreliggende undersøkelse bekrefter tapet av uttrykket for G-allelet tidligere er vist av cDNA-sekvensering [28]. CSV Last ned CSV
ASE verdier mellom de 2 stiplede linjer tilsvarer mindre enn todelt ubalanser i allele forhold (se Methods).
Tre pasienter med endret kimcellelinje ASE (GDLG-31 # III-11, 83 # 3103 og 334 # 1170) var kjent bærere av
MLH1
eller
MSH2
slettinger. Omvendt, hos 2 pasienter med ubalansert ASE innledende screening for patogene varianter av SSCP eller DGGE var negativ, men påfølgende re-analyse av DHPLC og sekvensering identifisert en rammeskifte av
MSH2 plakater (sak GDLM-9 # II-2) og en intronic
MLH1
variant med en potensiell effekt på spleising (sak 360 # 2916, se nedenfor) (Tabell 1 og Tabell S7). Totalt sett varianter med en klar eller potensiell patogen rolle ble påvist i 5 av de 8 pasienter med ubalansert ASE (tabell 1 og tabell S7), mens i 3 pasienter (GDLG-20 # II-1, LCH-27 og GDLV-52 # II-2) endret ASE var den eneste kimcellelinje feilen oppdages [23,25].
analyse av en roman antatt spleising variant
i silico
analyse av ulike spleise prediksjon programvareverktøy (se Metoder) indikerte at effekten av romanen
MLH1
c.1731 + 4AG variant deles av 2 probands (360 # 2916 og 986 # 3487) var usikker. Imidlertid, de foreslo at denne endringen kan påvirke skjøting ved å redusere styrken av den donorsetet (gjennomsnittlig reduksjon på 13%, område 7,4 til 22%). Tilgjengeligheten av cDNA i pasient 360 # 2916 tillot oss å teste om c.1731 + 4AG variant ble knyttet til en spleising defekt. Denne forandringen var unnvikende ved innledende testingen av RT-PCR-amplifisert cDNA fordi bare villtype-transkripter ble avslørt ved direkte sekvensering eller ved elektroforetisk analyse (data ikke vist). Men basert på resultatene av ASE analyse som viser en markert ubalanse i allel uttrykk (gjennomsnittlig normalisert allel ratio 4.7, hentet fra radioaktive og DHPLC-baserte analyser, tabell S3), hypotese vi at en endret spleising kan bli avslørt av DHPLC. Som forutsagt, desto mer følsom DHPLC analyse tillot påvisning av en hovedtopp med en retensjonstid tilsvarende villtype-transkripsjon, og av en mindre topp som svarer til en mindre uttrykt kortere transkripsjon. Sekvensering bekreftet at mindre uttrykt
MLH1
transkripsjon gjennomført en ut-av-frame ekson 15 hopper (figur S2).
