Abstract
Nye rapporter har indikert at
KRAS Hotell og
TP53
mutasjoner forutsi respons på behandlingen i tykk- og endetarmskreft. Men lite er kjent om forholdet mellom disse to vanlige genetiske endringer. Micro-RNA (mirnas), en klasse av ikke-kodende RNA innblandet i cellulære prosesser, har blitt stadig mer knyttet til
KRAS Hotell og
TP53
. Vi antok at dødelig-7a (la-7a) miRNA regulerer
KRAS
gjennom
TP53
. For å undersøke sammenhengen mellom
KRAS, TP53
, og la-7a, vi brukte HCT116
KRAS
mut
menneskelige kolorektal kreft celler med fire ulike genotypiske endringer i
TP53
(
TP53
– /-, TP53
+/-, TP53
Mut /+, etter og
TP53
mut /-
). Ved hjelp av disse cellene vi observerte at K-Ras aktivitet var høyere i celler med mutant eller slått ut
TP53
alleler, som tyder på at villtype
TP53
kan undertrykke K-Ras aktivitet. La-7a var til stede i HCT116
KRAS
mut
celler, selv om det ikke var noen sammenheng mellom la-7a nivå og
TP53
genotype status. Å utforske hvordan la-7a kan regulere K-Ras i forskjellig
TP53
genotype celler vi brukte la-7a hemmer og demonstrert økt K-Ras aktivitet på tvers av alle
TP53
, og dermed bekreftende tidligere rapporter som la-7a regulerer K-Ras. For å vurdere potensielle kliniske implikasjonene av dette regulatoriske nettverk, undersøkte vi påvirkning av
TP53
genotype og la 7a hemming på tykktarmskreft celle overlevelse etter chemoradiation terapi (CRT). Vi har observert at celler med fullstendig tap av villtype
TP53
alleler (
– /- eller
– /mut) var resistente mot CRT etter behandling med 5-fluorouracil og stråling. Ytterligere økning i K-Ras aktivitet med let-7a hemming ikke påvirke overlevelse i disse cellene. I motsetning til celler med enkel eller dobbel villtype
TP53
lene var moderat mottakelig for CRT og utstilt motstand når la-7a ble hemmet. Oppsummert viser våre resultater en kompleks regelverk som involverer
TP53
,
KRAS
, og la 7a. Våre resultater kan gi ledetråder til å forstå og målrette disse interaksjoner i kolorektal kreft
Citation. Luu C, Heinrich EL, Duldulao M, Arrington AK, Fakih M, Garcia-Aguilar J et al. (2013)
TP53 Hotell og La-7a mikro-RNA Reguler K-Ras Aktiviteten i HCT116 tykktarmskreftceller. PLoS ONE åtte (8): e70604. doi: 10,1371 /journal.pone.0070604
Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR), Italia
mottatt: 04.03.2013; Godkjent: 21 juni 2013; Publisert: 01.08.2013
Copyright: © 2013 Luu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den 4
th vanligste kreft og 2
nd vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i USA [1]. Nylige fremskritt som har bedre resultater i CRC har inkludert identifisering av nøyaktige prognostiske og prediktive molekylære biomarkører [2] – [4]. Disse har inkludert genetiske endringer i
KRAS Hotell og
TP53
, som ofte oppdages hos pasienter med CRC.
KRAS
mutasjoner er tilstede i omtrent 30-50% av CRC, men også i 17-25% av alle humane tumorer [2], [5] – [7]. Tilsvarende
TP53
endringer er vanlig hos pasienter med CRC (nesten 50%) [8]. Begge prognostiske og prediktive roller er identifisert for begge genene [9]. Vår egen gruppe og andre har nylig vist at påvisning av samtidige
KRAS Hotell og
TP53
mutasjoner, med en forekomst på 5% til 20% i CRC pasienter, korrelert med motstand mot neoadjuvant chemoradiation terapi ( CRT) i pasienter med endetarmskreft [10] – [12]. Til tross for hyppigheten av disse mutasjonene i CRC, er lite kjent om interaksjoner mellom de to genene.
Koblingen mellom disse to ofte endrede gener i CRC kan ligge i mikro-RNA (miRNA), en klasse av ikke- kodende RNA som fungerer i transkripsjonsregulering, og mer spesifikt kan påvirke reguleringen av celleproliferasjon og apoptose [13], [14]. Nye rapporter har antydet at tumor suppressor aktivitet av miRNA dødelig 7a (la-7a) kan være på grunn av sin tilknytning til
KRAS Hotell og at hemming av tumorvekst kan forekomme ved undertrykkelse av K-Ras uttrykk ved brev 7a [15], [16]. Emerging kliniske data tyder på at intra-tumor la-7a uttrykk korrelerer med tumorrespons og total overlevelse i metastatisk kolorektal kreftpasienter som får epidermal vekstfaktor (EGFR) målretting midler både i
KRAS
villtype og mutant populasjoner [17 ]. Andre studier har spekulert i at rollen som
TP53
i DNA-reparasjon og apoptose kan delvis regulert av mirnas, inkludert la-7a [18], [19]. Derfor er en kompleks regulatoriske nettverk for
TP53 Hotell og
KRAS
kan knyttes av la-7a.
For å undersøke mulige interaksjoner mellom
TP53
,
KRAS
, og la-7a, analyserte vi en unik familie av kolorektal kreft cellelinjer med mutert
KRAS Hotell og modifikasjoner i
TP53
genotype. Disse cellene mulig for oss å undersøke endringer i K-Ras uttrykk og aktivitet som korresponderte med variasjoner i
TP53
genotype. Videre kunne vi bedre avhøre rolle la-7a i innstillingen av mutant
KRAS Hotell og ulike
TP53
genotyper. Våre resultater tyder på nye økninger i K-Ras aktivitet med forskjellige
TP53
genotyper. Men vi fant ikke en klar sammenheng mellom la-7a nivå og
TP53
genotype. Likevel ble endringer i K-Ras aktivitet regulert av skuffelse 7a. Denne første rapporten fra
TP53 Hotell og la 7a regulering av K-Ras aktivitet gir ledetråder til bedre å forstå det komplekse samspillet mellom
TP53 Hotell og
KRAS
.
Materialer og metoder
Cell Culture
Den menneskelige CRC cellelinje HCT116, husing en enkelt mutant
KRAS
allel og dobbel villtype
TP53
(
TP53
+ /+
) alleler, ble endret i fire stabile cellelinjer med ulik
TP53
genotyper (
TP53
– /-, TP53
+/-, TP53
Mut /+, etter og
TP53
mut /-
). Den overordnede og modifiserte cellelinjer ble vennlig levert av Dr. Bert Vogel (Johns Hopkins University, Baltimore, MD) [20]. Mutante og knockout allel ble begge brukt til å vurdere potensielle forskjeller mellom de to alleler, som foreslått i tidligere rapporter [21]. Alle cellelinjer ble bestemt ved DNA-ekstraksjon, polymerase kjedereaksjon (PCR), og sekvensering for
KRAS
og
TP53
genmutasjoner å verifisere genotyper. Celler ble opprettholdt i McCoys 5A medium (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) med 10% føtalt bovint serum (Omega Scientific, Tarzana, CA) og 1% penicillin-streptomycin-glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 5% CO
2 ved 37 ° C
Immunoblotting
Cellelysater ble samlet inn ved hjelp RIPA buffer. (Invitrogen, Carlsbad, California) pluss proteasehemmere (Thermo Scientific, Rockford, IL). Tyve mikrogram protein ble separert på 12% SDS-polyakrylamidgeler og overført til PVDF-membraner (Millipore; Bedford, MA). Membranene ble blokkert i 1 time med 5% ikke-fet tørrmelk og probet over natten med primære antistoffer. Etter vasking ble membranene merket med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer (BioRad, Hercules, CA). Membraner ble utviklet ved hjelp av en kjemiluminescenssubstrat (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) og avbildes. Antistoffer som ble brukt var: anti-K-Ras (Millipore) og anti-GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA)
K-Ras aktivitet
K-Ras-aktiviteten ble målt ved hjelp av Ras. aktivering ELISA Assay Kit (Millipore). I korte trekk, ble cellelysater inkubert med Raf-1 Ras bindende domene (RBD) -agarose. Raf-1-RBD ble anvendt for å fange opp den aktive GTP-bundne K-Ras-protein, som deretter ble detektert ved tilsetning av en anti-K-Ras-antistoff (Millipore). Et HRP-konjugert sekundært antistoff ble deretter tilsatt. En luminometer ble anvendt for å måle signaler etter tilsetning av en kjemiluminescerende reagens (Perkin-Elmer, Shelton, CT). Siden analysene ble utført for å vurdere de relative endringer i K-Ras aktivitet blant de ulike
TP53
genotyper, K-Ras aktivitet fra foreldrenes
TP53
+ /+ linjen ble satt som 1. For analyser med la-7a-inhibitor, hver genotype fungerte som sin egen kontroll. Tre uavhengige analyser ble utført for hver cellelinje, og den midlere absorbans ± standardavvik (SD) ble plottet for hver linje.
Reverse Transcription
RT-PCR ble utført ved anvendelse av Taqman ® miRNA analysen (Invitrogen) etter produsentens protokoll. Kort fortalt ble revers transkripsjon utført ved hjelp av den medfølgende Multiscribe RT ™ Reagent mester mix pluss cellelysatene og de la-7a spesifikke primere (Invitrogen). Reaksjoner ble utført i en termosykler ved 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, og 85 ° C i 5 min.
Real Time PCR-
RT-PCR var utføres ved hjelp av Taqman® miRNA Cells til CT ™ Kit (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble det RT produkt tilsatt til PCR-cocktail (Taqman® miRNA assayreagens pluss tilgjengelig Taqman® konsentrat-blanding) og RT-PCR-reaksjonene ble utført ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med 15 sek ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C i Applied Biosystems 7500 hurtig RT-PCR-system (Foster City, CA). Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer
La-7a Inhibitor
La-7a ble hemmet av miRIDIAN miRNA-hemmere (Dharmacon, Lafeyette, Colorado). Følgende produsentens protokoll. I korthet HCT116-celler (3 x 10
5) ble sådd ut i 6-brønns plater og inkubert over natten. De ble så transfektert med 100 nM av miRIDIAN miRNA inhibitor i 24 timer. Celler ble inkubert i ytterligere 48 timer før den ble anvendt i assays.
Chemoradiation Therapy
HCT116-celler behandlet med CRT i henhold til en etablert protokoll [22]. Etter totalt 72 timers inkubering med la-7a-inhibitor, ble cellene sådd ut i 6-brønns plater og inkubert over natten. Cellene ble deretter behandlet med 4 nM 5-fluorouracil (5-FU) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) i 16 timer hvoretter de ble utsatt for fire Gy av stråling. Drug eksponering ble stoppet 6 timer etter strålebehandling etter medium utveksling. Celler som ikke hadde blitt behandlet med la-7a inhibitor ble behandlet på samme måte med CRT
Fastsettelse av celleviabilitet
Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av en ATP-baserte analysen (Cell Titer-Glo,. Promega ; Madison, WI) som per produsentens protokoll. I korthet HCT116-celler (5 x 10
3) ble sådd ut i 96-brønners plater og inkubert over natten. Cell Titer-Glo reagens tilsatt og cellelyse indusert. Luminescence ble spilt inn med en luminometer. Tre uavhengige eksperimenter ble utført. Viste data representerer den gjennomsnittlige levedyktigheten, som en prosent av levedyktigheten til ubehandlede celler
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført på Microsoft Excel-programvare. (Microsoft, Redmond, Washington). Hvert datapunkt representerer den gjennomsnittlige verdi av tre uavhengige eksperimenter. Kontroll- og behandlingsbetingelser ble sammenlignet med t-test og forskjeller mellom cellelinjer ble sammenlignet ved variansanalyse (ANOVA). P-verdi. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
K-Ras Protein nivå er ikke avhengig av
TP53
Mutation Status
For å bestemme effekten av forskjellig
TP53
genotyper på K-Ras uttrykk, western blot analysen ble utført for å sammenligne protein nivåer. Våre resultater viser at K-Ras uttrykk nivåer ikke ble påvirket av forskjellig
TP53
genotyper (Figur 1a) tyder på at
TP53
regulerer ikke K-Ras protein uttrykk.
A) HCT116-celler med den kjente variasjoner i
TP53
mutasjonsstatus ble samlet og lysert for western blotting for K-Ras uttrykk. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. B) K-Ras-aktivitet ble målt i alle cellelinjer under anvendelse av en Raf pull-down-ELISA-analyse. Resultatene som vises representerer gjennomsnittet av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer i forhold til
TP53
+ /+ celler, p 0,05. Feilsøylene viser standardavvik (SD).
Effekt av
TP53
Mutation Status på K-Ras aktivitet
Effekten av
TP53
genotype på K-Ras-aktiviteten ble målt ved anvendelse av en Raf pull-down-analyse. Vi oppdaget at K-Ras aktiviteten var lavest i
TP53
+ /+
celler. Økt K-Ras aktivitet ble størst i
TP53
mut /-, etterfulgt av
TP53
– /-, etter TP53
+ /mut og TP53
– /+ (44%, 32%, 20% og 10% økning, henholdsvis p 0,05) (figur 1B). Disse resultatene viser at K-Ras aktiviteten var lavest i celler med vill-type
TP53
lene; og de høyeste nivåene ble identifisert i celler med homozygot tap av villtype-TP53 alleler.
La-7a er uttrykt i alle HCT116 linjer
La-7a ekspresjon i HCT116-cellelinjer ble målt av qPCR. La-7a-ekspresjon ble påvist i alle cellelinjer (figur 2A). Det var ingen mønster av endring i la-7a nivåer som samsvarer med endringer i
TP53
genotype.
a) La-7a uttrykk ble målt via QRT-PCR. Dataene som vises betegner en enkelt QRT-PCR utført in triplo. B) celler ble transfektert med 100 nM av la-7a-inhibitor i 24 timer. Protein for kontroll og for hemmet celler la-7a ble samlet for immunoblotting for K-Ras uttrykk. GAPDH fungerte som en lasting kontroll
La-7a regulerer ikke K-Ras protein nivåer
La-7a genekspresjon ble hemmet . 90% av qPCR. K-Ras proteinnivåer ble bestemt på tvers av
TP53
genotyper i nærvær eller fravær av la-7-inhibering. K-Ras protein nivåer ble ikke endret ved la-7a hemming (figur 2B).
La-7A Negativt Regulerer K-Ras aktivitet
Effekten av la-7a hemming på K-Ras aktivitet ble også bestemt. Med skuffelse 7a hemming, økt K-Ras aktivitet på tvers av alle
TP53
genotyper (figur 3). Vi har funnet at K-Ras-aktivitet økt med 50% til 112% sammenlignet med la-7a uttrykkende celler (p 0,05). Den prosentvise økningen i K-Ras aktivitet på tvers av alle cellelinjer ble ikke klart forbundet med
TP53
genotype og om knockout eller mutante alleler var til stede.
Cellelysater ble samlet etter 72 timers inkubering og utsatt til en Raf-trekk ned assay som måler K-Ras aktivitet. Dataene som vises representerer tre forsøk utført in triplo. Feilsøylene viser SD. * P. 0,05
Celler med Wild-type
TP53
Alleler er følsomme for CRT og la-7a Hemming Reduserer Response to CRT
Celler husing forskjellig
TP53
genotyper ble behandlet med CRT og celle levedyktighet ble målt (figur 4). Celler som mangler noen villtype
TP53
allel var resistente mot CRT, mens celler som inneholder et enkelt vill-type
TP53
allel utstilt ca 50% celledød. CRT-behandling ble utført på nytt med la-7a-inhibering, som ble redusert CRT-indusert celledød med nesten 20% i celler huse minst en vill-type
TP53
allel (p 0,05). Celler med homozygot tap av villtype
TP53
alleler (
– /- og
mut /-), som korrelerer med høyeste K-Ras-aktivitet (se figur 1B), viste ingen endring i celleviabilitet uavhengig av endringer i skuffelse 7a uttrykket nivåer.
Celler med varierende
TP53
status +/- la-7a inhibitor ble behandlet med 5-FU etterfulgt av stråling. Cellelevedyktigheten ble målt. Dataene som vises representerer gjennomsnittet levedyktighet som en prosent av ubehandlede celler. * P 0,05, ** p . 0,05
Diskusjoner
KRAS Hotell og
TP53
er vanlige somatiske mutasjoner med prediktiv og prognostisk verdi hos pasienter med CRC. Påvisning av utvalgte
KRAS
mutasjoner har vært assosiert med økt risiko for sykdom tilbakefall og død [23] og har spådd motstand mot anti-EGFR terapi i CRC [9]. På samme måte velger du
TP53
endringer har vært forbundet med dårlige resultater i CRC [8]. Vi har også rapportert at samtidig påvisning av
TP53 Hotell og
KRAS
mutasjoner hos pasienter som fikk neoadjuvant CRT for endetarmskreft spådde svikt i patologisk komplett respons [10]. I denne undersøkelsen ønsket vi å bedre forstå en mulig interaksjon mellom de to gener. Vi identifiserte la-7a som en potensiell kobling mellom
TP53 Hotell og
KRAS
. Før karakterisering av utleid-7a har avslørt sin rolle i å kontrollere cellesyklusprogresjon og divisjon i menneskelige lunge og tykktarm kreft [24], [25]. Videre har Johnson et al. [15] oppdaget at la-7 negativt kontrollert
KRAS
uttrykk i lungekreft. I tillegg RUZZO et al. [17] rapporterte en forbedret total overlevelse hos pasienter med forhøyet la-7a innenfor et
KRAS
mutant kolorektalkreft befolkningen behandlet med anti-EGFR terapi, noe som tyder på en svulst hemmende rolle for la-7a i
KRAS
-aktivert svulster.
TP53
har vært kjent for å transkripsjonelt regulere ekspresjonen av mirnas [26], [27]. Derfor har vi en teori om at det finnes en rekke regulatoriske skritt fra
TP53
å la-7a til
KRAS
. Vi oppdaget at onkogene K-Ras aktivitet ble regulert av
TP53
genotype og la 7a; og endringer i både påvirket reaksjon på CRT.
I vår studie benyttet vi CRC celler som ulike
TP53
genotyper. Disse cellene ble hentet fra en foreldrecellelinje husing gevinsten av funksjon
KRAS
mutasjon ligger på kodon 13 [28], [29]. Det er begrunnelsen for å benytte celler med knockout og mutant
TP53
alleler i vår studie. Til tross for den vanlige tap av villtype
TP53
alleler, knockout og mutant
TP53
alleler er ikke like. Fullstendig tap av
TP53
alleler resulterer i tilsvarende tap av tumor suppressor aktivitet mens mutant
TP53
alleler kan uttrykke p53 proteiner som mister tumor suppressor aktivitet, men også få onkogene egenskaper [21]. Men i denne undersøkelsen vi klarte ikke å finne konsistente forskjeller mellom KO og mutant
TP53
alleler med hensyn til K-Ras aktivitet ved baseline og som svar på la-7a hemming, og heller ikke svar på CRT.
Som nevnt tidligere, ble det observert forandringer i K-Ras-aktivitet med inhibering av la-7a uttrykk. Vi har imidlertid ikke observere tilsvarende endringer i K-Ras protein uttrykk, som er i konflikt med tidligere rapporter demonstrere la-7 miRNA regulering av K-Ras uttrykk [30], [31]. Likevel, våre funn er i samsvar med etablerte reguleringsmekanismer av miRNA. Faktisk kan miRNA gener regulere gjennom en rekke mekanismer fra mRNA oversettelse til stabilitet i cytoplasmaet til cellesyklusaktiviteten [14], [24]. Forskjellene mellom våre resultater og de av tidligere rapporter kan også skyldes forskjeller mellom arter eller cellelinjer som benyttes. Således, mens K-Ras uttrykk forble uendret etter la-7a hemming, våre eksperimenter viste at K-Ras aktivitet ble påvirket av la-7a. I tillegg celler som homozygot villtype
TP53
alleler uttrykte laveste K-Ras aktivitet, noe som tyder på at villtype
TP53
alleler kan undertrykke K-Ras aktivitet. Videre våre resultater er konsistente med en rapport i bukspyttkjertelkreft, viser en økning i K-Ras aktivitet når mutant
KRAS
var forbundet med mutant
TP53 product: [32]. Til slutt, K-Ras aktivitet klart økt når la-7a ble hemmet uavhengig av
TP53
genotype, videre tyder la-7a regulering av K-Ras aktivitet.
Kjemoterapi og stråling er viktige komponenter i multimodal behandling av kirurgiske pasienter med endetarmskreft; og neoadjuvant CRT har vært forbundet med downstaging av sykdom og redusert lokalt tilbakefall [33], [34]. I vår undersøkelse, oppdaget vi at cellene mangler villtype
TP53
alleler var resistente mot CRT og viste ingen celledød ved behandling med CRT. I motsetning til celler med minst en villtype-allelet (
TP53
+ /+, TP53
mut /+
, og
TP53
– /+) hadde omtrent 50% celledød når de behandles med CRT. Disse resultatene er i samsvar med resultatene fra våre tidligere kliniske studier der pasienter med dobbelt mutasjoner (
KRAS Hotell og
TP53
) ikke klarte å demonstrere en patologisk komplett respons etter behandling med neoadjuvant CRT [10]. Når la-7a uttrykk ble hemmet (som fører til økt K-Ras aktivitet), celler som mangler villtype
TP53
alleler (
TP53
– /- Hotell og
TP53
mut /-
) hadde 100% celle overlevelse. Men i celler husing minst en villtype
TP53
allel (tidligere viser noen celledød), økt celleoverlevelse som svar på la-7a hemming. Disse resultatene har to viktige implikasjoner: (1)
TP53
genotype påvirker K-Ras aktivitet og kan forutsi respons på CRT og (2) la-7a uttrykk nivåer påvirker K-Ras aktivitet og kan endre responsen på CRT.
I sammendraget, gir vi innsikt i mulige mekanismer som knytter
KRAS
,
TP53
, og la 7a. Selv om doble mutanter er relativt sjeldne, synes tilstand til å ha en dårlig fenotype med motstand mot CRT. Våre resultater bidra til en bedre forståelse av sammenhengen mellom
KRAS Hotell og
TP53
. Kunnskap om veier som knytter
KRAS
,
TP53
, og la-7a kan gi større innsikt i hvilke mekanismer som driver dårlig fenotypen observert i visse mutasjoner i CRC. Mens vi erkjenner at begrensningene i vår studie omfatter mangel på
i
vivo
modellering og begrensninger av en cellelinje, vårt fokus var på etterforskningen av potensialet krysstale mellom utleid -7a og p53, som vi viser tydelig i vår modell. Det er mulig at denne interaksjonen kan være cellelinje bestemt eller kan avhenge av andre avvikende baner i HCT-116 (MSI-H,
PIK3
mutant). Fremtidig arbeid vil fokusere på å undersøke mulige mekanismer for interaksjon mellom la-7a og p53 på tvers av ulike kolorektal cellelinjer og med ulike molekylære profiler.
