Abstract
Fanconi anemi (FA) pasienter er svært utsatt til solide svulster ved flere anatomiske områder, inkludert hode og nakkeregionen. En undergruppe av hode og nakke kreft (HNCs) er assosiert med «høy risiko» HPV, særlig HPV16. Imidlertid er sammenhengen mellom HPV-onkogener og kreft i FA-pasienter fortsatt uklart. Vi har tidligere lært at FA mangel på mus predisponerer HPV16 E7 transgene mus til HNCs. For å møte HPV16 E6 onkogene potensial etter FA-mangel i HNCs, vi utnyttet HPV16 E6-transgene mus (
K14E6
) og HPV16 E6 /E7-bi-transgene mus (
K14E6E7
) på genetiske bakgrunn tilstrekkelig eller mangelfull for en av de
fanc
gener,
fancD2 Hotell og overvåket deres mottakelighet for HNCs.
K14E6
mus klarte å utvikle svulst. Men E6 og
fancD2
-deficiency akselerert E7-drevet svulst utvikling i
K14E6E7
mus. Den økte svulst forekomst var mer korrelert med E7-drevet DNA skade enn spredning. Vi har også funnet at mangel på pocket proteiner, pRb, p107 og p130 som er veletablerte mål av E7, kan rekapitulere E7 induksjon av DNA-skader. Våre funn støtter hypotesen om at E7 induserer HPV-assosiert HNCs ved å fremme DNA-skade ved inaktivering av lommen proteiner, noe som forklarer hvorfor en mangel på DNA-skade reparasjon ville øke mottakeligheten for E7-drevet kreft. Våre resultater ytterligere demonstrere det uventede funn at FA-mangel ikke disponere E6 transgene mus til HNCs, noe som indikerer en spesifisitet i synergien mellom FA-mangel og HPV-onkogener i forårsaker HNCs
Citation. Park JW, Shin MK, Pitot HC, Lambert PF (2013) høye forekomsten av HPV-Associated hode og nakke kreft i FA Mangel Mus er assosiert med E7 er induksjon av DNA Damage gjennom sin Inaktivering av Pocket Proteiner. PLoS ONE 8 (9): e75056. doi: 10,1371 /journal.pone.0075056
Redaktør: Joseph S Pagano, The University of North Carolina i Chapel Hill, USA
mottatt: 15 juli 2013; Godkjent: 06.08.2013; Publisert: 23.09.2013
Copyright: © 2013 Park et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Kilden av midler til dette arbeidet var National Institutes of Health (NIH) (CA098428, CA022443). NIH hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
fanconi anemi (FA), som er et sjeldent heterogen og recessive genetiske sykdom, viste utviklingsmessige defekter og uregelmessigheter i hematopoetiske stamceller som benmargssvikt og akutt myeloid leukemi, de store fenotyper som vises i tidlig barndom av pasientene . Hittil 15 cellulære gener (
fanc
gener) har blitt identifisert som homozygot mutasjoner er knyttet til FA sykdommen.
fanc
genprodukter (fanc) skriver en DNA-reparasjon sti kalt FA vei med flere andre cellulære proteiner for å hjelpe reparere skadet DNA, spesifikt DNA interstrand kryssbindinger (ICLs) skade. Åtte av fanc proteiner (FancA, B, C, E, F, G, L og M) samhandler med hverandre og danner et protein kompleks kalt FA kjernen komplekse. FancL i komplekset, som har en
E3
ubiquitin ligaseaktivitet sette mono-ubiquitin på FancD2 /I i responsen til den DNA-skade [1]. I tillegg fastlåste DNA replikering gafler i S-fase aktiverer FA pathway [2]. Mono-ubiquitinmolekyler FancD2 /I er lokalisert til områder av DNA-skade der de samhandler med andre proteiner kjent for å være involvert i å reparere skadet DNA, som BRCA1, FancD1 /BRCA2, FancN /PALB2 og Rad51 fører til DNA-reparasjon [3, 4]. Forstyrrelse av dette FA vei fører til økt følsomhet for DNA kryssbindere, Kromosom ustabilitet, spontan søsterkromatidutveksling, og cellesyklus forstyrrelser [5,6]. Nyere studier viser at mono-ubiquitinmolekyler FancD2 rekrutterer kritiske effektor molekyler som FAN1 nuklease (eller SLX4) via sine ubiquitin-bindende domener [7,8]. Således er mono-ubiquitinering av FancD2 kritisk for ikke bare sin kromatin lokalisering, men også virker som et stillas for spesifikke DNA-reparasjons faktorer. FA veien fungerer sammen med homolog rekombinasjon reparasjonssystem (HR) for å opprettholde genomisk ustabilitet [9]. Uttømming av FancD2 hemmer HR reaksjon, noe som indikerer at HR virker på nedstrømssiden av FancD2 [10]. Økt genomisk instabilitet antas å bidra til økt mottakelighet for FA pasienter med kreft. Stamcelletransplantasjon (HSCT) kan være en løsning for å hjelpe de defekter i hematopoetiske celler. Selv etter vellykket HSCT, plateepitelkarsinom (SCCS) på hode og nakke regioner bli en høy risiko for pasienter [11-15].
En undergruppe av hode og nakke kreft (HNCs) (~ 25%) , først og fremst blant svulster fra orofarynx i befolkningen generelt er positivt for høyrisiko menneskelige papillomavirus (HPV), spesielt HPV type-16 (HPV16) som koder for tre onkogen, E5, E6 og E7 [16,17]. Spesielt FA pasienter fra Nord-Amerika en høy andel (84%) av HNC som oppstår på ulike steder i hode og nakkeregionen (dvs. ikke begrenset til orofarynx) ble funnet å være positivt for høyrisiko HPV [18]. I samsvar med en rolle av HPV i disse kreftformene, mutasjoner i p53, en tumor suppressor som er inaktivert av HPV16 E6, ikke ble funnet i HNCs fra disse pasientene. Hos pasienter fra europeiske land, HNCs var HPV DNA negative og over 50% av disse svulstene hadde p53-mutasjoner [18,19]. Gitt disse motstridende kliniske data, er det fortsatt uklart om HPV spille en viktig rolle i HNCs oppstår i FA pasienter. Flere studier peker på et bidrag av FA-mangel i HPV-assosiert sykdom på molekylært nivå. I vevskultur, er HPV16 E7 uttrykk vist seg å stimulere transkripsjon av
fancD2 product: [20] og aktivere FA veien [21]. I en annen studie som gjør bruk av organotypiske kulturer av humane keratinocytter å rekapitulere HPV livssyklus, ble HPV16 og HPV18-indusert epitelial hyperplasia økt i
fancA
-deficient celler eller celler slått ned i sitt uttrykk; mens, restaurering av
fancA
uttrykket dempet denne effekten [22]. Disse studiene tyder på at det er et samspill mellom HPV og FA-reaksjonsveien.
Vårt laboratorium utviklet en dyremodell for HPV-assosiert HNCs ved hjelp av HPV16 onkogen transgene mus ved behandling med et kjemisk karsinogen, 4NQO, som induserer DNA-addukter beslektet med de som er forårsaket av tobakksrelatert kreftfremkallende synergizes med HPV16 onkogener å indusere HNC [23]. Kreft som oppstår i vår dyremodell aksje histopatologiske og molekylære egenskaper med HPV-positive HNCs hos mennesker. Området hvor svulstene oppstår er mindre restriktive enn hos mennesker, antagelig reflekterende av mønsteret av HPV transgene uttrykk gjennom muse oral /øvre GI epitel. Mellom E6 og E7, har HPV16 E7 større potensial til å forårsake HNC i dyremodeller [23,24] med E6 bidra til økt forekomst i kombinasjon med E7 [25]. Bidraget av HPV16 E5 til HNC i denne musemodell er ikke fullstendig evaluert, men ser ut til å være mye mindre enn for E7 (Strati og Lambert, upubliserte resultater).
Vi har tidligere vurdert påvirkning av FA sti på forekomsten av HNCs i mus som uttrykker bare den HPV16 E7 onkogen. Mangel i FA pathway høyt økt HPV16 E7-drevet svulst forekomst [26]. Men i HPV-positive kreft hos mennesker, E7 er alltid funnet å være co-uttrykkes sammen med E6. Derfor fulgte vi studier som er beskrevet her til adresse påvirkninger FA sti i hode og nakke karsinogenese i sammenheng med mus som uttrykker E6 alene eller sammen med E7. Spesielt vi generert
K14E6 Hotell og
K14E6E7
transgene mus på
fancD2
-tilstrekkelig og -deficient bakgrunn. Vi observerte en signifikant økning i tumor insidens og alvorlighetsgrad av neoplastisk sykdom i
K14E6E7 Twitter /
FancD2
– /-
mus sammenlignet med
K14E6E7 Twitter /
FancD2
+ /+
mus; Men
fancD2
-deficiency ikke øke enten avlesning for tumordannelse i
K14E6
mus som uttrykker E6 alene. Både HPV16 E6 og E7 forårsaket en økning i hyppigheten av celler som støtter DNA-syntesen, og dette ble utvidet på FA-manglende bakgrunn. Faktisk FA mangel alene førte til en økning i celleproliferasjonen. Men denne induksjon av celleproliferasjon ikke korrelerer med påvirkning av FA veien på tumorigenesis. På den annen side frekvensen i epitel av tungen og spiserøret av γ-H2AX foci-positive celler, en markør for DNA-skade reaksjon, ble korrelert med tumor forekomst. Denne markøren ble indusert i vev som uttrykte den E7 onkogen; mens, E6 fremkalte ikke uttrykk for denne markøren av DNA skade respons. I tillegg er to biomarkører, MCM7 og p16, som brukes til å skille HPV-positive HNCs fra HPV-negative HNCs ble funnet å være svært oppregulert i
K14E6E7
mus uavhengig av
fancD2
genet status , noe som indikerer at de kan være nyttige for å bestemme HPV-status av HNCs som oppstår i FA pasienter. Til slutt, vi observert at mangel på uttrykk for pocket proteiner, pRb, p107, og P130, som er etablert mål for E7, kan rekapitulere E7 induksjon av DNA-skade svar i hode og nakke epitel. Vår nåværende studien støtter hypotesen om at E7 induserer HNC ved å fremme DNA skade gjennom inaktivering av lomme proteiner. Disse dataene kan forklare hvorfor mangel i FA veien øker mottakelighet for E7-drevet kreft.
Materialer og metoder
Mus
K14E6
transgen
mus product: [27]
og K14E7
gene mus [28] på FVB genetisk bakgrunn, ble krysset til
fancD2
knockout (
FancD2
– /-
) mus [29], på 129S4 genetisk bakgrunn, for å generere F
1 mus,
K14E6 /FancD2
+/-
og
K14E7 /FancD2
+/- plakater (FVB /129S4 blandet bakgrunn). Alle eksperimentelle mus (
NTG /FancD2
+ /+
,
NTG /FancD2
– /-,
K14E6 /FancD2
+ /+
,
K14E6 /FancD2
– /-
,
K14E6E7 /FancD2
+ /+
, og
K14E6E7 /FancD2
– /-
mus) var menn som genereres av intercrossing F
1 mus.
K14Cre /Rb
f /f
,
Rb f
/f /
p130
– /-
, og
K14Cre /Rb
f /f /p130
– /-
ble generert på samme
FVB /129 /C57
blandet genetisk bakgrunn som tidligere beskrevet [30].
Rb f
/f /
p107
– /- Hotell og
K14CreER /Rb
f /f /p107
– /-
ble generert på samme
CD1 /129 /C57
blandet genetisk bakgrunn som beskrevet tidligere [30]. Alle mus ble genotypet ved hjelp av PCR. Mus ble injisert intraperitonealt med 0,3 ml bromdeoksyuridin (BrdUrd; 12,5 mg /ml) 1 time før eutanasi for å måle graden av DNA-syntese. Tunger og spiserør ble innhøstet og behandlet som tidligere beskrevet [23]. Mus ble plassert i Foreningen for vurdering av Laboratory Animal Care-godkjent McArdle Laboratory Animal Care Unit. Alle prosedyrer ble utført i henhold til våre dyr protokoll godkjent av University of Wisconsin Institutional Animal Care og bruk komité.
4-nitrokinolin-1-oksid (4NQO) indusert hode og hals kreftstudie og histologisk analyse
behandling og retningslinjer for histologisk analyse av svulster ble tidligere beskrevet [26]. I korte trekk ble mus behandlet med 4-nitrokinolin-1-oksyd (4NQO; 10 ug /ml) i drikkevannet i 8 uker og deretter holdt ved behandling i ytterligere 16 uker. På slutten punkt eller når mus ble døende, de ble avlivet, utilslørt svulster i tungen og spiserøret ble scoret, og vev ble samlet inn for histopatologiske analyser.
immunfluorescens
immunfluorescens ble utført som beskrevet tidligere [31]. Antistoffer som brukes inkluderte anti-p16 (01:50 i 5% fettfri melk /5% hesteserum, M156, Santa Cruz Biotech.), Anti-Mcm7 (1: 200 i 5% hesteserum, Neomarkers), anti-cytokeratin 14 konjugert til FITC (CK14, 1: 100 i 5% hesteserum; CBL 197F, Millipore), anti-bromdeoksyuridin (BrdUrd; 01:50 i 5% hesteserum; Calbiochem), og anti-γ-H2AX (1: 100 i fem % hesteserum, Millipore)
Kvantifisering av BrdUrd positive kjerner og γ-H2AX foci positive celler
minst tre mus i hver genotype,
NTG /FancD2
+ /+
,
NTG /FancD2
– /-
,
K14E6 /FancD2
+ /+
,
K14E6 /FancD2
– /-
,
K14E6E7 /FancD2
+ /+
, og
K14E6E7 /FancD2
– /-
mus, ble valgt og ~ 8 til 10 frames (400x) av celler i suprabasal (cytokeratin 14 negative) og basal (cytokeratin 14 positive) lag av tunge og spiserøret epitel ble kvantifisert for hver mus.
Statistisk analyse
ensidig Barnard eksakte test ble anvendt for å bestemme betydningen av forskjeller i åpen tumortilfeller mellom hver gruppe av mus. Tosidig Wilcoxon Rank Sum test ble anvendt for å bestemme betydningen av forskjeller i graden av åpenlys lesjon i dyre- tungen og spiserøret. For å bestemme betydning for BrdUrd positive kjerner og γ-H2AX atom foci positive celler mellom hver gruppe mus ble en tosidig Wilcoxon rank sum test brukt.
Resultater
Forstyrrelse av FA pathway signifikant øker forekomsten av HPV-onkogen forbundet svulster i E6 /E7 bi-transgene mus, men ikke i E6 transgene mus
for å ta rollen som E6 og mangel på FA sti i hode og nakke carcinogenesen , HPV16 E6 transgen (
K14E6
) og HPV16 E7 transgen (
K14E7
) mus ble krysset til
fancD2
-null mus til å generere fire forskjellige genotyper;
K14E6 Twitter /
FancD2
+ /+
,
K14E6 Twitter /
FancD2
– /-
,
K14E6E7 Twitter /
FancD2
+ /+
, og
K14E6E7 Twitter /
FancD2
– /-
mus. Mus ble behandlet med 4NQO, et vannoppløselig kjemisk karsinogen som virker som en ko-karsinogen indusere HNCs i vårt HPV16 transgene mus [23], i 8 uker og deretter holdt i ytterligere 16 uker. Ved 24 ukers endepunkt, ble tunger og spiserør høstet, scoret for åpen svulster, og vev ble fikset, parafin-embedded, seksjonert og utsatt for histopatologiske analyser for å vurdere den verste fasen av neoplastisk sykdom.
På
fancD2
-tilstrekkelig bakgrunn, bare to av 26
K14E6 /fancD2
+ /+
mus (8%) utviklet utilslørt hode og nakke svulster, som ikke var signifikant forskjellig fra det som ble observert i ikke-transgen (NTG) mus (tabell 1). Dette er i tråd med vår tidligere studie [25]. På
fancD2
-deficient bakgrunn, to av 22
K14E6 /FancD2
– /-
mus (9%) utviklet utilslørt tumorer (tabell 1) , som ikke var signifikant forskjellig fra det som ble observert på
fancD2
-tilstrekkelig bakgrunn (
K14E6 /FancD2
+ /+
vs.
K14E6 /FancD2
– /-
,
P
= 0,52). Dermed
fancD2
mangel ikke føre til økt mottakelighet for E6 transgene mus til hode og nakke svulster.
Genotype
Gruppe størrelse, n
Animal vev med overt svulst, n (%)
Tongue Esophagus
Tongue
Esophagus
*
NTG/FancD2
+
/
+
240 (0) 0 (0) 0 (0)
*
NTG /FancD2
– /-
260 (0) 0 (0) 0 (0)
*
K14E7 /FancD2
+
/
+
204 (20) 2 (10) tre (15)
*
K14E7 /FancD2
– /-
2111 (52) 5 (24) 6 (29)
K14E6 /FancD2
+
/
+
262 (8 ) 0 (0) 2 (8)
K14E6 /FancD2
– /-
222 (9) 0 (0) 2 (9)
K14E6E7 /FancD2
+
/
+
146 (43) 4
a (29) 4
a (29 )
K14E6E7 /FancD2
– /-
1411 (79) 9
b (64) 7
b (50) Tabell 1. Sammenligning av 4NQO indusert overt . tumor forekomsten hos mus tungen og spiserøret vev
MERK:
K14E6E7 /FancD2
+ /
+ mus viser en betydelig økning av tumortilfeller sammenligne med
K14E6 /FancD2
+ /
+ mus (
P
= 0,01). Forskjellen i tumor forekomst mellom
K14E6 /FancD2
+ /+ Kjøpe og
K14E6 /FancD2
– /-
grupper viser ingen statistisk signifikans (
P
= 0,52). Men forskjellen i kreft insidens mellom
K14E6E7 /FancD2
+ /+ Hotell og
K14E6E7 /FancD2
– /-
gruppene er statistisk signifikant (
P
= 0,03). Alle statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av en ensidig Barnard eksakte test.
a To av
K14E6E7 /FancD2
+ /+
mus hadde svulster i både tunge og spiserøret.
b Fem av
K14E6E7 /FancD2
– /-.
Mus hadde svulster i både tunge og spiserøret
* Åpenlys tumor forekomst av
NTG /FancD2
+
/
NTG /FancD2
– /-
K14E7 /FancD2
+ /+
og
K14E7 /FancD2
– /-
mus er fra vår tidligere studie [26] CSV Last ned CSV
neste sett på påvirkning av FA-mangel på hode og nakke tumorigenesis i mus som uttrykker både E6 og E7. På
fancD2
-tilstrekkelig bakgrunn,
K14E6E7 /FancD2
+ /+
mus utviklet et økt antall åpenlys hode og nakke svulster sammenlignet med
K14E7 /FancD2
+ /+
mus (tabell 1), i tråd med våre tidligere studier viser en evne til E6 for å øke effektiviteten i E7-drevet hode og nakke tumorigenesis [25]. På
fancD2
-deficient bakgrunn, observerte vi en betydelig økning i forekomsten av åpenlys svulster i
K14E6E7
mus, fra 43% til 79% (
K14E6E7 /FancD2
+ /+
vs.
K14E6E7 /FancD2
– /-
,
P
= 0,03 i tabell 1). Størrelsen på økningen i frekvensen av utilslørt svulster på
fancD2
-deficient bakgrunn sett med E6 /E7 bi-transgene mus var ikke større enn det som ble sett med E7 bare transgene mus (tabell 1). Disse data indikerer at FA pathway påvirker onkogene potensialet til E7 men ikke E6.
Mangel på FA vei førte til mer aggressiv neoplastiske HPV-assosiert sykdom
Vi utførte detaljert histopatologisk analyse av vev høstet fra disse musene for å vurdere graden av neoplastisk sykdom i disse årskull av mus. Vev med utilslørt svulster ble høstet, fast, parafin-embedded og deler utsatt for histopatologi. Spesielt ble hver tiende 5 um delen av tungen og spiserøret farget med hematoksylin og eosin (H E) og analysert for å bestemme den verste stadium av neoplastisk sykdom i hvert dyr (tabell 2). HPV16 onkogen-transgene mus utvikler en progressiv sykdom, som strekker seg fra normal epitel og godartet papilloma til invasiv kreft (dvs. karsinom) [24,26]. Basert på graden av differensiering (keratinization) innenfor karsinom, kreft var sub-klassifisert i gradene I, II og III. I tungen, vi bare observert fire godartede papillomer i
K14E6E7 Twitter /
FancD2
+ /+
mus, mens i
K14E6E7
/
FancD2
– /-
mus vi observerte tre godartede papillomer, fire verne karsinomer, og to klasse II karsinomer. Denne økningen i alvorlighetsgraden av sykdommen var statistisk signifikant (
P
= 0,02 i tabell 2). Mens FA-mangel også ført til økt alvorlighetsgrad av sykdom i spiserør av mus med svulster, var denne økningen ikke statistisk signifikant (
P
= 0,25 i tabell 2).
Tissue
Genotype product: # mus, n
Disease grad av overt lesjon, n (%)
Ingen sykdom
papilloma
grade av Carcinoma
jeg
II
III
Tongue
K14E6 /FancD2
+ /+
2626 (100) —-
K14E6 /FancD2
– /-
2222 (100) —-
K14E6E7 /FancD2
+ /+
1410 (71) 4 (29) —
K14E6E7 /FancD2
– /-
145 (36) tre (21) 4 (29) 2 (14) -Esophagus
K14E6 /FancD2
+ /+
2624 (92) 2 (8) —
K14E6 /FancD2
– /-
2220 (91) 2 (9) —
K14E6E7 /FancD2
+ /+
1410 (71) 3 (21) -1 (7) –
K14E6E7 /FancD2
– /-
147 (50) 5 (36) -2 (14) table 2. Histopatologisk analyse av . prøver med utilslørt lesjoner i dyre tungen og spiserøret vev
MERK: den samlede sykdom karakter i
K14E6E7 /FancD2
– /-
mus gruppene er statistisk mer alvorlig enn det i
K14E6E7 /FancD2
+ /+
mus grupper i dyre tungen vev (
P
= 0,02), men ikke i dyre spiserør vev (
P
= 0,25). Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av en tosidig Wilcoxon rank-sum-test. CSV Last ned CSV
To biomarkører, MCM7 og p16 er sterkt uttrykt i svulster i K14E6E7 mus uavhengig av fancD2 genet status
I den generelle befolkningen, HPV-positive HNCs er mer mottakelig for stråling terapi enn HPV -negative HNCs [32]. Men dette er standard vare behandling for pasienter med HNCs ikke aktuelt å FA pasienter på grunn av de alvorlige bivirkninger av denne behandlingen på disse pasientene [33]. Identifisere HPV-status på HNCs fra FA pasienter ville hjelpe klinikere søke tryggere og bedre løsninger til vaksinen av disse kreftformer. Flere tidligere studier har vist inkludert vår to molekylære biomarkører, MCM7 og p16, er anvendelige i å skille HPV-positive fra HPV-negative HNCs både hos mus [23,26] og i menneske [34,35]. Vi ønsket å overvåke om HPV16 E6 og E7 dobbel uttrykk på mangel FA sti bakgrunn øker også MCM7 og p16 protein nivåer i svulster fra
K14E6E7 Twitter /
FancD2
– /-
mus. Vevssnitt fra svulster som oppstår i
K14E6E7 Twitter /
FancD2
+ /+ Hotell og
K14E6E7 Twitter /
FancD2
– /-
mus ble utsatt for immunhistokjemi for anti-MCM7 og -p16 spesifikke antistoffer. Ingen neoplastiske lesjoner ble observert i
NTG /FancD2
+ /+ Kjøpe og
NTG /FancD2
– /-
mus . Som tidligere rapportert [23], E6 økte ikke uttrykket nivåer av disse markørene og
fancD2
-deficiency endret ikke dette funnet (figur 1). De to biomarkører ble sterkt uttrykt i kjernen av alle de godartede og ondartede svulster i
K14E6E7
mus uavhengig av
fancD2
uttrykk status (figur 1). I tillegg
fancD2
knockout ikke endre uttrykket mønster av disse biomarkører i normal epitel av tungen og spiserøret (data ikke vist). Disse funnene føre oss til å foreslå at disse to biomarkører vil være verdifull for diagnostisering av HPV-status på kreftformer fra FA pasienter.
Synlig er representative immunhistokjemi bilder fra seksjoner farget med anti-MCM7 (brune kjerner) og anti-p16 (brune kjerner) antistoffer og kontra med hematoksylin (blå kjerner). Scale bar, 50 mikrometer.
Celleproliferering indusert av HPV16 onkogener er økt på fancD2 mangelfull bakgrunn
Celleproliferering må være strengt regulert for å opprettholde vev homeostase, og dets deregulerings bidrar til neoplastiske sykdommer. I vår tidligere studie fant vi ut at HPV16 E7 og
fancD2
-deficiency additivt og uavhengig økt hyppighet av celler i basal epithelia av tungen og spiserøret under DNA-syntese [26]. En
in vitro
studien viste at FA mangel førte til hyperplasi i sammenheng med organotypic flåte kulturer av humane keratinocytter udødeliggjort av kombinasjonen av E6 og E7 onkogener [22]. For å vurdere om
in vivo
FA mangel hatt noen innflytelse på celleproliferasjon i nærvær av E6 alene eller E6 og E7 sammen, musene fra over hodet og nakke kreft studien ble injisert intraperitonealt med BrdUrd (12,5 mg /ml), en syntetisk analog tymidin, en time før avlivning og BrdUrd-spesifikk immunfluorescens ble utført for å identifisere celler som støtter DNA-syntese i epitel foring tunge og spiserøret av musene (figur 2A). Hyppigheten av BrdUrd-positive celler ble kvantifisert for å tilveiebringe en proliferativ indeks for hvert vev (figur 2B).
A, for å score den nylig syntetiserte DNA ved epithelial lag av tunge og esophagus vev, mus ble intraperitonealt injisert med BrdUrd før offer og sine vev ble farget for anti-BrdUrd (rød) og anti-cytokeratin 14 (CK14) protein (grønn) antistoffer. DAPI (blå) brukes for en kjernefysisk kontra. Scale bar, 20 pm. B, minst tre mus i hver genotype,
NTG /FancD2
+ /+
,
NTG /FancD2
– /-
,
K14E6 /FancD2
+ /+
,
K14E6 /FancD2
– /-
,
K14E6E7 /FancD2
+ /+
, og
K14E6E7 /FancD2
– /-
mus, ble valgt ut og ~ 8 til 10 rammer av celler ved epithelial lag av tunge og spiserøret epitel ble kvantifisert for hver mus. Mengden av BrdUrd-positive kjerner i løpet av det totale antallet celler ble avsatt i hvert tilfelle (kolonner); barer, SD. Stjerne (*) betyr at mangel på
fancD2
gen forårsaket en signifikant økning i DNA-syntese mellom genotypene (
P
0,05). Alle statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av en tosidig Wilcoxon rank sum test.
På
fancD2
-tilstrekkelig bakgrunn, E6 alene eller sammen med E7 betydelig økt antall BrdUrd -positive celler i epitelet av tungen eller spiserør (
NTG /FancD2
+ /+
vs.
K14E6 /FancD2
+ /+
eller
K14E6E7 /FancD2
+ /+
,
P
0,05 i figur 2B). Kombinasjonen av E6 og E7 ført til en betydelig økt antall BrdUrd-positive epitelceller på
fancD2
-tilstrekkelig bakgrunn enn gjorde E6 alene (
P
0,05 i figur 2B). Viktigere, hyppigheten av celler som støtter DNA-syntese ble en signifikant økning i epitelceller tunge eller spiserør for alle mus som var mangelfull for
fancD2
, uavhengig av HPV16 onkogenet status (
NTG /FancD2
+ /+
vs.
NTG /FancD2
– /-
,
K14E6 Twitter /
FancD2
+ /+
vs.
K14E6 Twitter /
FancD2
– /-
, og
K14E6E7
/
FancD2
+ /+
vs.
K14E6E7 Twitter /
FancD2
– /-
; alle
P
0,05 i figur 2B). Vi har videre raffinert vår analyse av påvirkning av HPV16 onkogener og FA mangel på induksjon av DNA-syntesen til to forskjellige under kamrene i epitelet: basal kupé, som er cytokeratin 14 (CK14) positiv, og den suprabasal kupé, som er CK14 negative (Figur 2A). Den ovenfor angitte påvirkning av begge faktorer (HPV16 onkogener og FA-status) ble mer jevnt observert i basal rommet både tungen og spiserøret (figur S1). I sammendraget, mangel på
fancD2
førte til induksjon av cellulær DNA-syntese i tungen og spiserøret epithelia uavhengig av HPV16 onkogen status. Disse resultatene støtter hypotesen om at FancD2 spiller en rolle for å regulere S-fase cellesyklus [6,36,37]. Men det faktum at FA-mangel ikke føre til økt mottakelighet for hode og nakke tumorigenesis i E6 gene mus men føre til en økning i cellevekst i disse samme mus tyder på at induksjon av epitelial hyperplasi forklarer ikke hvordan FA mangel driver tumorigenesis .
The FA pathway spesielt undertrykke E7-drevet DNA-skader
Både HPV16 E6 og E7 onkogener har blitt hevdet å indusere DNA-skade basert på komet analyser utført på celler i vev kultur [38,39 ]. Gitt at FA reaksjonsveien er involvert i reparasjon av skadet DNA, vil det stå til grunn at nivået av DNA-skade forårsaket av E6 og E7 ville bli økt på en FA mangelfull bakgrunn. Tilstedeværelsen av DNA-skade i celler kan indirekte scoret ved å overvåke tilstedeværelsen av atom foci positivt for histone 2AX fosforylert på serin-139 (γ-H2AX) [40,41]. Vi har tidligere vist at i
K14E7
mus, E7 førte til en sterk økning i hyppigheten av γ-H2AX foci-positive celler i epitel av tungen og spiserøret, og frekvensen ble ytterligere øket i
fancD2
-deficient bakgrunn [26]. I denne studien ønsket vi å finne ut hvilken rolle HPV16 E6 på DNA skade respons på
fancD2
-tilstrekkelig og -deficient bakgrunn. For å oppnå dette, ble immunfluorescens farging spesifikk for γ-H2AX utført på deler av tungen og spiserøret fra
NTG
,
K14E6
, og
K14E6E7
mus på
fancD2-
tilstrekkelig eller
fancD2
-deficient bakgrunn (figur 3A).
A. For å vurdere DNA-skade indusert respons av HPV16 E6 og E7 i mangel av
fancD2
genet, vev fra hver gruppe ble farget for anti-γ-H2AX (rød) og anti-cytokeratin 14 (CK14) protein (grønn ) antistoffer. DAPI brukes for en kjernefysisk kontra. Scale bar, 20 pm. γ-H2AX foci positive celler er markert med grønne piler i bildene. B. Minst tre mus i hver genotype,
NTG /FancD2
+ /+
, NTG /FancD2
– /-
,
K14E6 /FancD2
+ /+
,
K14E6 /FancD2
– /-
,
K14E6E7 /FancD2
+ /+
, og
K14E6E7 /FancD2
– /-
mus, ble valgt ut og ~ 8 til 10 rammer av celler ved epithelial lag av tungen og spiserøret ble kvantifisert for hver mus. Mengden av celler med γ-H2AX positive foci-celler enn det totale antallet celler ble avsatt i hvert tilfelle (kolonner); barer, SD. Stjerne (*) betyr at forskjellene i antallet celler med γ-H2AX brennpunktene mellom de to gruppene ble sammenlignet statistisk (
P
0,05). Alle statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av en tosidig Wilcoxon rank sum test. Merk: Eksponeringstiden som ble benyttet var den samme for alle prøver analysert. Noen celler i vev av
K14E6E7 /FancD2
+ /+ Hotell og
K14E6E7 /FancD2
– /-
mus hadde svært lyse γ-H2AX spesifikke nukleær farging ved eksponering brukes. Kortere eksponering bekreftet at disse cellene beholdt Punktum nukleær farging reflekterende av DNA skade respons foci.
I epitel tungen og spiserøret vev, E6 transgene mus viste svært få γ-H2AX foci positive celler, lik det man ser i
NTG
mus.
