Abstract
Merkel celle polyomavirus (MCV) forårsaker de fleste av menneskelige Merkel cellekreft (MCC) og koder for et lite T (ST) antigen som forvandler udødeliggjort gnager fibroblaster
in vitro
. Å utvikle en musemodell for MCV St-indusert kreftutvikling, genererte vi transgene mus med FLOX-stop-FLOX MCV sT sekvens homologously saman på
ROSA
locus (
ROSA
sT
), slik at Cre-mediert, betinget MCV sT uttrykk. Standard tamoxifen (TMX) administrasjon til voksne
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
mus, der
Cre
er allestedsnærværende uttrykt, resulterte i MCV sT uttrykk i flere organer som var jevnt dødelig innen 5 dager. Motsatt, de fleste voksne
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
mus overlevde lavdose tamoxifen administrasjonen, men utviklet øreflippen dermal hyperkeratose og hypergranulosis. Samtidig MCV sT uttrykk og betinget homozygot p53 sletting generert multifokale, dårlig differensierte, svært anaplastiske svulster i milt og lever av mus etter 60 dager TMX behandling. Muse embryonale fibroblaster fra disse mus indusert til å uttrykke MCV sT utstilt forankringsuavhengig cellevekst. For å undersøke Merkel celle patologi, ble MCV sT uttrykk også indusert under mid-embryogenese i Merkel celler av
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
mus, noe som fører til betydelig økt Merkel celle tall i kontakt kupler på slutten embryonale aldre normalisert etter fødselen. Tamoxifen administrasjon til voksne
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST Hotell og
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
;
p53f
Lox /FLOX
mus hadde ingen effekt på Merkel celle tall og induserte ikke svulst formasjonen. Samlet utgjør disse resultatene viser at MCV sT stimulerer stamfar Merkel celleproliferasjon i embryonale mus og er et bona fide viral oncoprotein som induserer fullt kreftcelle transformasjon i
p53
-null setting.
Citation : Shuda M, Guastafierro A, Geng X, Shuda Y, Ostrowski SM, Lukianov S, et al. (2015) Merkel Cell polyomavirus Liten T antigen induserer kreft og Embryonic Merkel Cell Proliferation i en transgen mus modell. PLoS ONE 10 (11): e0142329. doi: 10,1371 /journal.pone.0142329
Redaktør: Suzie Chen, Rutgers University, USA
mottatt: 24 juni 2015; Godkjent: 19 oktober 2015; Publisert: 06.11.2015
Copyright: © 2015 Shuda et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH NCI R01CA136806, CA136363, CA170354 og American Cancer Society professorater til PSM og YC. MS ble støttet delvis av University of Pittsburgh Skin Cancer SPORE CA12197305. SMM ble støttet av NIH NIAMS R01AR05114, Richard kong Mellon Institute for Pediatric Research. SMO ble støttet av Dermatology Foundation og NIH NIAMS T32-AR007569. Dette prosjektet brukte University of Pittsburgh Cancer Institute kjernefasiliteter som støttes delvis av prisen P30CA047904
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Merkel celle polyomavirus (MCV) er clonally integrert i ~ 80% av Merkel celle karsinom (MCC), og er i dag den eneste menneskelige polyomavirus kjent for å være onkogene [1, 2]. Dette viruset var det første mennesket patogen oppdaget av en-rettet RNAseq metode som kalles digital transkriptomet subtraksjon [3], en tilnærming som nå vanligvis brukes til å oppdage og karakterisere menneskevirus [4]. Den MCV T-antigen-locus koder for to store overlappende transkripter for stort T (LT) og lite T (ST) antigen oncoproteiner [5, 6]. Alle MCV-MCC tumorer undersøkt til dags dato ikke bare bære klonalt integrerte virus, men også ha klonale tumorspesifikke mutasjoner LT at avkorte den C-terminale enden og forstyrre de helicase funksjonene til LT-proteinet [5, 7, 8]. p53 målretting via en bi-partite interaksjon domene av LT-antigenet av det nært beslektede Simian vacuolating 40 (SV40) viruset er avgjørende for SV40 LT transformasjon aktivitet. Imidlertid har ingen analog p53 målretting domene blitt identifisert for enten MCV LT eller ST teinene [9-11].
MCV ST er et promiskuøse E3 ligase hemmer [12, 13] og alene er tilstrekkelig til å forvandle gnager fibroblast cellelinjer [14]. MCV sT gnagercelletransformasjon krever ikke aktiv proteinfosfatase 2A (PP2A) -binding aktivitet [14]. I stedet, en region kalt den store T stabilisering domene (LSD) binder og hemmer ulike E3 ligase anerkjennelse proteiner inkludert Fbw7, cdc20 og cdh1 [12, 13]. De to sistnevnte proteiner er gjenkjennelses subenheter for anaphase fremme komplekse /cyclosome (APC /C) og St uttrykk fremmer mitotisk prometafase arrest [13]. Dette i sin tur øker CDK1 styrt fosforylering av 4E-BP1 og aktivering av mitose-assosiert cap-avhengige translation (MACT) [14]. Mutasjoner til MCV sT LSD eliminere MCV St-indusert transformasjon, og knockdown av enten LT eller St initierer celledød eller cellesyklus arrest av MCV-positive MCC celler [15, 16].
Nylig Spurgeon m.fl. vist at transgene, keratin 14 promoter-drevet MCC-avledet genomisk T antigen uttrykk i mus huden induserer papillomatosis [17]. Tilsvarende Verhaegen et al viste at transgene MCV sT uttrykk i mus bruker en keratin 5 (K5) promoter induserer hyperproliferative lesjoner som etterligner menneskelig plateepitelkarsinom
in situ product: [18]. Dette hyperplasi er avhengig av en intakt MCV sT LSD region. Hittil har imidlertid ingen musemodeller viser at transgene MCV T antigen uttrykk induserer fullt neoplasi.
Vi ga transgene mus som betinget uttrykke MCV m fra
ROSA26
locus å måle onkogene potensial av denne viralt protein. Vi bekrefter at MCV sT uttrykk induserer en hyperplastiske responsen i hudvev som tidligere beskrevet. Vi viser videre at bare langvarig MCV sT uttrykk i en p53-null sammenheng produserer svært anaplastiske, dårlig differensierte malignitet i indre organer. Dette kravet for flere oncogene bidrag til fullstendig transformasjon er lik den som ses for c-Myc, Wnt-1 og SV40 LT [19-21]. Vi fant også at MCV sT induksjon i Merkel celler av embryonale mus førte til forbigående økning i Merkel celle tall, men var ikke nok til å forårsake spredning eller tumorigenesis hos voksne Merkel celle populasjoner uavhengig av p53 status.
Resultater
Generering av MCV sT transgen mus
En transgen musemodell med induserbar MCV sT uttrykk,
ROSA
sT
ble generert i C57BL /6 genetisk bakgrunn. For å uttrykke betinget MCV sT protein, kodonoptimalisert MCV sT (sTco) cDNA ble klonet vektor nedstrøms for en
loxP-
flankert neomycinfosfotransferase cDNA-sekvens med en 5 «sekvens som er homolog til muse
ROSA26
locus å generere
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco plakater (figur 1A).
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
ble levert ved homolog rekombinasjon inn i ROSA26 locus av mus embryonale stamceller (ES) celler (se detaljer i materialer og metoder).
(A) Design av
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
, en ROSA26 knock-in konstruere koding kodonoptimalisert MCV sT med flankerer loxP-STOP-Neo-loxP (LNL) sekvens, saman med ROSA26 genomisk locus.
ROSA26-CAG-LNL-MCVsTco
krysset med
Ubc
CreERT2
eller
Atoh1
CreERT2
mus tillater TMX-indusert Cre rekombinase excision av loxP-STOP-Neo-loxP sekvens som resulterer i MCV sT uttrykk under CAG promoter. (B) MCV sT uttrykk er dødelig i
Ubc
CreERT2
; ROSA
St
transgene mus. Kaplan-Meier-kurve av høy dose (0,2 mg /g) og lav dose (0,02 mg /g) TMX injiserte mus. Høy dose TMX injeksjon forårsaket raske vekttap og mus nådd dødshjelp kriteriet (20% tap av kroppsvekt) innen 5 dager etter injeksjon (n = 4, solid oransje). Survival of the kontroll
Ubc
CreERT2
mus (n = 7, stiplet oransje) ble ikke påvirket av TMX injeksjon.
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
mus injisert med lavere dose TMX viste signifikant forlenget overlevelse sammenlignet med høydose TMX (n = 18, solid rød) og kontrollmusene var upåvirket (n = 10, stiplet rød) (C) Multi-vev MCV sT protein uttrykk i
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
mus som døde rett etter høy dose TMX injeksjon ( 5 dager). Lavere dose TMX injeksjon induserer mindre MCV sT protein uttrykk i en mus som døde på dag 7 etter injeksjonen som oppdages ved immunoblotting hjelp av et antistoff reist mot MCV St, CM8E6 [22]. MCV sT vektor eller tom vektor transfektert HEK293-celler ble anvendt som en positiv og en negativ kontroll, respektivt. Like mengder ST-transfekterte HEK293 cellelysater ble lastet for å normalisere på tvers av ulike blotter. Hsp70 /Hsc70 ble oppdaget som et protein kvalitetskontroll. (D) MCV sT protein uttrykk ble opprettholdt i vev av
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
mus som overlevde over 70 dager etter lavdose TMX injeksjon. Immunoblot ble utført som i (C). Tissue lysatene fra
ROSA
ST
ble brukt som en negativ kontroll.
High Level Uttrykk av MCV sT i vev er dødelig for mus
å betinget indusere CRE-loxP rekombinasjon og st uttrykk i flere organer,
ROSA
sT
mus ble parret med
Ubc
CreERT2
mus koder menneskelige ubiquitin C promoter-drevet Cre rekombinase smeltet til en trippel mutant form av det menneskelige østrogen reseptor kan aktiveres av tamoksifen (TMX). Vi undersøkte sT uttrykk på to forskjellige TMX doseringsnivåer: høydose TMX aktivisering for å fremme utbredt sT uttrykk, og lavdose TMX aktivering som en stokastisk brøkdel av celler i de fleste vev ville gjennomgå rekombinasjon og St uttrykk
.
Høy dose CreERT2 aktivering av en enkelt intraperitoneal (ip) TMX injeksjon (0,2 mg per gram musekroppsvekt) til voksen
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
mus indusert hurtig vekttap i alle mus som ble testet (n = 4). Disse musene ble dehydrert, mindre aktiv på dag 3 etter injeksjonen og nådde 20% vekttap eutanasi endepunktet i løpet av 5 dager. Ingen av kontroll mus negativ for
Ubc
CreERT2
transgen viste merkbar vekttap etter TMX injeksjon (figur 1B).
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
mus viste ikke vekttap i fravær av TMX injeksjon, og deres overlevelse var sammenlignbar med
Ubc
CreERT2
og
ROSA
St
kontrollmusene.
Low-dose TMX, på 10% av den høye dosen (0,02 mg /g), kraftig redusert dødelighet, med 72% (13/18) av musene overlevde 10 eller flere dager (n = 18) (figurene 1B og 2B) til tross for et jevnt vekttap i løpet av eksperimentet. En slik mus overlevde 144 dager etter TMX injeksjon før de når 20% vekttap dødshjelp kriterium, og dette var da regnet endepunktet for studieperioden.
(A) Hyperplastisk fenotype i øret huden fra
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
mus. Ear hudvev fra
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
mus ble utsatt for H E farging. (B) hyperproliferative fenotype i øret huden av
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
mus. H E farget øre hud seksjoner fra lavdose TMX injisert
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST Hotell og
ROSA
ST
mus ble randomisert og evaluert i en blindet måte av to patologer for hyperkeratose /hypergranulosis i epidermis og økte cellularity /vedheng abnormiteter. N /A: ikke tilgjengelig siden øret vev var normalt og ikke høstet. . NT: ikke testet
Uavhengig av TMX dose, vev immunoblotting av
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
mus viste utbredt MCV sT uttrykk i muskel, milt, lunger, lever, nyre, tarm, hjerte og hjerne vev av mus som døde innen 10 dager etter TMX injeksjon mens lav dose TMX indusert m mindre protein vev uttrykk (fig 1C og S1A fig). Ingen sT uttrykk ble oppdaget i
ROSA
ST
littermate kontroll mus. For mus injisert med lavdose TMX og overlevende 10 dager, men MCV sT protein uttrykk i ulike vev ble redusert i forhold til de overlevende 10 dager, med sT protein oppdaget bare i øret, hud, muskler og hjerne vev ved immunoblotting (fig 1D). MCV sT uttrykk var ikke påviselig unntatt i muskelen for
Ubc
CreERT2
;
ROSA
St
musene avlivet på dag 144 etter lavdose TMX injeksjon. ble påvist økt antall tunel positive epitelceller i tarmen fra
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
mus som fikk flere med høy dose TMX (en gang om dagen i 3 dager), sammenlignet med
ROSA
ST
kontroll mus (S1 Fig). Andre organer, inkludert milt, lunger og nyrer viste lignende resultater (data ikke vist).
Lav Dose MCV sT Expression Induserer Hud og epidermal Hyperplasi i Ear Vev
Av
Ubc
CreERT2
;
ROSA
St
mus som overlevde over 42 dager etter TMX injeksjon (n = 12), viste brutto ekstern undersøkelse slående bilateral og diffus fortykkelse av ytterøret. MCV sT protein ble oppdaget av immunblotting av øret vev i 77,8% av mus (7/9, tre øre vev ble ikke høstet), og St induksjon var assosiert med hyper av dermis og epidermis ved mikroskopi i 61,1% (11/18) av
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
mus (Fig 2A). MCV ST protein ekspresjonsnivåer ble imidlertid ikke forbundet med denne fenotype. To mus overlever i over 117 dager (9F og 9M) viste en hyperplastisk øre fenotype tross manglende påvisbar sT protein uttrykk i ørene. Verken
ROSA
ST
eller
Ubc
CreERT2
kontroll mus viste dette øret fenotype. Hematoxylin eosin (H E) farging av fortykket øret vev viste epitel hyperkeratose (90,9%, 10/11) og hypergranulosis (81,8%, 9/11) (fig 2). Annet enn brutto og mikroskopiske øre unormalt, vi har oppdaget noe annet hyperproliferative lesjon i denne gruppen av ST-uttrykker mus.
MCV sT Expression Induserer Økt spredning i Muse embryonale Fibroblaster
For å undersøke dermal fibroblastisk spredning og for å avgjøre om MCV sT påvirker celleproliferasjon i denne musemodell, isolert vi mus embryonale fibroblaster (MEFs) fra
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST Hotell og
ROSA
ST
embryoer.
In vitro
behandling med 500 nM 4-hydroxy tamoxifen (4-OHTMX) indusert MCV sT uttrykk i
Ubc
CreERT2
;
ROSA
St
MEFs (n = 8 embryo), men ikke
ROSA
ST
MEFs (n = 2 embryoer) (fig 3A). Noen MEFs viste utett MCV sT uttrykk selv i fravær av 4-OHTMX behandling (fig S2A). c-myc ekspresjonen, som har vist seg å være stabilisert ved MCV sT [12], ble også økt med MCV sT ekspresjon (Fig 3 og S2B Fig). Wst-en celleproliferasjonsanalyse viste at akselererende vekst skjedde i
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
men ikke
ROSA
ST
MEFs (fig 3 og S2B figur).
(A) Induksjon av MCV sT i flere mus embryonale fibroblast (MEF) celler fra kull av 4-OHTMX. MEFs hentet fra
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST Hotell og
ROSA
St
embryoer ble dyrket i nærvær eller fravær av 500 nM 4-OHTMX i 7 dager. MCV St og c-myc protein uttrykk ble oppdaget av immunblot. Hsp /Hsc70 protein uttrykk ble oppdaget som en lasting kontroll. (B) sT MCV ekspresjon akselererer celleproliferasjon i MEF-celler. Spredning av MEF celler behandlet med eller uten 4-OHTMX ble evaluert av Wst1 analyser.
MCV sT Expression i p53 Null Mus Produserer Anaplastisk, dårlig differensiert neoplasi uttrykke Blandede Lineage Markører i milt og lever
for å omgå dødelighet produsert av MCV sT uttrykk som gjenspeiles av høye tunel indekser i vev og rask død fra vekttap på eksperimentelle mus, vi krysset
Ubc
CreERT2
;
ROSA
St
mus med
p53
FLOX /FLOX
mus til å generere
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
FLOX /FLOX
mus. I disse musene, TMX administrasjon samtidig indusert MCV sT uttrykk og
p53
genet sletting. Ikke desto mindre, når den er høy dose (0,2 mg /g) TMX ble levert ip, ble MCV sT ekspresjon detektert i flere vev og alle mus som døde i løpet av 5 dager (n = 9), noe som tyder på at
p53
sletting ikke redde dødelighet forårsaket av høye nivåer av sT uttrykk (S3A fig). Som med p53 villtype mus, kortsiktige overlevelsesprosenten for
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
FLOX /FLOX
mus var større for lav dose sammenlignet med høydose TMX behandlet mus (S3A Fig) og 42,3% (11/26) mus døde innen 10 dager med lav dose TMX injeksjon. Utbredt MCV sT protein uttrykk ble også påvist i flere vev fra disse musene som døde innen 10 dager lavdose TMX injeksjon (S3b fig).
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
FLOX /FLOX
mus også utstilt hyperkeratose /hypergranulosis øret huden fenotype sett i p53 villtype, ST-uttrykker mus (S4 fig).
Omtrent 19% av
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
FLOX /FLOX
mus (5/26) overlevde 60 dager eller mer etter lavdose TMX behandling (figur 4A). Fire av disse fem (80%) musene utviklet svulster høyverdig i indre organer synlige ved obduksjon; tre mus hadde svulster i både milten og leveren, og en hadde påvisbare grovt tumorknuter i milten alene (figur 4B). Ved lysmikroskopi, svulstcellene hadde svært pleomorphic kjerner som varierte dramatisk i størrelse og form med flere nucleoli og hyperchromatism. Mitoser var mange og cellene hadde utydelige cytoplasmatiske grenser. En immunoblotting undersøkelse av vev (fig 4C og S5 Fig) viste at sT ble sterkt uttrykt i disse svulstene mens sT uttrykk var ikke vanligvis påvises i milten og lever fra langlivede
Ubc
CreERT2
;
ROSA
St
mus eller svulst-negative
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
FLOX /FLOX
mus (fig 1D og S5 fig). sT protein ekspresjon i milt-tumorer ble observert hos 75% (3/4) av tumorbærende mus (S5 Fig). sT ekspresjon ble også påvist ved immunblotting av en representativ lever nodul tatt fra en berørt mus (p53.7F, figur 4C). For noen av disse musene (2/5), ble MCV sT også uttrykt i nyre vev og histopatologiske undersøkelsen viste merket proliferative endringer i rørformede epithelia alt fra
in situ
lesjoner til fullt maligne lesjoner med invasjon gjennom basalmembraner. Til tross mikroskopiske bevis for nedsatt neoplasi, diskrete nyre svulster var ikke detekterbare ved grov undersøkelse ved obduksjon. Immunhistokjemi viste sterk ekspresjon av MCV sT lokaliser til de ondartede lesjoner fra leveren og milten, og i hyperproliferative og maligne epiteliale lesjoner i nyre (figur 4D). Resultatene ble gjengitt på 1/2 TMX (0,01 mg /g) injeksjon lav dose. Mus overlevelse var ikke-reversibelt relatert til TMX dosering på 0,01, 0,02 og 0,2 mg /g (S3 Fig). 87,5% (7/8) av
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
; p53
FLOX /FLOX
mus som overlevde over 60 dager med 0,01 mg /g TMX også utviklet høy klasse svulster i milt og /eller lever vev (data ikke vist). Vi observerte ikke tumorigenesis av p53-genet sletting alene
Ubc
CreERT2
; p53
FLOX /FLOX
mus på opptil 140 dager etter 0,02 mg /g TMX behandling (figur 4A). Mens bakterie linje sletting av p53 i denne musemodellen fremmer tumordannelse så tidlig som 50 dager, har det vist seg at postnatal p53-genet delesjon fører til en svulst forekomst av bare 3% og med 600 dager etter Cre rekombinase transduksjon, noe som indikerer at tidspunktet for p53 tap er en kritisk determinant for svulst forekomst [23, 24].
(A) p53 ablasjon ikke redde mus fra MCV ST-indusert dødelighet. Kaplan-Meier kurve for lav dose (0,02 mg /g) TMX injisert
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
; p53
FLOX /FLOX
mus (Solid blå linje, n = 26) og
Ubc
CreERT2
; p53
FLOX /FLOX
mus (stiplet blå linje, n = 10). Rosa linjene indikerer overlevelsen av
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
(heltrukket linje) Hotell og
Ubc
CreERT2 plakater (stiplet linje) mus med villtype p53 som vist i figur 1B for sammenligning med p53 knockout bakgrunns (blå linje). (B) MCV sT uttrykk produserer svulster
in vivo
i
p53
null setting. 80% (4/5) av musene som overlevde mer enn 60 dager etter injeksjon TMX utvikle grovt synlig tumor i milten og leveren. Representative milt og lever vev med tumornoduler fra p53.7F vises med tilsvarende normale vev fra en C57BL /6 kontroll mus. (C) Immunoblotting av MCV sT protein uttrykk i lever og milt vev fra mus p53.7F) med makroskopiske tumorer. Milt, muskler og øre vev konsekvent hevdet sT uttrykk over 60 dager etter TMX injeksjon. sT uttrykk var påvises i leveren vev ved immunoblotting bare fra leveren med synlige knuter (mus p53.7F). MCV sT protein ble påvist ved anvendelse av CM8E6 antistoff, og Hsp /Hsc70 ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting. (D) Den øverste panelet viser anaplastisk neoplasi i milten og leveren. En rekke proliferative endringer ble observert i nyrene, hvor distale rørformede epithelia rammes hardest, men glomeruli (svart pilspiss), proksimale tubulære epitel (*), og interstitiell vev er relativt forskånet for proliferative endringer. Den midterste panelet viser et representativt immunhistokjemisk farging av sT protein uttrykk i leveren tumor, milt svulst og nyre vev fra
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
; p53
FLOX /FLOX
mus. Vevsprøver ble immunostained med MCV sT (CM5E1) antistoff. (E) Den øverste panelet viser en ST-indusert levertumor med immunoreaktivitets til a-glatt muskel aktin (ASMA) og bunnpanelet viser K14 positivitet i spredte kreftceller.
For å bestemme histogenesis av sT indusert neoplasi, svulster fra
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
FLOX /FLOX
mus ble immunostained med markører for ulike linjene: CD45 (pan-lymfocytter), CD68 (makrofag), α-glatt muskel aktin (ASMA-glatt muskulatur ), cytokeratin 14 (epitel), cytokeratin 8 (epitel), neural adhesjonsmolekyl (NCAM). Tumorceller var jevnt ASMA positive. Spredte tumorceller viste positivitet til CK14 og NCAM (Fig 4E). Vi så ingen farging med andre markører inkludert CD68 og CD45 (S6 figur).
p53 ablasjon er nødvendig for full transformasjon av MEFs ved MCV sT
Gitt at MCV ST er et trans oncoprotein i p53-null mus, utførte vi transformasjon analyser ved hjelp av isolerte MEFs fra
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
,
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
FLOX /FLOX
,
Ubc
CreERT2
;
p53
FLOX /FLOX Hotell og
ROSA
ST
mus. Ved 4-OHTMX behandling, kloner av MEFs isolert fra to uavhengige
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
;
p53
FLOX /FLOX
mus dannet kolonier 4 uker etter enkelt celle seeding i myk agar kultur (figur 5A-5C). Verken MCV sT uttrykk alene (
Ubc
CreERT2
;
ROSA
ST
) eller p53 knockout alene (
UBC
CreERT2
;
p53
FLOX /FLOX
) induserte kolonidannelse (fig 6B). Disse resultatene er i overensstemmelse med våre
in vivo
tumorgenese resultater.
(A) sT MCV induserer bløt agar-kolonidannelse i fravær av p53 i MEF-celler. MEF celler isolert form
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
,
ROSA
ST
,
Ubc
CreERT2
; p53
FLOX /FLOX Hotell og to
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
; p53
FLOX /FLOX
embryoer fra kull ble behandlet med 500nM 4OHTMX over 7 dager, og cellene ble utsatt for myk agar-kolonidannelse analysen. Stjerne (*) indikerer statistisk signifikans
p. 0
05
. (B) soft agar kolonier indusert av p53 ablasjon. p53 ablasjon alene ikke førte til kolonidannelse. (C) Uttrykk for MCV sT i MEFs fra
Ubc
CreERT2
; ROSA
ST
; p53
FLOX /FLOX
.
Wholemount, K8-immunostained hud viser berørings kupler fra kontroll kull (A, C, F, H, K),
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST plakater (B, D, G, I) og
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
;
p53
FLOX /FLOX product: (L) mus som fikk TMX på P28 (A-D) eller E14.5 (F-I, K, L). Alder på vev innhøsting er vist for hvert par av paneler. (E, J, M) Grafer som viser Merkel celler per kontakt kuppel for medfølgende paneler. * P 0,05, *** p 0,001. Skala:. 10 nm
MCV sT Expression Øker Embryonic Merkel Cell Precursor spredning, men påvirker ikke Adult Merkel Cell Numbers eller Årsak tumorigenesis
MCC uttrykker fenotypiske markører som ligner mest på de som er uttrykt av normal, bosatt hud Merkel celler. For å undersøke effekten av sT i denne spesifikke celletype, målrettet vi sT til Merkel celler ved avl
ROSA
St
mus til
Atoh1
CreERT2 /+
mus [25]. Atoh1 er en atonal gruppe proneural grunnleggende helix-loop-helix transkripsjonsfaktor med anti-onkogen funksjon [26] som spiller en avgjørende rolle i Merkel celle utvikling [27].
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
St
mus og kontroll
ROSA
ST
kullsøsken ble gitt en enkelt dose av tamoxifen (0,25 mg /g ) via oral inntak ved postnatal dag 28 (P28) for å aktivere sT uttrykk spesielt i Merkel celler [28]. Tilbake huden ble høstet 7 dager eller 12 måneder senere og immunostained for Merkel celle markør keratin 8 (K8). På begge tidspunkter, antall Merkel celler per kontakt kuppelen var lavere i
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
mus sammenlignet med
Atoh1
+ /+
;
ROSA
St
kontroll mus, i samsvar med tidligere rapporterte effekter av heterozygositet på
Atoh1
locus [28] (figur 6A-6E). Ikke på noe tidspunkt gjorde vi finne berørings kupler med eksepsjonelt høye Merkel celle tall, ektopiske Merkel celler eller tegn på tumordannelse. Disse dataene antyder at sT uttrykk alene hos voksne Merkel celler induserer ikke celledeling eller kreftutvikling.
Mitotisk
Atoh1
+ stamceller produsere modne Merkel celler i slutten embryogenese [28]. For å studere effekten av sT uttrykk i denne populasjonen, vi administreres tamoxifen til gravide mødrene ved E14.5 og høstet embryoer ved E18.5 eller 5 måneders alder. Vi fant ut at E18.5
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
mus hadde ~ 50% mer Merkel celler enn kull kontroller, mens fem måneder gamle
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
mus hadde ~ 30% færre Merkel celler enn sine kull kontroller (Fig 6F-6J). Ingen svulster ble funnet på enten alder. Disse dataene er konsistent med sT uttrykk fremme mitose i aktivt delende cellepopulasjoner, og vise at kontakten kuppel Merkel celle tall er regulert selv i møte med denne økte divisjon. Som hos voksne dyr, betyr MCV sT uttrykk ikke forvandle disse cellene.
For å finne ut om kombinert sT uttrykk og tap av p53 ville fremme Merkel celleproliferasjon, vi administreres TMX til E14.5
Atoh1
CreERT2 /+
;
ROSA
ST
;
p53
FLOX /FLOX
mus og høstet huden på P28. Vi fant ingen økning i Merkel celle tall og ingen tegn på tumordannelse (Fig 6K-6M). I motsetning til i St-indusert lever og milt neoplasi, disse data tyder på at sT uttrykk kombinert med
p53
sletting er utilstrekkelig for å fremme vedvarende Merkel celledeling eller tumorigenesis.
Diskusjoner
MCV sT omskaper udødelig gnager fibroblaster som Rat1 og NIH3T3 [14] og viral sT uttrykk er nødvendig for vekst av MCV-positive MCC kreft cellelinjer [15, 16]. De foreliggende data tyder på at MCV ekspresjon i sammenheng med p53 tap fremmer fullstendig neoplastiske lesjoner hos mus. Vi finner at MCV sT induserer embryonale Merkel celleproliferasjon, men er ikke tilstrekkelig til å full rekapitulere Merkel cell carcinoma uavhengig av p53 status.
Nylig Verhaegen et al viste at epitel spesifikke sT uttrykk ved hjelp av en K5 promoter i C57BL /6 mus indusert hyperplastic lesjoner som ligner plateepitelkarsinom
in situ product: [18]. Denne proliferativ effekt ble formidlet via MCV sT LSD domene, som er blitt funnet å målrette flere E3 ligase tumor suppressor-proteiner [12, 13]. I kontrast, fant vi at allestedsnærværende postnatal induksjon av MCV sT uttrykk var jevnt dødelig for mus etter høydose TMX injeksjon. Vår transgen musemodell benytter en kodonoptimalisert MCV sT cDNA, noe som resulterer i høyere protein ekspresjon enn den naturlige sT cDNA-sekvensen (data ikke vist), og cytotoksiske effekter av økte nivåer av MCV sT ekspresjon kan forklare denne forskjellen. Øre, hud, muskler og hjerne vev opprettholdes sT uttrykk lenge etter lavdose TMX injeksjon, noe som tyder på at mus kan tolerere kimære uttrykk for MCV ST.
Spurgeon et al. rapporterte også at når tumor-avledet genomisk T antigen (både St og MCC-avledet avkortede LT) er uttrykt under en konstituerende K14 promoter i FVB /N bakgrunns mus (
K14-MCPyV168
), to tredjedeler av mus er levedyktige, mens resten av musene døde eller ble avlivet ved tidlig alder på grunn av feilernæring [17]. Vi har fått lignende resultater i vår modell.
