Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen (PDAC) er en dødelig sykdom med en fem-års overlevelse på 3-5%. Mutasjoner i K-Ras finnes i nesten alle tilfeller, men K-Ras mutasjoner alene er ikke tilstrekkelig for utvikling av PDAC. Andre faktorer bidrar til aktivering av Ras-signalisering og føre til tumordannelse. Galectin-3 (Gal-3), en multifunksjonell β-galaktosid-bindende protein, er sterkt uttrykt i PDAC. Vi undersøkte derfor den funksjonelle rolle av Gal-3 i bukspyttkjertelkreft progresjon og dens forhold til Ras-signalisering. Uttrykk av Gal-3 ble bestemt ved immunhistokjemi, Q-PCR og immunoblot. Funksjonelle studier som ble utført med bukspyttkjertelen cellelinjer genmodifisert til å uttrykke høye eller lave nivåer av Gal-3. Ras-aktivitet ble undersøkt ved hjelp av Raf-pull-down-analyser. Co-immunoutfelling og immunfluorescens ble brukt for å vurdere protein-protein-interaksjoner. I denne studien viser at vi Gal-3 var sterkt oppregulert i humane svulster og i en mutant K-Ras musemodell for PDAC. Nedregulering av Gal-3 av lentivirus shRNA redusert PDAC celleproliferasjon og invasjon in vitro og redusert tumorvolum og størrelse i en ortotopisk musemodell. Gal-3 bundet Ras og vedlikeholdes Ras aktivitet; nedregulering av Gal-3 redusert Ras-aktivitet, så vel som Ras nedstrøms signalering, inkludert fosforylering av ERK- og AKT og Ral A-aktivitet. Transfeksjon av Gal-3-cDNA i PDAC celler med lav-nivå Gal-3 utvidet Ras-aktivitet og dens nedstrøms signalering. Disse resultater antyder at Gal-3 bidrar til kreft i bukspyttkjertelen progresjon, delvis, ved binding Ras og aktivering av Ras-signalisering. Gal-3 kan derfor være en potensiell ny mål for denne dødelige sykdommen
Citation. Song S, Ji B, Ramachandran V, Wang H, Hafley M, Logsdon C, et al. (2012) overexpressed Galectin-3 i bukspyttkjertelen induserer celleproliferasjon og invasjon av Binding Ras og Aktivering Ras signale. PLoS ONE 7 (8): e42699. doi: 10,1371 /journal.pone.0042699
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 23 februar 2012; Akseptert: 10. juli, 2012; Publisert: 10 august 2012
Copyright: © Song et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert av National Institutes of Health /National Cancer Institute gi R01CA69480 (RSB), amerikansk gastroenterologisk forening Forskning Scholar Award (S. Song), og Public Health service Grant DF56338, som støtter Texas Medical Center Digestive Diseases senter (S. Song) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er i dag den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall, med anslagsvis 43,140 nye tilfeller og 36,800 dødsfall i USA [1]. På grunn av sin aggressive vekst, tidlig metastatisk spredning og mangel på effektive behandlinger, fem-års overlevelse for denne sykdommen er fortsatt på 3-5% [2]. Betydelig innsats har derfor blitt gjort for å forstå de molekylære hendelser som kan drive patogenesen av PDAC. Blant de mange molekylære forandringer identifisert i PDAC, er mutasjoner i pro-onkogen K-Ras finnes i nesten alle tilfeller [3], og er en tidlig begivenhet for utvikling av PDAC [4]. K-Ras mutasjoner alene er ikke tilstrekkelig for utvikling av PDAC. K-ras-mutasjoner er ofte funnet i kronisk pankreatitt og kan også bli funnet i normale individer [5]. Videre betyr K-Ras mutasjon i en musemodell med lav Ras-aktiviteten ikke spontant føre til utvikling av PDAC [6], mens K-Ras mutasjon i en musemodell med et høyt nivå av Ras-aktivitet er forbundet med rask utvikling av CP med rikelig fibrose og progresjon til PDAC som etterligner menneskelig sykdom [3]. Det har derfor vært foreslått at det er aktiviteten av K-Ras snarere enn tilstedeværelsen av mutasjonen per se som er den biologisk relevant parameter assosiert med patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen [2]. Andre faktorer som er nødvendig for at bidra til at Ras-aktivitet; imidlertid mekanismer som Ras-aktiviteten er ytterligere aktiverte er stort sett ukjent.
Galectin-3 (Gal-3), oppviser en b-galaktosid-bindende protein pleiotropiske biologiske og patologiske funksjoner, og har vært implisert i celle vekst, differensiering, adhesjon, RNA prosessering og ondartet transformasjon [7] – [10]. Gal-3 er funnet i flere cellulære avdelinger inkludert i cytoplasma, celleoverflaten, kjernen, og Gal-3 er også utskilt [11]. Betydningen av Gal-tre uttrykk har blitt evaluert i mange krefttyper, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [12] – [16]. Flere studier har indikert at Gal-3 mRNA er oppregulert i pankreatiske tumorvev sammenlignet med kontroll vev [15], [17], [18], [19], og forbigående undertrykkelse av galectin-3 har blitt rapportert å indusere bukspyttkjertelen kreft celle migrasjon og invasjon [16]. Wang et al fant at Gal-3 var også oppregulert i kronisk pankreatitt og antydet at det var involvert i både ekstracellulære matriks (ECM) endringer og ductal kompleksdannelse [20]. Imidlertid gjenstår den fulle betydningen av Gal-3 i PDAC uklart og lite er kjent om de mulige funksjons mekanismer for Gal-3 i patogenesen av PDAC. Nylig Kloog og kolleger vist at K-RAS GTP rekrutterer Gal-3 fra cytosol til plasma membran hvor det blir en integrert nanocluster komponent. Cytosoliske nivået av Gal-3 bestemmer størrelsen av K-Ras GTP nanoclustering og signalutgang på brystkreftceller [21]. Flere nylig, observasjoner fra samme gruppe viste at K-Ras tilknytning Gal-3 bidrar til skjoldbrusk kreft [22]. Ettersom mutasjoner i K-Ras er nesten universell i PDAC og aktiviteten av Ras synes å være en viktig mekanisme for å styre utviklingen av PDAC, søkte vi å bestemme hvorvidt Gal-3 påvirker Ras-aktivitet bidrar til patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen.
i denne studien evaluerte vi systematisk ekspresjonen av Gal-3 i 120 parvise humane pankreatiske vev fra normal pankreas, pankreatitt og pankreatiske tumorer, og for første gang bestemt ekspresjon av Gal-3 i vev og tumorceller avledet fra en mutant K-Ras musemodell for kreft i bukspyttkjertelen. Vi har utvidet resultater fra tidligere undersøkelser, og ytterligere avgrenset funksjonen av Gal-3 in vivo og in vitro med hensyn til kreft i bukspyttkjertelen formasjonen. Gal-tre uttrykk ble økt i bukspyttkjertel kreft og kreftceller, og stimulert kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon og invasjon og fremmet tumorvekst. Gal-tre binder Ras og forbedrer Ras aktivitet og ned-stream signalering. Disse observasjonene støtter konklusjonen om at Gal-3 kan være en potensiell ny mål for denne dødelige sykdommen.
Materialer og metoder
Animal relaterte studier har blitt godkjent av MD Anderson Cancer Center Institutional IACUC komité (ACUF 09-04-08832). Alle andre studier presentert her var de etterforsker initierte og ikke krever godkjenning fra andre kontrollorganer.
Cells og reagenser
Menneskelig Paca cellelinjer (L3.6pl, BxPC-3, Mpanc96, Panc-1, og Miapaca-2) ble gitt velvillig av Dr. C. Logsdon (Department of Cancer Biology) og Dr. S. Guha (Department of Gastroenterology, Hepatology ernæring) ved UT MD Anderson Cancer Center, og har blitt beskrevet tidligere [23], [31]. Alle cellelinje identiteter ble verifisert ved DNA fingerprinting. Celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (100 ug /ml streptomycin og 100 IE /ml penicillin). Anti-Gal-3-antistoff ble oppnådd som beskrevet tidligere [8]. Anti-Ras monoklonalt antistoff, anti-Rala monoklonalt antistoff, anti-fosfo-AKT og anti-fosfo-ERK-antistoffer var fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Anti-cyclin D1 og anti- C-MYC antistoff var fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California).
Protein isolasjon og immunoblot analyse
Totalt bukspyttkjertelkreft cellelysatene inkludert menneske og en K-Ras G12D musemodell [25] ble fremstilt i 2% SDS lyseringsbuffer som tidligere beskrevet [9]. Cytoplasmatiske og atom ekstraksjoner ble utarbeidet etter NE-PER Kjerne- og cytoplasmatiske Utvinning reagenser (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) i henhold til produsentens instruksjoner. Western blot analyser ble utført som tidligere beskrevet [9].
Generering av stabilt Gal-3 taushet overekspresjon PADC cellelinjer med lentiviral shRNA
For å produsere lentivirus for Gal-3 overekspresjon (L- Gal3) eller Gal-3-shRNA (A3), pLVTHM-Gal3 eller pLVTHM-shGal3, respektivt, og kontroll vektor ble kotransfektert med emballasjen plasmid (MD2G) og konvolutt plasmid (PAX2) som kreves for viral produksjon inn i 293ft celler ved hjelp av lipofektamin 2000 reagens (Invitrogen). Medium inneholdende lentivirus med Gal-3 shRNA (kalt A3) og styrevektor (kalt GN10) ble brukt til å transdusere Mpanc96, Miapaca-2 og Panc-1-cellelinjer med høye nivåer av Gal-3 ekspresjon. Medium inneholdende lentivirus med Gal-3 overekspresjon (kalt L-gal-3) og styrevektor (kalt V) ble anvendt for å omsette BXPC-3 og L3.6pl PACA-cellelinjer med lav Gal-3 ekspresjon. Cellesortering ble utført i en fluorescens-aktivert cellesortering Aria strømningscytometer (BD Biosciences). Gal-3 ekspresjon av stabile cellelinjer ble ytterligere bekreftet ved Western bloting.
celleproliferasjonsanalyse
Cellelevedyktigheten ble målt ved bruk av CellTiter Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit som beskrevet [24].
Soft agar-kolonidannelse analysen
5 × 10
3 MPanc96 celler som stabilt uttrykker pLVTHM-shRNAGal3 eller pLVTHM kontroll vektor ble blandet med 0,6% agar i DMEM. Celle /agar-blandinger ble plassert i 6-brønners plater belagt med 0,3% agar i tre eksemplarer. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 10 dager. Koloniene ble farget med Diff-Quik (Dade Behring). Forsøket ble gjentatt tre ganger, uavhengig av hverandre.
Co-immunutfelling
Co-immunutfelling i kontroll GN10 og Gal-3 shRNA A3-celler fra både PANC-1 og Mpanc96 celler ble utført som beskrevet [9 ].
Ras og Ral En aktivitetsanalyse
Like mengder cellelysat protein fra GN10 kontrollceller eller A3 shRNA gal-3 celler fra Panc-1 og Mpanc96 eller BXPC-tre L-gal -3 og dens kontroll BXPC-3 V ble inkubert i 45 minutter ved 4 ° C, med agarose-kuler belagt med Raf1-RBD for total Ras aktivitet eller agarose perler belagt med Ral BP1 agarose for total Ral A-aktivitet (Upstate Biotechnology, Inc. , Lake Placid, New York). Perlene ble deretter vasket og bundet protein ble eluert med 2 x Laemmli-prøvebuffer som hadde blitt forvarmet til 95 ° C og analysert ved immunblotting for Ras ved hjelp av anti-Ras-antistoff eller Rala aktivitet ved anvendelse av anti-Rala antistoff.
Matrigel invasjon analysen
Den invasive evne av celler ble bestemt ved hjelp av Matrigel-belagt invasjons kamre med 0,8-mikrometer porestørrelse (BD Biosciences). En enkeltcellesuspensjon inneholdende 1 x 10
5-celler ble tilsatt til det indre kammer. Etter 16 timer inkubasjon ved 37 ° C i 5% CO2, ble cellene på den øvre overflate av det indre kammeret fjernes med bomullspinner. Invaderte celler som klebet på den nedre overflate av membranen ble fiksert, farget med Diff-Quik (Dade Behring) og tellet.
Indirekte immunfluorescens farging og konfokal lasermikroskopi
Indirekte immunfluorescens farging i BXPC-3-celler ble utført som beskrevet [9]. Uttrykk og lokalisering av proteiner ble observert under et konfokal mikroskop system (FluoView FV500, Olympus, Melville, New York) og analysert av Cellquest PRO programvare (BD Biosciences, San Jose, CA) ved flowcytometri og bildeanalyse Kjernelaboratoriet ved Universitetet of Texas MD Anderson Cancer Center.
sanntids~~POS=TRUNC polymerase chain reaction
for å kvantifisere endringer i Gal-3 mRNA nivåer, ble real-time RT-PCR utføres på ABI Prism 7900 ( Applied Biosystems, Foster City, CA) ved å bruke det kommersielt tilgjengelige genekspresjon assay for Gal-3 (Mm00802901_m1), og den cyklofilin A (4326316E; Applied Biosystems), som beskrevet tidligere [9]. 7900 Sequence Detection System 2.2-programvare (Applied Biosystems, Foster City, California) bestemmes automatisk fold-endring for Gal-tre i hver prøve ved hjelp av δδCt metoden med 95% sikkerhet.
Immunohistochemistry
Immunhistokjemisk farging for Gal3 ble utført på microarray vev lysbilder som består av 125 pancreatic ductal adenokarsinomer og deres sammenkoblede røyk neoplastiske bukspyttkjertelen vev fra pasienter som gjennomgikk pancreaticoduodenetomy ved MD Anderson Cancer Center. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board of M. D. Anderson Cancer Center. Etter antigen gjenfinning og endogen peroksidase blokkering, ble seksjonene deretter inkubert med antistoff mot Gal3 (1:100 fortynning) ved 4 ° C over natten og deretter inkubert med sekundært antistoff ved romtemperatur i 60 min. Standard avidin-biotin immunhistokjemisk analyse av delene ble utført i henhold til produsentens anbefalinger (Vector Laboratories, Burlingame, CA). De fargingsresultater ble evaluert av en patolog (HW), basert på prosentandelen av fargingen i tumorceller (0, ingen farging, 1, ≤10%, 2, 10-50% og 3, 50%) og fargeintensitet (0-negative, 1-svak, 2-moderat og 3- sterk). Svulstene ble kategorisert i Gal3-lav (kombinert scores≤3) og Gal3-høy (kombinert poengsum ≥4).
Othotopic PADC modell
MPanc96 celler stabilt transfektert med Gal-3 shRNA og tilsvarende kontroll-vektoren ble stabilt transdusert med luciferase som tidligere beskrevet [25], [26]. Dyrene ble delt i 2 grupper (n = 5 pr gruppe). Den første gruppen ble injisert med MPanc96 celler som ble transfektert med vektor (GN10) bare og den andre gruppen med MPanc96 celler transfektert med Gal-3 shRNA (A3). Dyrene ble bedøvet med ketamin-xylazin oppløsning, ble en liten venstre abdominal flanke snitt gjort, og (1 x 10
6) MPanc-96-celler i 50 ul PBS ble injisert i subkapsulære region i bukspyttkjertelen ved anvendelse av en 27-gauge nål og en kalibrert trykknapp-styrt utleveringsanordning (Hamilton sprøyte Company). Abdominal såret ble stengt i ett lag med sår klipp (Braintree Scientific, Inc.).
En uke etter implantasjon, svulstvolum ble overvåket ukentlig av non-invasiv sanntid bioluminescence avbildning av IVIS 200 (Xenogen) ved hjelp av en kryogenisk avkjølt bioluminesens imaging system koblet til en datainnsamling datamaskin som kjører Leve Bilde programvare (Xenogen) som tidligere beskrevet [23]. Mus ble fotografert på dag 7, 14, 21, og 28 etter tumorceller implantasjon. Dyrene ble avlivet den 28. dag etter tumorcelle implantasjon. Primærsvulster i bukspyttkjertelen ble skåret ut, og den endelige vekt ble målt. Alle målingene ble sammenlignet mellom to grupper med uparede Student
t
test. Svulstvev og omkringliggende organer ble dyppet i parafin og serie 5-mikrometer seksjoner ble kuttet, farget med hematoksylin-eosin og undersøkt ved lysmikroskopi å bekrefte tilstedeværelse av tumor og mikroskopiske metastaser. Tumorvev ble behandlet for immunhistokjemi og farget for uttrykk av galectin-3, Ras og phopho-ERK. som beskrevet ovenfor.
Statistisk analyse
-analyser er vist i grafene som gjennomsnitt ± SD og representerer resultatene av minst tre forsøk. Betydningen av forskjellene mellom gruppene ble dømt ved hjelp av en to-tailed Student
t
test. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant hvis
P
verdien var. 0,05
Resultatene
Gal-3 er svært oppregulert i menneskelige bukspyttkjertelen tumorvev
Gene expression profilering studier tyder på at Gal-3 er oppregulert i pankreatiske tumorer sammenlignet med kontroll vev [18], [19]. Vi utførte immunhistokjemisk farging av humane pankreatiske microarray med anti-Gal3 antistoff (figur 1A). Vi fant at Gal-3 ekspresjon gradvis øket i sekvensen av sykdomsprogresjon normal (figur 1 A, a, b), pankreatitt (c, d) og pankreatisk duktus adenokarsinom (e, f). Gal-3-farging ble inndelt i to grupper, Gal-3-Low (poengsum 3) og Gal-3-høy (skår 4), basert på fargeintensitet og positiv farging i prosent som beskrevet i Materialer og Metoder. Vi fant at 83 av 125 (66,4%) i bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom prøvene viste høye nivåer av Gal-tre uttrykk (Gal3-høy). Blant disse tilfellene, sammenkoblede røyk neoplastiske bukspyttkjertelen vev var tilgjengelig for evaluering i 108 tilfeller (72 prøver av kronisk pankreatitt og 36 normale prøver bukspyttkjertelen vev) og 32 (29,6%) var Gal3 høy. Gal-tre uttrykk var betydelig høyere i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom enn de sammenkoblede røyk neoplastiske bukspyttkjertelen vevsprøver (p 0,0001). 28 av 72 (38,9%) kronisk pankreatitt prøvene var Gal3-høy sammenlignet med 11,1% (4/36) av normal bukspyttkjertelen vevsprøver (P 0,001) (figur 1B). Disse data indikerer at Gal-3 er oppregulert i løpet av den humane pankreas sykdomsprogresjon normal, pankreatitt og pankreatisk duktus adenokarsinom.
a, Tissue microarray lysbilder som består av 125 pankreatiske ductal adenokarsinomer og sammenkoblede ikke-neoplastiske pankreatiske vevsprøver ble immunhistokjemisk farvet ved anvendelse av et monoklonalt Gal-3-antistoff som beskrevet i Materialer og Metoder. Gal-3 ekspresjon ble øket langs sykdommen sekvens-normal (figur 1 A, a, b), pankreatitt (c, d) og pankreatisk duktus adenokarsinom (e, f). B. Oppsummering av Gal-3 IHC av PDAC microarray. Svulstene ble kategorisert i Gal3-lav (kombinert score ≤3) og Gal3-høy (kombinert poengsum ≥4) basert på prosentandelen av Gal-tre flekker i tumorceller (0, ingen farging, 1, ≤10%, 2, 10-50% og 3, . 50%) og fargeintensitet (0-negative, 1-svak, 2-moderat og 3- sterk)
Gal-3 er svært opp- regulert i bukspyttkjertelen tumor vev og celler fra et K-Ras mutant mus modell
en nylig beskrevet mutant K-Ras mus modell rekapitulerer den menneskelige kreft i bukspyttkjertelen progresjon sekvens fra betennelse til Panin til PDAC [25]. Det var av interesse å finne ut om denne musemodell vil også etterligne endringene i Gal-tre uttrykk observert i humane prøver. Som vist i figur 2A, Gal-3 var udetekterbar i pankreas vev fra normale mus (sporene 1-3), men sterkt oppregulert i syv tumorcellelinjer (sporene 4-10), som ble avledet fra syv forskjellige musetumorer.
A. Gal-3-ekspresjon ble analysert i celler avledet fra normal pankreas og pankreatiske tumorer fra K-Ras mutant mus ved western blotting som beskrevet i Materialer og Metoder. B. Real-time kvantitativ PCR for Gal-tre RNA uttrykk ved hjelp Gal-3-spesifikke primere etter total RNA ekstraksjon fra normal bukspyttkjertelen, pankreatitt vev og pankreastumorer og fra isolerte celler fra forskjellige svulster som oppstår i en K-Ras mutant mus modell som beskrevet i materialer og metoder. Fold endring fra bestemmelser utført in triplo.
For å bestemme om Gal-3 mRNA ble også oppregulert i mus tumorvev sammenlignet med normalt vev og pankreatitt, vev fra individuelle mus som var normal, hadde pankreatitt eller de med tumorer ble ekstrahert og real-time PCR ble utført ved anvendelse av spesifikke mus Gal-3-primere (Mm00802901_m1, Ambion, USA) (figur 2B). Vi observerte at Gal-tre uttrykk var lav i normale bukspyttkjertelen vev (baner 1-3), men ble økt 10-27 ganger i kronisk pankreatitt (baner 4-9) og økt 45-215 ganger i K-RAS mutant mus tumorvev (baner 10-12). Gal-3 mRNA nivåene var enda høyere (62 ganger til 831 ganger), målt i isolerte tumorceller (sporene 13-24).
Generering av Gal-3 over- og under uttrykke PDAC Cells
for å kunne manipulere Gal-3 nivåer i PADC celler, ser vi først bestemmes nivået av Gal-3-ekspresjon i en rekke PADC cellelinjer (figur 3A, øvre panel). MPanc96, MIAPaCa-2 og Panc-1 celler hadde høy basal Gal-3 ekspresjon (figur 3A) og ble stabilt transfektert med lentivirus Gal-3 shRNA (A3-celler) eller vektor bare (GN10 celler). Galectin-3 nivåer ble vellykket redusert i Miapaca-2, Panc-1 og Mpan96 celler henholdsvis 90%, 95% og 92% (figur 3A, midt panel). For å studere effektene av oppregulering av galectin-3, ble Gal-3-cDNA lentivirus transfektert inn PDAC celler med lavere basale Gal-3 nivåer (figur 3A, nedre panel). Disse variantene ble betegnet som L-Gal3 og V (vektorkontroll), som vist i figur 3A, nedre panel. Disse PDAC celler ble anvendt for ytterligere å bestemme funksjonen av Gal-3 i patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen.
A. Gal-tre uttrykk i ulike PDAC cellelinjer som bestemmes av Western blotting (topplaten). Knockdown Gal-3 av lentivirus shRNA av Gal3 (A3) eller kontroll vektor (GN10) i Gal-tre høy celle linjer-Mpanc96, Miapaca-2 og Panc-1 ble bestemt ved immunoblotter (figur 3A, midt panel). Overekspresjon Gal-3 i BXPC-3 og L3.6pl celler nedre Gal3 uttrykt celler ved lentivirusinfeksjon av Gal3 cDNA (L-Gal3) eller vektorkontroll, (v) ble bekreftet ved immunoblot (figur 3A, nedre panel. B. Virkninger av Gal -3 på celleproliferasjon. proliferasjonen av Miapaca-2, og Mpanc96 celler hvori Gal-3 ble nedregulert ved shRNA eller BXPC-3 og L3.6pl celler hvor over-uttrykt ved Gal-3-cDNA ble bestemt ved å bruke CellTiter Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit som beskrevet i Materialer og Metoder. C. Effekt av Gal-3 på kreftcelle invasjon i PDAC celler. Representative felt er vist PDAC-celler (1 x 10
5) i hvilken Gal-3- ekspresjon ble slått ned ved shRNA (A3) og vektor-transfekterte kontrollceller (GN10) ble sådd ut på Matrigel-belagte invasjons kamre, 24 timer senere, ble invaderte celler som klebet på den nedre overflate av membranen fiksert, farget med Diff Hurtig set, og teller slik det er beskrevet i Materialer og Metoder D. Bar graf for prosent av invasjon i begge Mpanc96 og Miapaca-2-celler med Gal3 knockdown (A3) eller kontroll (GN10) representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.; barer, standardfeil, p. 0,001
Gal-3 regulerer celleproliferasjon, invasjon og kolonidannelse i PADC celler in vitro
For å finne ut om Gal-3 spiller en funksjonell rolle i bukspyttkjerteltumorcelle oppførsel in vitro, benyttet vi cellelinjer genetisk endret til å uttrykke forskjellige Gal-3 nivåer, som vist i figur 3A for å bestemme effektene av Gal-3 på tumorcellevekst (MTS-analyse), invasjon (Matrigel invasjon assay ) og in vitro tumorigenisitet (soft agar-kolonidannelse analyse). Slå ned av Gal-3 i Miapaca-2 og Mpanc96 cellene betydelig redusert cellevekst på 72 timer (figur 3B, topp panel). I en komplementær eksperiment, over-ekspresjon av Gal-3 i L3.6PL og BXPC-3-celler (L3.6PL-L-Gal3 og BXPC-3-L-Gal3) øket celleproliferasjon sammenlignet med kontrollceller L3.6PL-V og BXPC-3-V (figur 3B, nedre panel). For å undersøke om Gal-3 påvirker invasive egenskapene til PDAC celler, ble Matrigel invasjon analyser utført. Nedregulering av Gal-3 (A3) i MPanc96 og Miapaca-2-celler ble redusert celle invasjon ved 95% og 90% sammenlignet med kontrollceller (figur 3C og 3D). I motsetning til dette uttrykte Gal3 cDNA-celler BXPC-3-L-Gal3 øket celle invasjon Kapasitet (data ikke vist). Disse resultatene indikerer at Gal-3 spiller også en viktig rolle i invasjonen av PDC-celler.
I tillegg, nedregulering av Gal-3 av shRNA i MPanc96 celler (MPanc96 A3) dramatisk redusert kolonitall i myk agar sammenlignet med vektor-transfiserte kontroller (figur 4a, 4b toppfeltene), mens oppregulering av Gal-3 i BXPC-3-celler betydelig kolonitall i forhold til kontroller (figur 4a, 4b nedre paneler). Disse data indikerer at Gal-3 nivåer påvirker PDAC celleproliferasjon, invasjon og forankrings-uavhengig vekst.
A. Kolonidannelse ble utført i MPanc96 GN10 kontrollceller og Gal-3 shRNA slå ned A3 celler (øverste panel) eller BXPC-3 V kontrollceller og BXPC-3 Gal3 cDNA overexpressed L-Gal3 celler (nedre panel) som beskrevet i Materialer og metoder. MPanc96-A3-celler dannes mindre og færre kolonier sammenlignet med vektor-transfiserte kontrollcellene (GN10). I motsetning til dette, BXPC-3-L-Gal3 celler dannet større og et større antall kolonier enn kontroll V-celler. B. Bar graf i panelet til høyre viser gjennomsnittskoloni tallene etter plating enten MPanc96 GN10 kontrollceller og shRNA slå ned A3 celler (øverst) eller BXPC-3 V og BXPC-tre L-Gal3 (lavere); p 0,001. C. Representant Bioluminescens bilder av atymiske mus 3 uker etter orthotopic implantasjon av GN10 og A3 bukspyttkjertelen kreftceller orthotopically i bukspyttkjertelen av atymiske mus. D. Målinger av fotoner /s /cm
2 /steridian viser bioluminesens område på 10% peak margin (gjennomsnitt ± SE) i uke 3 bruker Xenogen IVIS som beskrevet i materialer og metoder (
n
=
5
). E. Tumorvekter fra kontrollmus (GN10, n = 5) og Gal3 knockdown gruppe (A3, n = 5) ble veiet etter at musene var ofring ved uke fire. F. Muse tumorvev fra kontroll (GN10) og Gal-tre knockdown gruppe (A3) ble immunohistochemically farget ved hjelp av Gal-3, Ras og fosfo-ERK antistoffer som beskrevet i materialer og metoder.
Nedregulering Gal-3 hemmer tumorvekst i en in vivo orthotopic modell
for å undersøke påvirkning av Gal-3 nivåer på in vivo vekst av PDAC, MPanc96 celler stabilt transfektert med Gal-3 shRNA eller en kontroll shRNA vektor var merket med ildflue luciferase for å tillate sanntids bioluminescens avbildning for å overvåke tumorvolum og spres in vivo. Disse cellene ble orthotopically injisert inn i kroppen i bukspyttkjertelen fra nakne mus, og tumorvekst ble overvåket ved ikke-invasiv avbildning gang per uke. Forskjeller i veksten av tumorene ble notert i løpet av 3 uker (representative bilder som vist i figur 4C). Kvantitativ evaluering av tumorbyrden viste at svulster var signifikant større i kontrollgruppen sammenlignet med Gal-3 knock down gruppe (figur 4D) (p 0,05). I tillegg primære tumorvektene var betydelig mindre i Gal3 slå ned gruppe enn i kontrollgruppen som vist i figur 4 E; Immunhistokjemisk farging for Gal-3, Ras og fosfo-ERK i disse musene tumorvev (figur 4F) bekreftet videre at ekspresjon av Gal-3, Ras og den nedstrøms effektor fosfo-ERK er redusert i Gal-3 knock down gruppe sammenlignet med kontrollgruppen. Regionale mikrometastaser ble observert i dyr injisert med kontrollceller (5/5 dyr), men ikke hos dyr injisert med celler hvor galectin-3 hadde blitt slått ned ved stabil transfeksjon av galectin-3 shRNA (0/5 dyr) (figur S1 ).
Gal-3 binder til Ras og øker Ras-aktivitet i celler PDAC
Det har tidligere blitt rapportert at Gal-3 er forbundet med aktivert K-Ras og fremmer sterk aktivering av Raf- 1 og PI3-K, men demper aktivering av ERK-signalering i COS-celler [21]. Vi har derfor en hypotese om at Gal-3 ville binde med Ras og megle Ras aktivitet i PDAC celler preget av den hyppige forekomsten av Ras mutasjoner. Ved hjelp av et antistoff array (Hypromatrix, Worcester, MA), vi har oppdaget samspillet mellom Ras og Gal-3 bruker HA merket Gal3 transfektert BXPC-3 lysat (data ikke vist). Ras ble bekreftet å være en av de bindingspartnere av Gal-3 basert på data fra antistoff array. For ytterligere å bekrefte at Ras samhandler med Gal-3, brukte vi co-immunoprocipitation analyser. Lysates fra Panc-1 og MPanc96 med eller uten slå ned av Gal-3 ble utsatt for immunoprecipitation med enten Gal3 rotte monoklonalt antistoff eller en pan anti-Ras monoklonalt antistoff etterfulgt av immunoblotting med anti-Ras eller maur-Gal3 antistoffer. Resultatene viste at Gal-3 co-immunopresipitert med Ras, mens lysatene med normal IgG ga ingen synlige band (figur 5A).
A. Co-Immunoutfelling ble utført i Panc-1 og MPanc96 med knock down Gal-3 ved anvendelse av enten anti-Ras eller anti-Gal-3-antistoff som beskrevet i Materialer og Metoder. B. Like mengder protein fra PANC-1 og Mpanc96 GN10 kontrollceller eller shRNA A3-cellene ble inkubert med agarose-kuler belagt med Raf1-RBD, og aktiv Ras-GTP ble detektert som beskrevet i Materialer og Metoder. C. Aktiv Ras GTP-aktivitet ble bestemt i BXPC-3-L-Gal3 celler og kontrollceller (V) som beskrevet i Materialer og Metoder. D. Cell plasmamembran og cytoplasmatiske fraksjoner av GN10 og A3-celler fra både Panc-1 og MPan96 ble underkastet SDS-PAGE og deretter immunoblottet med anti-Ras-antistoff. E. Indirekte immunfluorescens ble utført på BXPC-3-V og BXPC-3 L-Gal3-celler ved anvendelse av anti-Gal-3-antistoff (TIB166 1:100, rød) og anti-Ras-antistoff (1:100, grønn), etterfulgt av DAPI kontra (blå). Flettingen av Gal-3 (rød) og Ras (grønn) med DAPI (blå) er også vist.
For å kunne fastslå om samspillet mellom Ras og Gal-3 påvirker Ras aktivitet, vi undersøkte effektene av å manipulere Gal-tre uttrykk i Ras aktivitet. Som vist i figur 5B, nedregulering av Gal-3 i Panc-1 og MPan96 celler (A3) ble redusert Ras-aktivitet ved hjelp av Ras-GTP-analyse, mens overekspresjon av Gal3 i BXPC-3-celler økte Ras GTP-aktivitet (figur 5C) . For ytterligere å belyse hvordan Gal-3 medierer Ras-aktivitet, cellemembran og cytosoliske proteiner ble isolert [26] fra Panc-1 og MPanc96 kontrollcelle (GN10) og knock down-celler (A3) og Ras-protein ble påvist ved hjelp av immunblotting. Mindre Ras-protein ble påvist i plasmamembraner PANC-1 A3 celler og Mpanc96 A3-celler sammenlignet med kontroll GN10 celler (figur 5D). I kontrakten ble mer RAS protein observert i cytosol av Panc-1 og Mpanc96 A3 celler i forhold til å kontrollere GN10 celler. Disse data tyder på at Gal-3 kan styre Ras subcellulære lokalisering. Konfokalt immunfluorescens bekreftet at oppregulering av Gal-3 i BXPC-3-celler er assosiert med økt Ras på plasmamembranen (figur 5E) .Dette antyder at Gal-3 binder Ras og er ansvarlig for Ras festing til celleplasmamembranen dermed formidling sin aktivitet.
Gal-tre formidler Ras nedstrøms signalering i PDAC celler
aktivert Ras (GTP-bundet tilstand) aktiverer nedstrøms effektorer inkludert Raf /mitogen-aktivert protein (MAP) /al. al.
