Abstract
microRNAs blir utnyttet for diagnose, prognose og oppfølging av kreft og andre sykdommer. Deres høye vev spesifisitet og kritisk rolle i onkogenese gi nye biomarkører for diagnostikk og klassifisering av kreft samt forutsi pasientens utfall. MicroRNAs signaturer er identifisert for mange humane tumorer, inkludert tykktarmskreft (CRC). I de fleste tilfeller er metastatisk sykdom vanskelig å forutsi og hindre at med tilstrekkelig terapier. Målet med vår studie var å identifisere en mikroRNA signatur for metastatisk CRC som kunne forutsi og skille metastatisk målorgan lokalisering. Normale og kreft vev av tre ulike grupper av CRC-pasienter ble analysert. RNA microarray og TaqMan Array analyse ble utført på 66 italienske pasienter med eller uten lymfeknuter og /eller lever tilbakefall. Data oppnådd med de to analysene ble analysert separat og deretter gjennomskåret for å identifisere en primær metastatisk CRC-signatur. Fem forskjellig uttrykt microRNAs (HSA-MIR-21, -103, -93, -31 og -566) ble validert ved QRT-PCR på en annen gruppe på 16 amerikanske metastatiske pasienter.
In situ
hybridisering ble utført på de 16 amerikanske pasienter så vel som på tre distinkte kommersiell vev microarray (TMA) som inneholder normal tilstøtende kolon, den primære adenokarsinom, normale og metastatiske lymfeknuter og lever. Hsa-miRNA-21, -93, og -103 oppregulering sammen med HSA-MIR-566 downregulation definert CRC metastatisk signatur, mens
in situ
hybridisering data identifisert en lymphonodal invasjon profil. Vi ga første microRNAs signatur som kan diskriminere mellom kolorektal tilbakefall til lymfeknuter og lever og mellom kolorektal levermetastaser og primær levertumor
Citation. Drusco A, Nuovo GJ, Zanesi N, Di Leva G, Pichiorri F , Volinia S, et al. (2014) mikroRNA Profiler diskriminere mellom Colon Cancer metastasering. PLoS ONE 9 (6): e96670. doi: 10,1371 /journal.pone.0096670
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 04.01.2014; Godkjent: 10 april 2014; Publisert: 12 juni 2014
Copyright: © 2014 Drusco et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av NIH Grant U01 CA152785 microRNAs /UCRs: biomarkører for kreftrisiko, tumordeteksjon, progresjon og behandling. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den viktigste årsaken til død hos kreftpasienter er metastatisk sykdom [1]. Kreft celler formidling har vært ansett som en sen flertrinns hendelse i løpet svulst utvikling. Etter at den primære tumorvekst, genetisk valgt, ondartede celler invadere den lokale vev, gå inn i blod og /eller lymfekar, kan transporteres til fjerntliggende steder og kolonisere nye organ vev. Nye bevis tyder på at tumor spredning kan være en tidligere hendelse som vil til slutt manifest etter flere år fra diagnose [2] – [5]
Tykktarmskreft er den tredje vanligste kreftformen i den industrialiserte verden etter lunge og bryst. kreft: om lag halvparten av pasientene dør av metastatisk sykdom innen 5 år fra diagnose [6]. De første stedene i metastatisk sykdom av tykktarmskreft er de regionale lymfeknuter og leveren. Patologisk undersøkelse av colon adenocarcinoma kan ikke nøyaktig forutsi pasienter som vil ha disseminert sykdom til lokale lymfeknuter og /eller for å fjerne områder. Imidlertid, i tykktarmen, så vel som på bryst og melanom kreftpasienter, kan nærværet eller fraværet av lymfeknuter invasjon påvirke den type kirurgisk reseksjon eller den type kjemoterapi regime [7] -. [9]
Selv om metastaser til leveren ofte kommer fra tykktarm kreft, det er tilfeller der metastaser er den første og eneste funn hos pasienter med en ukjent primærtumor stedet [10], og skillet mellom primær leverkreft og levermetastaser fra ulike mulige områder er av terapeutisk og prognostisk verdi [11].
det er derfor et økende behov for nye diagnostiske og prognostiske markører som kan diskriminere mellom primærtumor og de forskjellige områder av metastase, samt å forutsi den metastasering av tilbøyelighet primærtumor.
microRNAs eller mirnas, er små (19-25 nukleotider) ikke koding RNA, som regulerer gener uttrykk ved å etter transcriptionally undertrykke mRNA oversettelse, og /eller forårsaker mRNA degradering. De er involvert i reguleringen av de fleste fysiologiske prosesser [12], og blir avvikende uttrykt i tumor initiering og progresjon, forutsi sykdomsstatus og klinisk utfall [13], [14]. Interessant, microRNAs signaturer er svært spesifikke vev og kan brukes til å klassifisere kreftformer, og for å identifisere den primære tumor av en metastatisk lesjon av ukjent opprinnelse [15] -. [19]
Målet for studien var å identifisere en mikroRNA signatur som kan gjøre det mulig å skille mellom lymphonodal og levermetastaser hos pasienter med colo-endetarms kreft.
Materialer og metoder
pasient~~POS=TRUNC vevsprøver
Tre grupper av pasienter vurderes i undersøkelsen (Tabell 1).
Parafin innebygd vev fra 66 pasienter diagnostisert med tykktarmskreft ble valgt fra Universitetet i Roma «La Sapienza», HiO Anatomia ed Istologia Patologica C /Cardiovascolare, vev bank i henhold til TNM staging.
av 66 pasienter, 18 presentert en primær colonic svulst uten metastaser (Alle T, N0, M0), 33 hadde tykktarmskreft med lymfeknuter metastaser bare (Alle T som helst, N, M0) og 15 ble diagnostisert med tykktarmskreft, lymfeknuter og levermetastaser (Alle T, Enhver N, M1). Separate tumorprøver fra primærtumor, de metastatiske lymfeknuter og levermetastaser ble samlet for hver pasient og behandlet for tissue microarray og TaqMan Array mikroRNA kort.
En annen gruppe på 16 pasienter som kommer fra filer av OSU Pathology avdeling ble inkludert i studien. For hver pasient, ble normalt tarmvev, primær colonic adenocarcnoma, metastatiske lymfeknuter og metastatisk lever analysert, så vel som de tilsvarende normale lymfeknuter og lever, når det er tilgjengelig. Den TMA som ble generert fra disse pasientene prøvene pluss tre sett med amerikanske Biomaks Vev arrays (BN05014 med 24 tilfeller BC05118 med 50 saker, CO702 med 69 tilfeller) ble brukt for In Situ Hybridisering (ISH). US Biomaks tilfeller representerer den tredje gruppen av pasienter inkludert i studien med normale tilstøtende colonic vev, primært kolon adenokarsinom uten lymfeknute /fjernmetastaser og primær tykktarmskreft av pasienter med dokumentert lymfeknuter og levermetastaser, og selve lymfeknute og /eller levermetastaser
prosjektet ble godkjent av italiensk (Presidente -. Prof. Aldo ISIDORI, professor Lucio MIANO, Dott.ssa Amalia Allocca, Dott.ssa Enrica Arduini, Dott.ssa Maria Caporale, Prof. Luciano Caprino, Dott.ssa Avia Carabelli, professor Francesco COGNETTI, Dott.ssa Anna DALLE ORE, Prof.ssa Marzia Duse, Dott.ssa Giuseppina DI GIAMMARCO, Dott. Domenico Antonio IENTILE, professor Giovanni fabbrini, Prof.ssa Paola FRATI , Dott.ssa Maria Teresa LUPO, Prof. Franco Mandelli, Dott. Enrico MARINELLI, Dott.ssa Boza MAURO, Prof. Paolo mene «, Dott.ssa Elisabetta SIMONGINI, Prof. Pietro SERRA, professor Giovanni Spera, Dott. Ettore Tiberi , AVV. Angelo Hvilke som helst tuzza, Prof.ssa Annarita Vestri, Prof. Vincenzo ZIPARO) og amerikanske (https://orrp.osu.edu/irb/irbforms/) Etisk Commettee (Prot.1119 /13, Prot.2007E0748 henholdsvis). Spesielt både Commettees, Ohio State University Institutional Forsk og il Comitato Etico «La Sapienza», fritatt oss fra pasienter informert samtykke siden, i begge tilfeller, parafin innebygd vev ble anonymt arkivert prøver, valgt i henhold til deres TNM staging og pasienter var ikke lenger tilgjengelig.
RNA ekstraksjon
Total RNA ble ekstrahert behandling fem 20 mikrometer tykke seksjoner fra hver parafin innebygd vev, ved hjelp av RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit (ambion # 1975) og etter produsentens instruksjoner.
RNA merking og hybridisering på miRNA microarray sjetonger ble utført som tidligere beskrevet [20]. Fem pg av hver prøve total RNA ble hybridisert på vår miRNA microarray (Ohio State Comprehensive Cancer Center, versjon 2.0), som inneholder 460 modne mirnas sonder, oppdaget i fire eksemplarer (235
Homo sapiens
, 222
Mus musculus
, og tre
Arabidopsis thaliana
). Forskjellige prober ble anvendt for å gjenkjenne hvert modne miRNA og de fleste av de miRNAs forløpere. Hybridisering signaler ble oppdaget med streptavidin Alexa Fluor 647 konjugater og skannede bilder (Axon 4000B) ble kvantifisert ved hjelp av GenePix 6.0-programvare (Axon Instruments). De samme prøvene ble også analysert med RT-PCR-kort (Applied Biosystems).
miRNA microarray
Mikromatriser ble i hovedsak analysert som beskrevet av Liu et al [21]. Quantiles normalisering og statistiske analyser ble utført ved hjelp av BRB ArrayTools utviklet av Richard Simon og Amy Peng Lam [22].
uttrykt forskjellig mirnas ble identifisert ved hjelp av et tilfeldig varians t-test. Den vilkårlige variansen t-test er en forbedring i forhold til standard separate t-test som det tillater deling av informasjon mellom gener ca. innenfor klassen variasjoner uten forutsatt at alle genene har samme varians. Gener ble ansett som statistisk signifikant dersom P-verdi var lavere enn 0,05. [23].
Multiple testing ble kontrollert ved hjelp av falsk oppklaringsprosenten. miRNA nomenklatur ble etablert i henhold til UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/) og miRBase (https://www.mirbase.org/); i tilfelle avvik i miRBase ble fulgt.
Rådata er tilgjengelige på GEO nettsted (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350) .
TaqMan Array mikroRNA kort og Kvantitativ real Time PCR
real Time PCR ble utført ved hjelp av TaqMan Array Menneskelig mikroRNA panel (v.1, Applied Biosystems, Foster City, CA) og 50 ng av RNA pr port for en total på 400 ng. Denne matrise inneholder 365 miRNA mål så vel som endogene kontroller. Normalisering ble utført med små nukleære RNA (snRNA) U44 og U48. Uttrykk for enkelt modne miRNAs ble vurdert av TaqMan miRNAassay (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), og normalisert til RNUB6 (Applied Biosystems). Rådata er tilgjengelige på GEO nettsted (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350).
In situ hybridisering
In situ hybridisering ble utført på utvalgte microRNAs etter en tidligere beskrevet protokoll [24] under anvendelse av Exiqon LNA-5’DIG merkede prober. Tre USBiomax microarray (TMA) lysbilder (Colon normal Tissue matrise med 21 normale tilfeller og 3 adenokarsinom tilfeller, tykktarmskreft og matchet tilstøtende normalt vev array med 25 tilfeller, tykktarmskreft vev array med metastaser og tilstøtende normalt vev med 68 tilfeller) og en lysbilde med vev kjerner fra 16 pasienter (OSU TMA) ble brukt. For hver valgt mikroRNA, ble scoret TMA i henhold til den relative mikroRNA ekspresjon av hver kjerne ved to patologer som definert av prosentandelen av positive tumorceller, og styrken av signalet i disse kreftcellene i positive tilfeller. Poengene ble generert blindet for tilstedeværelse eller fravær av metastatisk sykdom og Mann-Whitney test ble brukt for å sammenligne klasser
Resultater
Vår studie ble utviklet i fire trinn ved å dra nytte av.: (i) DNA mikromatriser, (II) TaqMan høy tetthet kort, (III) Taqman enkelt assay QRT-PCR og (IV) in situ hybridisering. For å oppnå mer robuste resultater, brukte vi tre ulike grupper av pasienter (tab 1). Den første gruppen inkluderte 66 italienske pasienter (III Clinica Chirurgica, Universita «di Roma «La Sapienza», Roma, Italia) med kolon adenokarsinom: 18 pasienter ikke har noen metastaser, 33 hadde påvirket lymfeknuter og 15 viste metastaser i begge lymfeknuter og leveren. Totalt RNA fra 18 colonic primære svulster (T) uten metastaser, 33 colonic primære svulster (T
N) med lymphonodal tilbakefall og tilsvarende 33 metastatiske lymfeknuter (N
N), 15 colonic primære svulster (T
L,) av pasienter med lymphonodal og levermetastatisk sykdom og tilsvarende 15 metastatiske lymfeknuter (N
L) og leverlesjoner (L), ble testet på den tilpassede microarray plattform som tidligere var blitt brukt til å etablere kreft mikroRNA signaturer i flere studier [13], [14], [21], og på Taqman Array mikroRNA kort (Applied Biosystems). Data ble normalisert i henhold til de krav og plattform de samme sammenligninger mellom klassene ble brukt til begge datasettene separat. Vesentlig endret mirnas ble identifisert og resultatene ble krysses. Bare microRNAs med en fold endring forskjell større enn 2 eller lavere enn 0,5 ble ansett som de antatte pro-metastatisk og anti-metastatiske mirnas hhv. Tolv microRNAs var konsekvent bare oppregulert i metastase (HSA-MIR-103, -155, -16, -191, -200c, -21, -24, -26a, -26b, -29a, -31 og 93) og to ble nedregulert (HSA-MIR-328 og -566) (tabell 2).
Den doble rekke strategi tillatt oss å teste de samme prøvene med to ulike tekniske tilnærminger.
For ytterligere å bekrefte identifisert «metastatisk» signatur, ble valgt microRNAs testet på seksten amerikanske pasienter med metastatisk kreft i tykktarmen (OSU Pathology Dept., Columbus, OH). For hver pasient, total RNA av parafin innebygd vev kjerner av normal og ondartet tykktarm, lymfeknute og leveren, ble analysert ved enkelt QRT-PCR. Mann-Whitney test ble brukt for å sammenligne PCR resultatene fra de ulike pasientgruppene.
Primærmetastatisk colonic adenokarsinomer viste en signifikant overekspresjon av HSA-MIR-21 (P-verdi = 0,0011), -31 (P -verdi = 0,0003), -93 (P-verdi = 0,0048), -103 (p-verdi = 0,0142) og nedregulering av hSA-MIR-566 (P-verdi = 0,0075) i forhold til deres tilstøtende normalt vev (tabell 2 ). Videre gjelder normal, HSA-MIR-21 og -93 var signifikant oppregulert i levermetastaser med en P-verdi = 0,020 og P-verdi = 0,0002 kroner. Hsa-MIR-21 ble også betydelig overuttrykt i metastatiske lymfeknuter (P-verdi = 0,009) (figur 1). Disse fem validerte microRNAs korrelerte ikke med svulst staging.
Normal kolon vev (NORM), tykktarm adenokarsinomer (ADENOCA), lymphonodal metastase (POSLYM) og tykktarms lever (LIVERMET) for MIR-21 (A), Mir -31 (B), MIR-93 (C), MIR-103 (D) og Mir-566 (E). En Mann-Whitney test ble brukt for å sammenligne grupper. Grupper er vist på boksplott «x-aksen, mens delta Ct verdier er representert på y-aksen. For hver boks, baren representerer Median, området den 25
th og 75
th persentilen og linjene til grafen de største og minste verdier. Hver P-verdi bar tilsvarer en sammenligning: for hver MIR den første nedre bar refererer til NORM vs ADENOCA sammenligning; MIR-21 andre lavere bar P-verdien tilsvarer den NORM vs POS lymfe sammenligning, mens den første øvre bar både MIR-21 og -93 tilsvarer NORM vs LEVER MET sammenligning.
I tumorer, blir de inflammatoriske og stromale celler spredt blant benigne og maligne epitelceller, og trinnløst bidra til cellularitet av lesjonen. Det er således viktig å forstå hvilken type celle uttrykker et spesifikt mikroRNA. For dette formål, in situ hybridisering forsøk ble utført på TMA med primær adenokarsinomer, metastatiske lymfeknuter, lever metastase og normale vev. Hsa-MIR-21, -93, -103 og -566 prober ble hybridisert til OSU TMA og USBiomax TMA lysbilder. To uavhengige patologer scoret hvert lysbilde kjerne blindet til stedet av biopsi og til klinisk staging historie, med tanke på signalstyrken for colonic ondartede celler i forhold til de tilstøtende normal epitel og ikke-epitelceller (fig.2). HSA-MIR-21 (P-verdi 0,0001) og -103 (p-verdi = 0,0009) var betydelig overuttrykt i adenokarsinomer og metastatiske kreftformer i forhold til normaler (Fig.2: A, B). En Chi-squared test avslørte en lineær trend for begge, HSA-MIR-21 (P-verdi 0,0001) og HSA-MIR-103 (P-verdi 0,0001): de ble stadig oppregulert utvikler seg fra det normale, til adenokarsinom og til metastasering (figur 3, figur 4). Imidlertid, mens HSA-MIR-103 ble betydelig overuttrykt i levermetastaser i forhold til adenokarsinomer og positive lymfeknuter, HSA-MIR-21 viste ingen signifikant forskjell mellom de tre klassene. ISH av HSA-MIR-93 bekreftet sin oppregulering i adenokarsinomer og levermetastaser, som viser en signifikant forskjell mellom normale og enten adenokarsinomer (P-verdi = 0,0345) eller levermetastaser (P-verdi = 0,007) og mellom adenokarsinomer og levermetastaser (P verdi = 0,043). Ingen signifikant forskjell ble funnet ved sammenligning normaler og adenokarsinomer versus positive lymfeknuter (Fig. 2C og Fig.5). Således kunne HSA-MIR-93 ekspresjon mønster skille normal tykktarm fra primær adenokarsinom, og normal colon og primær adenokarsinom fra levermetastaser, men ikke fra sekundær tumor lymphnodal invasjon. Hsa-MIR-566 ble like overexpressed i normal tilstøtende colonic vev, primært adenokarsinom ondartede celler og lever colonic metastatiske celler (Fig. 2D). Men positive lymfeknuter viste en betydelig svakere signal i forhold til norm (P-verdi = 0,002) og adenokarsinom (P-verdi = 0,043), noe som tyder på at tap av HSA-MIR-566 kan lette lymfeknute invasjonen i tykktarmskreft.
med normal kolon vev (NORM), tykktarm adenokarsinomer (ADENOCA), lymphonodal metastase (POSLYM) og tykktarms lever (LIVERMET) for MIR-21 (A), MIR-103 (B), MIR-93 ( C), MIR-566 (D) og Mir-200c (E). En Mann-Whitney test ble brukt for å sammenligne grupper. Grupper er vist på boksplott «x-aksen, mens Den gjennomsnittlige poengsum verdier er representert på y-aksen. For hver boks, baren representerer Median, området den 25
th og 75
th persentilen og linjene til grafen de største og minste verdier. Hver P-verdi bar tilsvarer en sammenligning: Mir-21, -103, -93, og -200c den første nedre bar tilsvarer NORM vs ADENOCA sammenligning; MIR-21, -103 og -93 første øvre barer refererer til NORM vs LEVER MET sammenligning, mens MIR-566 og -200c øverste linjene viser NORM vs POS lymfe sammenligning; MIR-566 og MIR-200c lavere Linjene angir ADENOCA vs POS lymfe og NORM vs POS lymfe sammenligning henholdsvis.
Som dokumentert i litteraturen, MIR-21 viste et svakt signal i normal tykktarm hensyn til adenokarsinom (P-verdi = 0,0011) og det var sterkt uttrykt i metastasering. MiR-21 uttrykk ble oppdaget bare i primær adenokarsinom og metastatiske ondartede celler.
I normal tykktarm pilen peker på mangelen på MIR-103 uttrykk i epitelceller. I den primære svulsten pilen peker på økt uttrykk av MIR-103 i invasiv adenokarsinom. Pilen i leveren tilbakefall og de to piler i lymfeknutemetastaser viser en dramatisk økt uttrykk av MIR-103 i metastatisk adenokarsinom epitel.
Induksjon av epithelial-til-Mesenchimal Transition (EMT) har blitt ansett som et viktig skritt i utviklingen av metastatisk kreft. Nylig har det blitt demonstrert at HSA-MIR-103/107 indirekte nedregulerer MIR-200 familiemedlemmer, og at et slikt mønster er forbundet med mesenchymale fenotype i brystkreftcellelinjer [24].
I vår studie, microarray plattform og Taqman assay, isolert både HSA-MIR-103 og HSA-MIR-200c. Vi ønsket å forstå om, som i bryst metastatisk kreft, ble disse to mirnas omvendt korrelert i tykktarm metastatisk kreft. Selv om det ikke signifikant ved QRT-PCR, ble TMA hybridisert med HSA-MIR-200c probe og scoret (Fig. 2E). Sammenlignet med normaler, ble en høyere signalintensitet oppdaget i adenokarsinomer (P-verdi = 0,0023) og positive lymfeknuter (P-verdi = 0,0006). En signifikant positiv korrelasjon mellom HSA-MIR-103 og HSA-MIR-200c var til stede i lymfeknutemetastaser (p-verdi = 0,0225), men ikke i adenokarsinomer eller levermetastaser. Derfor HSA-MIR-103 og HSA-200c ble ikke omvendt korrelert, og ikke regulere EMT i metastatisk tykktarmskreft
in vivo
, men ble begge overexpressed i adenokarsinomer og lymfeknuter metastasering. Vi undersøke ikke HSA-MIR-107 eller andre medlemmer av MIR-200 familie fordi EMT ikke var relevant for målet for vår studie.
Interessant, HSA-MIR-31 ISH (data ikke vist) avslørte et meget sterkt signal i inflammatoriske celler som omgir tumorer. En svakere farging ble observert i tumor og normale colonic celler, men bare noen få HSA-MIR-31 uttrykkende lymfocytter som var til stede i normale lymfeknuter, noe som tyder på at HSA-MIR-31 oppregulering resulterte stort sett fra den inflammatoriske snarere enn fra ondartet komponenten av svulst
Tabell 1 rapporter antall tilfeller med TNM staging som ble analysert ved hvert teknisk trinn i vår studie.; Tabell 2 viser mikroRNA underskrifter med hver teknisk prosedyre.
Diskusjoner
2009 AJCC utgaven har publisert en ny tykktarmskreft TNM klassifisering, som har underklasser blitt lagt til (N) nodal sykdom iscenesettelse. Andre forfattere har foreslått å erstatte N-kategorier med antall positive lymfeknuter, og flere kirurgiske publikasjoner har foreslått en mer radikal lymphadenectomy for å bedre definere prognose for å forbedre tykktarmskreftpasienter overlevelse [26] – [29]. Nodal invasjon er et kritisk trinn for å definere tykktarmskreftpasienter prognose og behandling. Men 25% av lymfeknute-negative pasienter opplever tilbakefall og ikke alle pasienter med positive lymfeknuter har en dårlig prognose [30] -. [32]
På den annen side, primærtumor spredt til leveren, er den viktigste årsaken til sykdomsprogresjon i pasienter med kolorektal kreft, med 15-30% av pasienter med synkrone lever lesjoner ved tidspunktet for primær kolorektal kirurgi, og viser metachronous tilbakefall etter aggressiv leverreseksjon [33] -. [35]
Derfor er det viktig å identifisere nye molekylære biomarkører som, sammen med TNM staging system, kan forbedre diagnostikk og klassifisering av metastaserende tykktarmskreftpasienter.
Formålet med denne studien var å identifisere en mikroRNA signatur for metastatisk kreft i tykktarmen som kan diskriminere mellom lymfeknuter og levermetastaser.
i litteratur, de fleste av de rapporterte microRNAs kreft signaturer har blitt identifisert og validert på samme vevsprøver. For å øke påliteligheten av våre data, med unntak av de to første analysene ble hver valideringstrinnet utført på en annen gruppe pasienter.
Microarray og kort plattformer krysses data identifisert fjorten forskjellig uttrykt microRNAs, hvorav fem ble validert ved QRT-PCR. Hsa-MIR-21, -31, -93, -103 ble oppregulert i primære svulster i forhold til det normale, mens HSA-MIR-566 ble nedregulert. HSA-MIR-93 og -31 var også oppregulert i levermetastaser, men ikke i lymfeknuter var positive for metastasering, mens HSA-MIR-21 over-ekspresjon var tydelig i både lever og lymfeknuter metastasering. Med unntak av HSA-MIR-31, in situ hybridisering (ISH) av colonic adenocarcinomer og tilsvarende tilstøtende normalt vev, så vel som dets nodale og levermetastaser mikromatriser vev, bekreftet signaturene identifisert av kortene og qRTPCR analyser. Hsa-MIR-31 har blitt funnet dysregulerte i flere primær epiteltumorer der, ifølge tumorlokalisering, synes det å utløse ulike kreft veier: det er oppregulert i enkelte karsinom [36] – [41], og nedregulert i andre [42] – [45]. En slik tosidigheten, har blitt funnet i invasive tumorer, så vel: i colon cancercellelinjer, er invasjon fremmet av HSA-MIR-31 overekspresjon [46], [47], mens, i brystcancercellelinjer, sin lave nivåer fremmer en mer aggressiv atferd [42], som korrelerer til en dårligere pasient prognose.
Målrettet funksjoner av HSA-MIR-31 inkluderer angiogenese, hvor dens oppregulering øker blod, men ikke lymfekar spire [48], og akutt betennelse [49]. Vi fant at HSA-MIR-31 er for det meste oppregulert i peritumoral inflammatoriske celler, sammenlignet med kreft og normale celler. Dermed HSA-MIR-31 feilregulering i grunnskolen aggressive svulster er et udiskutabelt bevis, men samspillet av sine funksjoner mellom inflammatorisk, neoangiogenic og tumormetastatisk sammenheng, behov, likevel, som skal belyses.
Hsa-MIR -21 er en annen multitask mikroRNA som har vært implisert i inflammasjon [50] – [53], immun sykdom [54] – [57], utvikling [58] – [61], angiogenese [62], [63], og kreft metastase [18], [64] – [82]. Flere studier har faktisk rapportert sin over-uttrykk i ulike typer svulster, inkludert tykktarmskreft, hvor nivåene relateres til klinisk progresjon, dårlig overlevelse og terapeutisk utfall [83], [84].
Etter avtale med våre tidligere studier og andres, QRT-PCR validert HSA-MIR-21 oppregulering i colonic adenokarsinomer og metastasering i forhold til det normale. In situ hybridisering data viste en trend: HSA-MIR-21 nivåer var lavest i normalt vev, og stadig høyere i adenokarsinom og metastase, i mellomtiden ble en tilsvarende ekspresjon observert i kreftceller knutepunkter og lever gjentagelse, noe som tyder på at HSA-speil 21 oppregulering kunne forutsi en avansert metastatisk sykdom.
Som med HSA-MIR-31, høye nivåer av HSA-MIR-21 og -93 har blitt beskrevet av andre forfattere i leverkreft [39], [85] [86], og derfor kan de ikke anses som et diagnostisk differensial signatur mellom levermetastaser og hepatocellulært karsinom
ISH data for HSA-MIR-93 helt overlappet de QRT-PCR resultater:. en intens farging ble påvist i primær colonic adenokarsinomer og levermetastaser. Indusert over-uttrykk for HSA-MIR-93 ble vist: å være tumorigent in vitro og in vivo, for å fremme overlevelse, men ikke spredning, og for å forbedre neoangiogenesis [87]. Videre økte HSA MIR-93 nivåer korrelerer til progresjon og redusert pasienter overlevelse i serøs eggstokk-karsinom [88] og kan forutsi tilbakefall av brystkreft [89].
Imidlertid er den eneste oppregulert validert mikroRNA identifisert i vår signatur som kan diskriminere mellom colonic levermetastaser og primær leverkreft var HSA-MIR-103. Relevansen av denne miRNA i kreft har blitt vurdert i bukspyttkjertelen, blære, spiserør, mage og brystsvulster [29], [90] – [93]. Høye nivåer av HSA-MIR-103 ble korrelert til dårlig overlevelse i kreftfaren og er knyttet til metastatisk sykdom i bryst og magekreft. Spesielt ble HSA-MIR-103 oppregulering påvist i magekreftpasienter som bærer positive lymfeknuter. Tilsvarende i vår studie, QRT-PCR oppdaget HSA-MIR-103 over-uttrykk i primære svulster samt metastatisk noder og leveren. Igjen, ISH ga oss mer spesifikk celle-of-opprinnelse informasjon: mens det var ingen signifikante forskjeller mellom primærsvulster og positive lymfeknuter, levermetastaser viste de høyeste nivåene av HSA-Mir-103 uttrykk
I. vår studie, men ikke validert av QRT-PCR, HSA-MIR-200c var en av de valgte mikroRNA av microarray og kort plattformer. Nylig, HSA-MIR-103/107 nivåer ble funnet inverst korrelert til HSA-MIR-200c i reguleringen av epithelial-til-Mesenchimal Overgang i brystkreft [25]. For å teste om vi kunne etablere den samme korrelasjonen i tykktarmskreft, utførte vi ISH for tykktarms TMA med MIR-200c sonde. Vi observerte ikke noen invers korrelasjon mellom de to miRNAs. De var begge over-uttrykk, men, HSA-MIR-200c ble sterkt oppregulert i lymfe nodal metastaser i forhold til normal tykktarm, adenokarsinomer og lever tilbakefall. Dette tyder på at HSA-MIR-103 og HSA-MIR-200c ikke kontrollerer EMT i tykktarmskreft, og at høye nivåer av HSA-MIR-200c er nødvendig for nodal invasjon.
Hsa-MIR-200c leveren metastase ISH skårer viste høy variabilitet, som dekker de gjennomsnittlige verdiene av normalt vev, adenokarsinomer, og positive lymfeknuter. Nedregulering av HSA-MIR-200c har blitt foreslått som en karakteristisk signatur for primær leverkreft (leverkreft, intrahepatisk kolangiokarsinom og hepatisk angiosarkom) fra levermetastaser av epitelisk opprinnelse [86], [94], mens dens oppregulering i colon adenokarsinom har vært forbundet til en dårlig prognose [95]. I vår studie ble HSA-MIR-200c oppregulering i nodal metastaser bekreftet av ISH, men ble ikke godkjent av QRT-PCR. Dette funnet skyldes i hovedsak eksperimentelle og tekniske prosedyrer. Først brukte vi ulike grupper av pasienter for validering, som, selv om den gir mer pålitelig slutten data, innført mer variasjon i den eksperimentelle prosedyren. For det andre, RNA som kommer fra våre første mikromatriser pasientgruppen, ble ikke hentet fra microdissected parafin innebygd vev og inneholdt varierende andeler av kreft og godartet omkringliggende vev, mens RNA og vev analysert i QRT-PCR og ISH ble vev microdissected kjerner med en stor kreft komponent. Imidlertid QRT-PCR kan ikke skille fra benigne og /eller ikke-kreftceller, mens ISH kan diskriminere mellom de forskjellige typer celler. Andre forfattere validert sine data på de samme pasienter, og RNA ble ekstrahert fra hele vevet. Videre til det beste av vår kunnskap, i litteraturen er det ingen studie rapporterer en så stor skala av mikroRNA ISH. Vi har vist at ISH kan gi svært nyttig celle spesifikk informasjon, som tyder på ytterligere microRNAs
in vivo
funksjoner for nærmere undersøkelser.
En viktig nyhet fra vår signatur var HSA-MIR-566. Tilsynelatende nedregulert bare i adenokarsinomer i forhold til kontroller og metastatiske colonic vev ved QRT-PCR, HSA-MIR-566 digoxigenin merket probe, ble svakt detektert i positive lymfeknuter kreftceller, og like uttrykt i normal colon, så vel som adenokarsinomer og levermetastaser, støtter forestillingen om at ISH kan gi oss mer informative detaljer enn mikromatriser eller QRT-PCR. Dessverre, i litteraturen, er det ingen undersøkelse rapporterer HSA-MIR-566 involvert i kreft, eller som beskriver dets biologiske funksjoner, som kan hjelpe omtalen av våre data.
