Abstract
MUC1 protein er abnormt uttrykkes på mange solide tumor kreft. I motsetning til den apikale gruppering på friske epitelceller, blir det jevnt fordelt over kreftceller. Imidlertid har en mekanistisk kobling mellom avvikende uttrykk og kreft vært unnvikende. Heri rapporterer vi at en membran-bundet MUC1 spaltningsprodukt, som vi kaller MUC1 *, er den dominerende formen av proteinet på dyrkede kreftceller, og i cancervev. Videre, viser vi at transfeksjon av en minimal fragment av MUC1, MUC1 *
1110, inneholdende kun førtifem (45) aminosyrer av det ekstracellulære domene, er tilstrekkelig til å gi de onkogene aktiviteter som tidligere var knyttet til den fulle -Lengde protein. Ved sammenligning av molekylvekt og funksjon, ser det ut til at MUC1 * og MUC1 *
1110 er tilnærmet ekvivalente. Bevis er presentert som sterkt understøtter en mekanisme hvorved dimerisering av det ekstracellulære domene av MUC1 * aktiverer MAP kinase signaleringskaskade og stimulerer cellevekst. Disse funnene tyder på metoder for å manipulere denne veksten mekanisme for terapeutiske intervensjoner i kreftbehandling
Citation. Mahanta S, Fessler SP, Park J, Bamdad C (2008) En Minimal Fragment av MUC1 som megler veksten av kreftceller. PLoS ONE 3 (4): e2054. doi: 10,1371 /journal.pone.0002054
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 17. desember, 2007; Godkjent: 13 mars 2008; Publisert: 30 april 2008
Copyright: © 2008 Mahanta et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Alle forfatterne er ansatt i et biotech selskap og delta i et opsjonsprogram
Innledning
MUC1 er en type. i membran glykoprotein av mucin familie å ha et utstrakt ekstracellulært domene som består av flere hundre tandem gjentatte enheter, et enkelt transmembrandomene og et C-terminalt cytoplasmatisk hale [1] – [5]. MUC1 normalt uttrykt på den apikale grensen av sunn epitel som linje luftveiene, reproduktive og gastrointestinale traktater. I skarp kontrast til den sunne mønsteret av ekspresjon som begrenser MUC1 til luminale flater, cancervev viser en avvikende ekspresjon mønster, karakterisert ved MUC1 er jevnt fordelt over hele vevsoverflaten [6], [7]. Det er foreløpig anslått at 75% av alle menneskelige solide svulster kreft abnormt uttrykke MUC1 protein [8].
Funksjonen MUC1 i sunn tilstand er fortsatt uklart, mens bevisene er raskt akkumulere for sin rolle som et oncoprotein . Innføringen av MUC1 til tidligere MUC1-negative celler resulterer i en økt veksthastighet [9], gjør det mulig for forankringsuavhengig cellevekst [10] og gjør celler motstandsdyktige til apoptose indusert ved behandling med standard kjemoterapeutiske midler [8]. Interaksjoner mellom MUC1 og medlemmer av ErbB-familien har blitt rapportert [11], [12]. MUC1 er involvert i flere intracellulære signalveier. Disse studier har fokusert på MUC1 den cytoplasmiske hale (MUC1-CT), som er kanskje best karakteriserte del av proteinet [13]. Den 72 aminosyre halen bærer rester som kan fosforyleres av Zap70, PCKδ, GSK3p, ErbB1, c-Src, Lyn, og Lek. I tillegg har signaloverføringselementer AP-2, p53, ER-α, β-catenin og GRB2 blitt vist å binde til MUC1-CT, antagelig som en funksjon av dets fosforylering tilstand. Faktisk har studier implisere fosforyleringen av MUC1-CT i aktivering av MAP-kinase signalveien [12]. I et slikt studium [14], antistoff stimulering av det ekstracellulære domene av et kimært protein bestående av de ekstracellulære og transmembrane partier av CD8, men den cytoplasmiske hale av MUC1, resulterte i fosforylering av ERK 1/2. ERK-aktivering ble vist å være avhengig av fosforylering av MUC1-CT og kan bli avskaffet av en dominant negativ Ras mutant eller en MEK hemmer, og dermed hevder at MUC1-CT formidler GRB2-SOS-Ras-MEK-ERK signal kaskade som fører til celledeling.
studier av MUC1 ekstracellulære domenet (ECD) er komplisert ved dens skjær størrelse (150-300 kDa), det faktum at den er høyt glykosylert, og at det består av et variabelt antall tandem repetisjoner. I tillegg til proteinet kan spaltes, deretter fra celleoverflaten. Skur MUC1, som består i hovedsak av tandemrepetisjoner, kan påvises i serum fra trinn II brystkreftpasienter [15]. Tilsvarende western blot av lysatene av MUC1-positive dyrkede cancerceller viser to MUC1 art: a høymolekylære typer (150-300 kDa) som reagerer med antistoffer som binder seg til de tandemrepetisjoner og en lav molekylvektforbindelse (20-35 kDa) som reagerer med antistoffer som bindes til den cytoplasmiske hale. Cellesupernatanter inneholder bare de molekylvekt MUC1 art høye. Noen studier gir holdepunkter for at MUC1 selv kløyver via en SEA domene innenfor protein [16], [17]. Andre har presentert bevis for at TACE (ADAM 17) og MMP14 (MT1-MMP) kutter MUC1 [18], [19]. Tidlige rapporter postulerte at etter MUC1 cleavage, de frigitte høy molekylvekt del re-forbinder med membranbundne lavmolekylært fragment, og dermed bli den ligand for membranbundne reseptor [20].
Denne rapporten fokuserer på ekspresjon og funksjon av lav molekylvekt MUC1 spaltningsprodukt som forblir membranbundet etter at hoveddelen av den ekstracellulære domenet er blitt spaltet og frigjort fra celleoverflaten.
Resultatene
Karakterisering av en ny MUC1 antistoff
for å undersøke uttrykk mønstre av MUC1 og dets spaltningsprodukt, så vel som deres respektive funksjoner, trengte for å utvikle antistoffer som kan skille den lavmolekylære spaltningsprodukt fra full-lengde protein på intakte celler og prøver vev. Antistoffer som gjenkjenner de tandem gjenta motivene (VU4H5, Santa Cruz) og cytoplasmatiske hale (Ab-5, LabVision) er kommersielt tilgjengelig (Fig. 1a). Imidlertid antistoffer som gjenkjenner det ekstracellulære del av den membranbundne spaltningsprodukt er ikke. For å komplisere saken, er den eksakte stedet (s) som MUC1 spaltes på kreftceller uklart. Flere spaltningsseter for MUC1 er rapportert eller postulert [21], [22]. Faktisk er en av de enzymer som spalter MUC1, MMP14, kan spalter dets substrater på flere steder [23]. Imidlertid ville ingen spaltingssete som er blitt rapportert eller foreslått å produsere et membranbundet fragment med et ekstracellulært domene kortere enn førtifem (45) aminosyrer. Derfor, hevet vi et antistoff mot førtifem (45) aminosyrepeptid (N-1110-1154-C) som er umiddelbart N-terminalt til det transmembrane domenet (Fig. 1B). Vi tenkte at dette antistoffet vil gjenkjenne membranbundne produkter av alle rapporterte eller foreslått kutteseter. På grunn av usikkerhet om den nøyaktige posisjonen til MUC1 cleavage, her, vi generelt refererer til alle membran forankret MUC1 spaltningsprodukter som MUC1 *. Tilsvarende viser vi til antistoffer reist mot førtifem aminosyre peptid (N-1110-1154-C) som Anti-MUC1 *. Både polyklonale og monoklonale antistoffer ble generert og de i hovedsak utført tilsvarende.
A. Full-lengde MUC1-proteinet består av en cytoplasmatisk hale (CT), et transmembrandomene (TM), en selv-aggregering domene (SAD), og hundrevis av tandemrepetisjoner (TRS). B. Spalting produkt, MUC1 *, består av det cytoplasmatiske hale, transmembrandomene, og i det minste 45 aminosyrer av det ekstracellulære domenet (ECD). Selv om den eksakte området (e) av cleavage fortsatt noe usikkert, så vidt vi vet, ingen cleavage nettsteder har blitt rapportert at forlate mindre enn en 45 aminosyre ECD. Bindingsseter for antistoffer VUH5, Ab-5 og Anti-MUC1 * er merket. C. Western-analyse av helcellelysater av MUC1-positive dyrkede kreftceller, sporene 1-6, blir sammenlignet med MUC1-negative celler, baner 7-9. En 6% gel (øvre) ble utslettet med VU4H5 og en 12% gel (lavere) ble utslettet med Anti-MUC1 *. D. T47D, MUC1-positive dyrkede brystkreft celler ble immunopresipitert med enten Ab-5 eller Anti-MUC1 *. Prøver av hele cellelysatet (WCL), spor 1, eller immunopresipitatene, søyle 2 og 3, ble analysert ved hjelp av western blot. Geler ble probet med enten VU4H5 (øvre) eller Anti-MUC1 (lavere). E. Western analyse av tre MUC1-positiv brystkreft cellelinjer pre- og post- Deglykosylering og utslettet med Anti-MUC1 * viser at den faktiske molekylvekt spaltet MUC1 er ca 16-18 kDa. F. Tabellen oppsummerer reaktivitet av antistoffer mot enten full-lengde MUC1 (Hi MW) eller spaltet MUC1 (Lo MW).
Anti-MUC1 * antistoffer ble preget av western blot, FACS, og immunocytochemistry. Figur 1C viser et western blot som cellelysater fra et panel av MUC1-positive dyrkede kreftceller ble probet med enten VU4H5 (øvre gel) eller Anti-MUC1 (lavere gel). Som forventet, VU4H5 farget med høy molekylvekt MUC1 arter fra alle MUC1-positive celler testet: T47D, ZR-75-1, ZR-75-30, BT474, DU145, og CAPAN 2. Anti-MUC1 * farget en lav molekylvekt 20-35 kDa protein band som syntes å være spesifikke for MUC1. MUC1-negative celler, HCT116, 3Y1, og HEK293, reagerte ikke med enten antistoff. For å bekrefte at de lavmolekylære art som reagerte med anti-MUC1 * var faktisk MUC1, lysater fra MUC1-positive tumorceller ble immunopresipitert med enten Ab-5 (cytoplasmatisk hale-antistoff), eller anti-MUC1 *, deretter analysert ved hjelp av western blot ( fig. 1D). Anti-MUC1 * binder seg til de samme arter med lav molekylvekt som Ab-5 kjenner igjen, noe som bekrefter at anti-MUC1 * binder seg til den lavmolekylære MUC1 spaltningsprodukt.
Som tidligere rapportert, ved western blot-analyse, den høye molekylvekt MUC1 art bare omsettes med antistoffer rettet mot tandemrepetisjoner, og reagerte ikke med anti-MUC1 * eller Ab-5 (data ikke vist). Men begge antistoffene er i stand til å immunoutfelle svakt høymolekylære typer (Fig. 1D, øvre gel). I disse eksperimentene kan immunoutfelling bare ta ned et ikke-kovalent forbundet hetero-dimer av de to cleavage fragmenter. Disse resultatene kan også forklares med det faktum at VU4H5 binder seg til en tandem repeterende enhet som er gjentatt i flere hundre ganger pr reseptor mens Anti-MUC1 * og Ab-5 binder seg til ikke-repeterende sekvenser som forekommer bare en gang per reseptoren. Alternativt kan disse resultatene kan bare forklares ved det faktum at den største arts på kreftceller er det spaltede form, MUC1 *. I tabellen på figur 1 oppsummerer de antistoff-bindingsdata.
For ytterligere å undersøke den faktiske størrelsen av de lavmolekylære MUC1 arter, ble cellelysater deglykosylert før western blot-analyse. Figur 1E viser at etter deglykosylering, konvergerer den tidligere brede 20-35 kDa proteinbånd til et diskret bånd som løper med en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 15-17 kDa. Vi merker oss at den beregnede molekylvekt på et MUC1 cleavage produkt, trunacted etter ca førtifem aminosyrer av det ekstracellulære domenet er ca 16 kDa.
Expression Mønstre av MUC1 og dens Cleavage Product, MUC1 *, på Cultured celler og på cancervev
Dyrkede kreftceller ble analysert ved immun cytochemistry å bestemme uttrykket mønster av MUC1 og dens spalting produkt MUC1 *. MUC1-positiv brystkreft celler ble farget med dobbel VU4H5 som binder seg til tandem gjentar enheter i høy vekt fragmentet molekyl og anti-MUC1 * som binder seg til lav molekylvekt, membranbundet spaltningsprodukt, MUC1 *. Fluoriserende bilde avslørte at MUC1 * er den dominerende form for protein på dyrkede kreftceller, og er jevnt fordelt over hele celleoverflaten. I motsetning til dette, proteiner som ble farget ved VU4H5 ble enten ikke til stede i det hele tatt eller ble de mindre artene (figur 2A). VU4H5 farging kunne tyde på at proteinet på overflaten er i full-lengde MUC1, eller at det er en ikke-kovalent bundet hetero-dimer bestående av både spaltningsprodukter. Spesielt, er mønsteret av uttrykk av full-lengde MUC1 gruppert på ett eller to punkter på celleoverflaten, som minner om tendensen av MUC1 på sunn epitel å klynge på den apikale grensen.
A. Fluoriserende avbildning av dyrkede brystkreft celler viser at spaltningsproduktet MUC1 (rød) er den fremherskende sort og er jevnt fordelt over hele celleoverflaten. Full-lengde MUC1 (grønn) er den mindreårige arter, og er gruppert. Celler ble dobbelt farget med anti-MUC1 (rød) som binder seg til en epitop inne i membranen proksimale første 45 aminosyrer av det ekstracellulære domene og VU4H5 (grønn) som binder seg til en epitop innenfor tandem gjentagelse domenet av full-lengde proteinet . VÆRE. Par av sammenhengende deler av menneskelige vevsprøver fra ubehandlede pasienter ble farget med enten Anti-MUC1 * (venstre) eller VU4H5 (til høyre). Bilder ble fotografert på 10 × eller 100 × forstørrelse. B. Et tverrsnitt av en ikke-kreft egglederen viser MUC1 * overflate farging ved luminal kanten (nederst til venstre). Full-lengde MUC1 er cytoplasma (nederst til høyre). C. brystkreft vevsprøver. D. Lungekreft prøver. E. Colon kreft prøver. Piler peker på de involverte delene av kreftvev hvor alle mobil arkitektur har gått tapt og vev er ikke farget av VU4H5.
neste sett på uttrykket mønster av full-lengde MUC1 versus MUC1 * sunne og kreft menneskelige vevsprøver fra ubehandlede pasienter. Seriesnitt av en ikke-kreft egglederen ble farget med enten Anti-MUC1 * eller VU4H5. Begge MUC1 antistoffer farget luminal overflaten av egglederen, men ikke de omkringliggende vev (Fig. 2B, øvre paneler). 100 gangers forstørrelse viste at det spaltede form, MUC1 *, er utelukkende uttrykkes på
overflate
av de epitelceller som rør, mens den full-lengde MUC1-proteinet ser ut til å være begrenset til cytoplasma (fig. 2B, lavere paneler). Back-to-back deler av kreft bryst, lunge, og tykktarm vev ble likeledes undersøkt med de to antistoffer (fig. 2C-E, henholdsvis). I skarp motsetning til ekspresjonen mønster av MUC1 på friskt vev, som var begrenset til luminal kant, er MUC1 uttrykt over hele overflaten av cancervev. Farging med Anti-MUC1 * viser at, som på dyrkede kreftceller, den viktigste formen for MUC1 på kreftvevet er MUC1 *. Forstørrede Bildene viser at MUC1 * uttrykkes på celle
overflaten
mens full-lengde MUC1 synes å være cytoplasma (fig. C, D, nedre paneler). Spesielt, Anti-MUC1 * produsert tyngre farving enn VU4H5 til tross for det faktum at den tandem gjentagelse antistoffet kan binde seg til hundrevis av epitoper pr reseptoren sammenlignet med enkelt epitop til hvilke Anti-MUC1 * binder. Noen av kreft vev som vi testet ikke flekken positive med enten MUC1 antistoff. Av ni (9) brystkreft prøver testet, bare en var en MUC1-negativ kreft, noe som omtrent tilsvarer publiserte rapporter at ca 90% av alle brystkrefttilfeller er MUC1-positive kreft. Vi merker oss at vevsprøver som ble ansett for å være MUC1-negative kreft viste normal apikale farging med både MUC1 antistoffer i regioner utenfor margin på malignitet (data ikke vist) som bekrefter at analysen er riktig utført, men at disse kreftformene ikke var preget av avvikende uttrykk for MUC1.
Viktigere, la vi merke til at noen vevsprøver farget positivt for tilstedeværelsen av MUC1 * men negativt for full-lengde MUC1. For eksempel ble en tykktarmskreft prøven farget med anti-MUC1 * med den mest intense flekker som forekommer i de syke deler av prøven. I motsetning til dette, VU4H5 lett farget områder nær margen av malignitet, men ikke ga noen farging i de mer syke områder, karakterisert ved tap av cellearkitektur (fig. 2E). Disse resultatene er i overensstemmelse med ideen om at de fleste kreft prøvene kan synes å være MUC1-negativ hvis probet med antistoffer mot full-lengde protein alene. Samlet utgjør disse resultatene viser at de dominerende MUC1 arter på kreftvev, som på dyrkede kreftceller, er de spaltede arter, MUC1 *.
MUC1 * formidler cellevekst
Etter å ha bestemt at store arter på overflaten av kreftceller og vev er MUC1 * og ikke full-lengde protein, bestemte vi oss for å studere vekst egenskapene til spaltet skjema i forhold til uspaltede. MUC1-negative celler, 3Y1 og HCT116, ble transfektert med enten full-lengde MUC1 eller en konstruksjon, MUC1 *
1110, som ekstracellulære domenet ble avsluttet etter førtifem (45) aminosyrer (N-1110-1255-C ) (fig. 1B). Stabile transfektanter viste seg å være utilstrekkelig for å studere fordi de i full lengde transfektanter raskt utviklet seg til en befolkning som domineres av det spaltede form, MUC1 *, har liten eller ingen full-lengde protein tilgjengelig på celleoverflaten (data ikke vist). Av denne grunn ble enkeltcellekloner ble generert og anvendt i eksperimentene som er beskrevet i den foreliggende undersøkelsen. FACS, immunocytokjemi og Western blot-analyse viste at enkelt- celle kloner av full lengde MUC1 produsert full-lengde protein, men også genereres spaltningsproduktet MUC1 * (fig. S1).
A klonogene analyse ble utført for å vurdere vekst på MUC1 *
1110 versus full lengde MUC1 som hadde blitt transfektert inn i rotte fibroblast 3Y1 celler. Celler belagt ved lav tetthet ble tillatt å vokse i ni (9) dager. Resulterende kolonier ble visualisert ved farging med krystallfiolett. MUC1 *
1110 kloner, 3Y1 MUC1 * 3 og 3Y1 MUC1 * 44, produsert flere, større og tettere kolonier enn full-lengde kloner, 3Y1 MUC1 8 og 3Y1 MUC1 17 (fig. 3A). På slutten av ni dager, MUC1 *
1110 kloner produsert fem til ti ganger flere celler enn full-lengde kloner. Forskjellen i vekst ble kvantifisert ved å måle mengden av krystallfiolett som ble frigjort fra cellene på hver plate (figur 3A.: Søylediagram). Men økningen i antallet celler som kunne ha vært på grunn av en økning i overlevelsen eller en økning i veksthastighet. Celleoverlevelsesfaktorer kan identifiseres ved deres evne til å gjengi celler resistente overfor kjemoterapi-indusert død. Enkeltcellekloner av MUC1 eller MUC1 *
1110 som hadde blitt transfektert inn i MUC1-negative celler (3Y1 eller HCT116) ble behandlet med AraC, cisplatin eller etoposid, analyseres deretter for å måle mengden av celledød. Celler transfektert med enten full-lengde MUC1 eller MUC1 *
1110 ble resistente mot apoptose indusert av disse kjemoterapi agenter. Et representativt forsøk er vist i figur 3B. Disse resultatene hevder at MUC1 eller MUC1 * økning celle overlevelse. For å avgjøre om de også øke cellevekst, ble en cellesyklus analyse eksperiment utført. FACS ble anvendt for å måle antall celler i G2 /M fase (en indikator på celledeling) sammenlignet med antallet i G1 fase. Forholdet mellom celler i G2: G1 ble målt for HCT116-celler transfektert med enten full-lengde MUC1 eller MUC1 *
1110 (figur 3C.). Innføringen av enten MUC1 *
1110 eller full-lengde MUC1 drev flere celler i G2 /M fasen enn kontrollen transfeksjon av den tomme vektoren. Imidlertid transfeksjon MUC1 *
1110 øket den forholdet mellom G2:G1 mer enn transfeksjon av full-lengde proetin. Huske at selv om cellene er transfektert med full-lengde protein, blir en betydelig mengde proteolyserte til MUC1 * form.
A. En klonogene Analysen ble utført på enkelt celle kloner av MUC1-negative 3Y1 celler som hadde blitt transfektert med enten en tom vektor, full-lengde MUC1 eller MUC1 *
1110. Et fotografi av petriskåler inneholdende celler platet med 1000 celler pr 100 mm, dyrket i 9 dager, deretter farget med krystallfiolett. Bar grafen kvantifiserer vekst av hver klone. Krystallfiolett absorbert av cellene på hver plate ble sluppet, og absorbans ved 590 nm ble målt på et spektrofotometer. Absorpsjon målinger ble normalisert til mengden av krystallfiolett frigjøres fra den tomme vektoren klonen. Nomenklatur for våre enkelt celle kloner er «modercellen navn /konstruksjon /klone #». B. Resistens mot celledød indusert av kjemoterapi narkotika AraC testes i én celle kloner av enten tom vektor, full-lengde MUC1 eller MUC1 * transfekterte inn 3Y1 celler. C. Cellesyklus analyse ble utført på enten tom vektor, full-lengde MUC1 eller MUC1 * transfektert inn MUC1-negative cellelinje HCT116. Forholdet mellom prosentandelen av celler i G2 til G1 fase er plottet som en funksjon av serumkonsentrasjon. Forholdet mellom% G2:% G1 for de tomme vektor transfektanter har blitt normalisert til 1. D. Veksten av MUC1-positiv brystkreft celler, ZR-75-30, blir stimulert ved tilsetning av toverdig (bv) Anti-MUC1 * og inhiberes ved tilsetning av de monovalente (MV) Fab. Tilsetningen av bivalent antistoff som frembringer den klokkeformede vekstkurve som er karakteristisk for reseptor-dimerisering. Veksten av MUC1-negative HEK 293 celler ble ikke påvirket av enten den toverdige eller mono Anti-MUC1 *. E. Stimulering av vekst ved tilsetning av toverdige Anti-MUC1 * blir testet ved hjelp av stabilt transfekterte siRNA for å undertrykke MUC1 ekspresjon i brystkreftcellelinje T47D. Bivalent Anti-MUC1 stimulerte veksten i celler transfektert med kontroll siRNA, men ikke signifikant effekt vekst i MUC1 undertrykte celler. Western blot-analyse (innsats) viser at MUC1 siRNA trykkes MUC1-ekspresjon ved omtrent 90%. F. MUC1-positive brystkreftceller, T47Ds, blir behandlet enten med bivalent Anti-MUC1 * eller monvalent Fab, deretter analysert ved hjelp av Western for tilstedeværelsen av fosforylert ERK1 /2. Blotter viser induksjon av ERK2 fosforylering av bivalent Anti-MUC1 * og hemming av basal ERK1 /2 fosforylering etter to dager (2 d) behandling med mono Fab.
Dermed har etablert en kobling mellom MUC1 * og vekst, spekulert vi at det kan fungere som en vekstfaktor-reseptor. Uten en kjent ligand for MUC1 eller MUC1 *, ville det være vanskelig å teste hypotesen. Imidlertid Klasse I vekstfaktorreseptorer utløse cellevekst gjennom dimerisering av det ekstracellulære domene av reseptoren. Vi har et bivalent antistoff mot MUC1 *
1110-ECD (ekstracellulært domene) parti, som kan brukes til å simulere sin ligand. Andre har tidligere rapportert at stimuleringen av denne klassen av vekstfaktorreseptorer med dimerisering antistoffer generert klokkeformede vekstkurver [24] – [26]. Dette er fordi cellevekst øker med økende antistoffkonsentrasjon inntil maksimal vekst oppnås når man antistoff dimerizes hver to reseptorer. Imidlertid, når konsentrasjonen av antistoff går til overmål, binder hvert antistoff til en reseptor, slik at ingen dimerisering forekommer, og cellevekst faller av. Vi utførte lignende eksperimenter ved å behandle MUC1-positive kreftceller samt MUC1 og MUC1 *
1110 transfekterte celler med Anti-MUC1 *. Som en negativ kontroll, behandlet vi cellene med de monovalente Fab of Anti-MUC1 *, noe som ikke ville være i stand til å dimerisere reseptorene. For hver MUC1-positive eller MUC1 *
1110-positive cellelinje som vi testet, den toverdige antistoff-stimulert cellevekst og produserte det forventede klokkeformet vekstkurve. I sterk kontrast til de monovalente Fab ikke bare ikke stimulere cellevekst, men det induserte celledød. Resultatene av et slikt eksperiment er vist i figur 3D, hvor veksten av MUC1-positiv brystkreft celler, ZR-75-30s, blir stimulert av Anti-MUC1 * og hemmet av den monovalente Fab. MUC1-negative HEK293-celler er upåvirket av enten antistoffet. Kontrollantistoffer, enten toverdig eller enverdig, hadde ingen effekt på veksten av MUC1-positive tumorcellevekst (fig. S2). For å bekrefte at antistoff-stimulering av cellevekst ble spesielt formidlet av MUC1 ble forsøkene gjentas med MUC1-positiv brystkreft celler, T47Ds, som hadde blitt stabilt transfektert med siRNA til knockdown MUC1 uttrykk. T47D cellevekst stimuleres ved tilsetning av toverdige Anti-MUC1 * og den karakteristiske klokkeformet vekstkurve blir fremstilt. Men i celler hvor MUC1 ekspresjon er blitt undertrykt av minst 90%, antistoffet ikke har noen stimulerende effekt (fig. 3E). Til slutt, viste forsøkene at stimulering av MUC1-positive celler med bivalent Anti-MUC1 * indusert fosforylering av ERK1 /2. I motsetning til de monovalente Fab-fragmentet av Anti-MUC1 * trykkes basalnivåer av fosforylert ERK1 /2 (fig. 3F). Fosforyleringen av ERK1 /2 er et nøkkeltrinn i aktivering av MAP-kinase signalkaskade. Samlet utgjør disse resultatene er i overensstemmelse med ideen om at MUC1 * er en vekstfaktor reseptor eller co-reseptor som medierer cellevekst via dimerization av ekstracellulære domene, hvorpå MAP kinase signalveien er aktivert.
MUC1 * aktiverende ligander
Hvis MUC1 eller MUC1 * fungerer som en vekstfaktor-reseptor som aktiveres ved dimerisering av det ekstracellulære domene, så følger det at MUC1-positive cancerceller kan utskille en dimerisering ligand (er). Vi har konstruert en nanopartikkel eksperiment for å screene kreftcellelysatene og supernatanter for tilstedeværelsen av denne ligand. MUC1 *
1110-ECD peptider (N-1110-1054-C.: Se figur 1B) ble festet til gull nanopartikler via en C-terminal histidin-tag og lysat /supernatantprøver ble det tilsatt [27]. Hvis en dimerisering ligand var til stede, ville det samtidig binde seg til en første peptid på en første nanopartikkel og et andre peptid med en andre nanopartikler, og dermed forårsaker bulk kryssbinding av nanopartikler og peptider. På grunn av en iboende egenskap av gull nanopartikler, forårsaker tverrbinding en fargeendring fra den karakteristiske rosa til en lilla /blå [28]. Tilsetning av løsningen /supernatanten blandinger til MUC1 *
1110-ECD peptid bærende nanopartikler forårsaket løsningen for å slå lilla /blå. Hastigheten for fargeendring omtrent samsvarer med mengden av MUC1 at hver cellelinje produsert. Ingen fargeforandring resulterte når lysat /overliggende blandinger ble lagt til nanopartikler som bærer en kontroll peptid (fig. 4A).
A. Lysat-supernatant blandinger fra et panel av MUC1-positiv brystkreft celler ble testet for tilstedeværelse av en ligand som er i stand til dimerisering en MUC1 *
1110-ECD peptid (membran-proksimale 45 aminosyrer av det ekstracellulære domene: 1110-1155) . Lysat-supernatant ble inkubert med nanopartikler som bærer enten en kontroll peptid eller et MUC1 *
1110-ECD peptid, histidin-merket i C-terminus. En nanopartikkel løsning fargeendring fra rosa til en lilla /blå indikerer at en art i blandingen har samtidig bundet til to eller flere MUC1 *
1110-ECD peptider. B. Bivalent (bv) Anti-MUC1 (0,77 ug) ble tilsatt til nanopartikler som bærer enten en kontroll peptid (rad A) eller MUC1 *
1110-ECD, peptider (rad B). Antistoff binding til to peptider på separate nanopartikler fører til nanopartikkel aggregering og løsningen fargeendring fra rosa til lilla /blå. I rad A, brønner 3-5, er denne aggregasjon inhiberes ved tilsetning monovalente anti-MUC1 * Fab (mv Fab). C. NM23 på 0,05, 0,1 eller 0,2 um, (Rader A, B og C henholdsvis) er lagt til nanopartikler som bærer MUC1 *
1110-ECD peptider (kolonner 2-5). Lagt NM23 induserer en fargeendring, antagelig som NM23 dimers binde seg til nanopartikkel-immobilisert MUC1 *
1110-ECD peptider. Tilsetningen av monovalente anti-MUC1 (MV Fab), i kolonner 3-5, inhiberer fargeendring. D. Betinget media fra MUC1-positive brystkreftceller, T47Ds og MUC1-negative rotte fibroblaster, 3Y1s, ble blandet med perler som bærer MUC1 *
1110-ECD peptid. Immunoutfelt arter ble deretter analysert ved western, karakterisert ved at gelen ble blottet med et anti-NM23 antistoff. Den vestlige blot viser at T47Ds utsondre NM23 mens 3Y1s ikke. E. overflate-plasmonresonans (SPR) ble brukt til å påvise direkte binding mellom NM23 (15 nM) og MUC1 *
1110-ECD peptider. Den sensogram viser at 1044 jernbaneforetak av NM23, injiseres ved 15 nM, bundet til en overflate som bærer MUC1 *
1110-ECD peptider (heltrukket linje), men ingen NM23 bundet til en kontrollflate bærer et irrelevant peptid (stiplet linje). F. Stimulering av T47D brystcancer-cellevekst ved NM23 er avhengig av MUC1 uttrykk. Eksogent NM23 tilsatt til T47D brystkreftceller stimulerer vekst og frembringer klokkeformet kurve som indikerer reseptor-dimerisering. Vekst er sterkt redusert i celler som stabilt uttrykker MUC1-spesifikke siRNA, sammenlignet med celler som uttrykker en kontroll siRNA. Western blot kvantifiserer siRNA undertrykkelse av MUC1.
For å identifisere hva som syntes å være en MUC1 * ligand (s), perler bærer MUC1 *
1110-ECD peptider ble brukt til å immunpresipitere de ukjente proteiner fra lysat /overliggende blandinger fra MUC1-positive kreftceller. Eluatene ble separert ved SDS-PAGE og visualisert ved hjelp av sølvfargemetoder. Det var egentlig bare to band som ble fremskyndet av MUC1 *
1110-ECD peptid og ikke utløst av en kontroll peptid: en prominent 23 kDa band og en svakere 17 kDa band (fig S3.). Proteinbåndene ble skåret ut fra gelen og analysert ved hjelp av N-terminal mikrosekvensering, som identifisert dem som NM23, isoformer H1 og H2 henholdsvis. NM23 normalt finnes i cytoplasma i alle celler, men er ofte utskilt av cancerceller [29] som indikerer at det kan være en ligand for den ekstracellulære del av MUC1 *. Cellesupernatanter ble immunopresipitert med MUC1 *
1110-ECD peptider knyttet til perler, deretter analysert ved western blot. Supernatantene fra MUC1-positive cancerceller, men ikke kontrollcellene, genereres en sterk proteinbånd på omtrent 23 kDa som reagerte med anti-NM23H1 (Fig. 4B). Dette bekreftet at proteiner i kreft cellesupernatanter som ble immunoutfelt med MUC1 *
1110-ECD peptider var faktisk NM23.
For å oppdage direkte binding mellom NM23 og MUC1 *
1110-ECD peptider og å bekrefte spesifisitet, ble en annen nanopartikkel eksperiment utført. Rekombinant humant NM23 ble lagt inn i MUC1 *
1110-ECD-peptid bærende nanopartikler eller nanopartikler som bærer en kontroll peptid. Tilsetting av NM23 til nanopartikler som bærer MUC1 *
1110-ecd, forårsaket en løsning fargeendring fra rosa til lilla /blå og graden av fargeendring var en funksjon NM23 konsentrasjon. Monovalent Fab av Anti-MUC1 * kompetitivt hemmet binding mellom partikkel-immobilisert MUC1 * peptider og NM23 (fig. 4C). For ytterligere å demonstrere spesifisiteten av nanopartikkel assay selv, ble bivalent Anti-MUC1 tilsatt til MUC1 *
1110-ECD-peptid Bærende nanopartikler, noe som forventet resulterte i rosa til blå fargeendring. Det binding ble også kompetitivt inhibert av de monovalente Fab (fig. 4D).
