Abstract
Synthetic triterpenoid metyl-2-cyano-3, 12-dioxooleana-1, 9 (11) -dien-28-oat (CDDO-Me) har vist seg som et lovende middel mot ovarial kreft. Imidlertid er den underliggende mekanisme ikke fullt ut forstått. Her viser vi at CDDO-Me samhandler direkte med HSP90 i cellene ved cellular termisk skift analysen. CDDO-Me behandling fører til oppregulering av Hsp70 og nedbrytning av HSP90 klienter (ErbB2 og Akt), noe som indikerer hemming av HSP90 av CDDO-Me i celler. Knockdown av HSP90 hemmer betydelig celleproliferasjon og forbedrer anti-spredning effekten av CDDO-Me i H08910 eggstokkreft celler. Ditiotreitol hemmer samspillet av CDDO-Me med HSP90 i cellene og opphever CDDO-Me indusert oppregulering av Hsp70, nedbrytning av Akt og hemming celleproliferasjon. Dette tyder på at anti-ovarian cancer effekt av CDDO-Me er muligens mediert av dannelse av Michael-addukter mellom CDDO-Me og reaktive nukleofiler på HSP90. Denne studien identifiserer HSP90 som en roman mål protein av CDDO-Me, og gir en ny innsikt i virkningsmekanismen til CDDO-Me i eggstokkreft celler
Citation. Qin DJ, Tang CX, Yang L, Lei H, Wei W, Wang YY, et al. (2015) HSP90 er en roman Target molekyl av CDDO-Me i å hemme spredning av eggstokkreft celler. PLoS ONE 10 (7): e0132337. doi: 10,1371 /journal.pone.0132337
Redaktør: L. Michel Espinoza-Fonseca, University of Minnesota, USA
mottatt: 9 mai 2015; Godkjent: 12 juni 2015; Publisert: 02.07.2015
Copyright: © 2015 Qin et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. (. NO 2015CB910403, 2013CB910903) Nasjonal Basic Research Program of China (973 Program), National Natural Science Foundation of China (91313303, 31100980, 81272886) Science and Technology Committee of Shanghai (11JC1406500, 13431900501, 13ZR1456900)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall fra gynekologisk kreft. Til tross for store fremskritt i kjemoterapi og kirurgisk behandling, 70 til 90% av kvinner med eggstokkreft vil presentere en komplett respons etter første behandling og utvikle tilbakefall innen 2 år og 5-års overlevelse for pasienter med fremskreden kreft i eggstokkene fortsatt på ca 30% [1]. I USA anslått 22, ble 000 nye tilfeller av eggstokkreft spådd å bli diagnostisert på 2014 som resulterer i ~ 14 000 dødsfall forbundet med denne sykdommen [2]. Derfor, for å forbedre resultatene for kvinner med avansert eggstokkreft, en betydelig innsats har vært viet til å identifisere protein målrettede midler [3].
Heat shock protein 90 (HSP90) er en svært evolusjonært konservert anstand protein og er den mest godt studert medlem av varmesjokkproteinfamilie. Som en ATP-avhengig molekylære anstand, spiller HSP90 en kritisk rolle i modningen, stabilitet, og aktivering av et antall forskjellige klient proteiner. Selv om rikelig uttrykt i normale celler, dets overekspresjon i ondartede celler fremmer vedvarende aktivering av mange cellulære kinaser og transkripsjonsfaktorer fra malignitet-indusert cellespenninger [4]. Interessant nok mange klienter eller interactors av HSP90, så som epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), human epidermal vekstfaktor-reseptor 2 (ErbB2), pattedyr-målet for rapamycin (mTOR) og signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3), måtte vært innblandet i patogenesen av eggstokkreft celler [5-7] og forhøyet HSP90 nivå er vanlig i peritoneal og plevravæske av pasienter med avansert stadium eggstokkreft celler [8]. HSP90 har vært ansett som et attraktivt mål for kreft i eggstokkene [9-10].
C-28 metylesteren av 2-cyano-3, 12-dioxoolen-1, 9-dien-28-syre ( CDDO-Me) er en roman syntetisk oleanane triterpenoid. CDDO-Me er i sent stadium klinisk utvikling for behandling av kronisk nyresykdom [11-13] og i fase I /II kliniske studier for ondartede sykdommer [14-15]. CDDO-Me oppviser cytotoksisitet mot en rekke kreftceller inkludert eggstokk-kreft [16-17], prostatakreft [18] leukemi [19], brystkreft [20], lungecancer [21], bukspyttkjertelkreft [22-23] uten åpenbarer noen toksisitet i normale celler. De mekanistiske studier har avdekket at CDDO-Me er en multitarget sammensatte. Interessant, noen proteiner som er berørt av CDDO-Me som ErbB2, Akt, STAT3 og mTOR [17] er kunder av HSP90. Derfor spekulerte vi at HSP90 kan være ett mål av CDDO-Me, som bidrar til de ulike aktivitetene til CDDO-Me.
I denne studien har vi vist at HSP90 er en roman mål protein av CDDO-Me i eggstokkreft celler, noe som bidrar til den anti-kreft effekt av CDDO-Me i eggstokkreft celler.
Materialer og metoder
Cell kultur
den menneskelige epitelceller eggstokkreft celler SKOV3 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). HO8910 cellelinjen ble hentet fra Shanghai Cell Culture Collection (Shanghai, Kina). HO8910-cellelinjen ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco, Foster City, CA) tilsatt 10% (w /v) føtalt bovint serum (FBS; Gibco) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco). SKOV3-cellelinjen ble dyrket i McCoys 5A (Gibco, Foster City, CA) tilsatt 10% (w /v) føtalt bovint serum (FBS; Gibco) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco). Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2.
Western blotting
Cellene ble vasket med PBS og lysert med lyseringsbuffer (50 mM Tris -HCI, pH 6,8, 100 mM DTT, 2% SDS, 10% glycerol). Cellelysatene ble sentrifugert ved 20,000g i 10 minutter, og proteinene i supernatanten ble kvantifisert. Proteinekstrakter ble likt lastet til 8% til 12% SDS-polyakrylamidgel, elektroforese og overført til nitrocellulosemembran (Bio-Rad). Blottene ble farget med 0,2% Ponceau S rødt for å sikre lik protein lasting. Etter blokking med 5% fettfri melk i PBS ble membranene analysert med antistoffer mot HSP90 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), Hsp70 (Santa Cruz Biotech), vinculin (Santa Cruz Biotech), Akt (Santa Cruz Biotech), ErbB2 (Cell Signaling, Beverly, MA), Erk (Cell Signaling), fosforylert Erk (Cell Signaling). Signalene ble oppdaget med en chemiluminescence phototope-HRP kit (Cell Signaling) i henhold til produsentens instruksjoner. Om nødvendig blotter ble strippet og reprobed med anti-β-actin antistoff som intern kontroll. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger med samme resultat.
Cellular Thermal Shift-analyse (CETSA)
PBS fortynnet HO8910 cellesuspensjoner ble fryse tint tre ganger med flytende nitrogen. Den oppløselige fraksjon (lysat) ble separert fra celleavfallet ved sentrifugering ved 20 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Cellelysatene ble fortynnet med PBS og delt i to porsjoner, og en aliquot ble behandlet med DMSO, og den andre delmengde med CDDO-Me (25 uM). Etter 10-30 minutters inkubering ved romtemperatur, de respektive lysater ble delt opp i mindre porsjoner (30 ul) og oppvarmet individuelt ved forskjellige temperaturer i 3 min (Veriti thermal cycler, Applied Biosystems /Life Technologies) etterfulgt av avkjøling i 3 minutter ved romtemperatur . De riktige temperaturer ble bestemt i preliminære CETSA eksperimenter (data ikke vist). De oppvarmede Lysatene ble sentrifugert ved 20 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C for å skille de løselige fraksjoner fra bunnfall. Supernatantene ble overført til nye mikrorør og analysert ved hjelp av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) etterfulgt av western blot analyse. Dose effekten av CDDO-Me på stabiliteten av HSP90 ble evaluert på samme måte.
For å undersøke effekten av DTT på binding av CDDO-Me til HSP90 i levende celler, ble HO-8910 celler behandlet med DMSO, DTT (2 mM), CDDO-Me (25 uM), eller CDDO-Me (25 uM) preinkubert med DTT (2 mM, 30 min) i 3 timer. Deretter ble cellene høstet og fortynnet i PBS supplert med fullstendig protease inhibitor cocktail og oppvarmet ved 63 ° C i 3 minutter, etterfulgt av avkjøling ved romtemperatur i ytterligere 3 min. Cellesuspensjonene ble fryse-tint to ganger med flytende nitrogen. Lysatene ble sentrifugert ved 20 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C for å skille de løselige fraksjoner fra bunnfall. Supernatantene ble overført til nye mikrorør og analysert ved hjelp av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) etterfulgt av western blot-analyse.
RNA interferens og Transfeksjon
korte interfererende RNA (siRNA) som målretter human HSP90 ble syntetisert ved Biomics Bioteknologi, Jiangsu, Kina. Målrettingsnavnene sekvensene er som følger, 5′-GUAUUGUCACAAGCACAUAdTdT-3 «og 5′-CGUCUCGCAUGGAAGAAGU-3». Universal negativ kontroll siRNA (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3 «) ble anvendt som en kontroll. HO-8910-celler ble sådd ut (3 x 10
5 celler /1500 ul /brønn av en 6-brønn plate) og deretter blandet med lipofektamin-RNA-kompleks-løsning [100 nM RNA, 5 ul lipo2000, 500 ul opti- MEM /brønn], i henhold til produsentens anbefaling. Førtiåtte timer etter transfeksjon av sirnas, ble cellene utsatt for immunblotting assay eller andre eksperimenter.
Cell Proliferation Assay
HO-8910 eller SKOV3-celler ble behandlet med CDDO-Me alene eller i kombinasjon med DTT. Celleproliferasjon ble bestemt ved hjelp av en celle Counting Kit (Laboratories, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistisk analyse
t-test ble brukt til å evaluere forskjellen mellom to ulike behandlinger . En
p
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
CDDO-Me samhandler med HSP90 i cellene
For å vite om CDDO-Me samvirker med HSP90 i celler, CETSA, en nyutviklet metode for å vurdere medikament-binding til målet protein i celler, ble utført. Eggstokkreft celler HO8910 ble lysert og inkubert med DMSO eller CDDO-Me i en halv time ved romtemperatur. Deretter ble flere prøver av celle-lysat oppvarmet til forskjellige temperaturer. Etter avkjøling ble prøvene sentrifugert for å skille de løselige fraksjoner fra utfelte proteiner og tilstedeværelsen av HSP90 i den løselige fraksjon ble undersøkt ved western blot. Som vist i figur 1A og 1B, sammenlignet med DMSO, nærværet av CDDO-Me betydelig økt akkumulering av HSP90 i den oppløselige fraksjonen ved de temperaturer som ble undersøkt. Vi tester også dose-respons av CDDO-Me on HSP90 stabilitet til oppvarming. Som vist i figur 1C og 1D, med økningen av CDDO-Me-konsentrasjonen, akkumulering av HSP90 markert øket. Som en negativ kontroll, CDDO-Me ikke kunne øke stabiliteten av vinculin i celler. Disse data tyder på at CDDO-Me interagerer direkte med HSP90 i celler.
CETSA ble utført på HO8910 celler som beskrevet i materialer og metoder. Den stabiliseringseffekt av CDDO-Me on HSP90 og vinculin ved forskjellige temperaturer (A) og forskjellige doser (C) ble undersøkt ved western blot. Intensiteten av HSP90 båndene ble kvantifisert ved nummer én programvare (B, D). Hvert eksperiment ble gjentatt som minst tre ganger.
CDDO-Me hemmer HSP90 aktivitet i cellene
En av kjennetegnene til HSP90 hemming er dannelse av Hsp70 og denne responsen har vært brukt som en biomarkør for mange HSP90 inhibitor kliniske studier [24]. Hvis CDDO-Me hemmer HSP90, kan det oppregulere uttrykk for Hsp70. Faktisk fører CDDO-Me behandling til oppregulering av Hsp70 i en dose- og tidsavhengig måte (figur 2A og 2B), som er lik den som er observert i STA-9090, en kjent HSP90-inhibitor, behandlet SKOV3 og HO8910 celler (S1 Fig ). Et annet kjennetegn på HSP90 hemming er nedbrytningen av klienten proteiner [25]. Noen av dem, som ErbB2 har blitt rapportert å være svært følsom for HSP90 hemning, mens andre som Akt er rapportert å være mindre følsomme [26-27]. Vi undersøkte proteinnivået ErbB2 og Akt i CDDO-Me behandlede celler. Ekspresjon av ErbB2 er detekterbar i SKOV3-celler, men ikke i H08910-celler (data ikke vist). CDDO-Me behandling fører til reduksjon av ErbB2-proteinet i en dose- og tidsavhengig måte i SKOV3-celler (figur 2C og 2D). For Akt protein, fører CDDO-Me behandling av reduksjon av Akt i en dose- og tidsavhengig måte i begge HO8910 celler (figur 2A og 2B) og SKOV3-celler (figur 2C og 2D). Disse data tyder på at CDDO-Me hemmer HSP90 aktivitet i eggstokkreft celler.
AD, HO8910 og SKOV3 celler ble behandlet med CDDO-Me på annen dose (A, C) og annen gang (B, D), og de angitte proteiner ble påvist ved western blot. Hvert eksperiment ble gjentatt som minst tre ganger.
knockdown av HSP90 på effekten av CDDO-Me på eggstokkreft celler
For å avgjøre om hemming av HSP90 korrelert med CDDO-Me Induced hemming av celleproliferasjon, brukte vi RNA interferens for å redusere HSP90 uttrykk i HO8910 celler. Som vist i figur 3A, ble HSP90-proteinet spesifikt redusert med HSP90-målretting siRNA (HO8910
siHsp90) sammenlignet med den ikke-spesifikke siRNA (HO8910
sinc). Sammenlignet med vektoren transfekterte celler, knockdown av HSP90 i betydelig grad hemmet cellevekst (figur 3B) og forbedret CDDO-Me indusert hemming proliferasjon (figur 3C) i HO8910 celler. Disse dataene tyder på at HSP90 bidrar til CDDO-Me hemming indusert spredning i eggstokkreft celle.
HO8910 celler ble transfektert med kontroll siRNA (HO8910
sinc) eller HSP90 bestemt siRNA (HO8910
siHsp90), deretter behandlet med eller uten CDDO-Me for angitte tider. De angitte proteiner ble påvist ved western blot og intensiteten av båndene ble kvantifisert ved en mengde programvare (A). Celleformering ble undersøkt ved hjelp av CCK-8-analyse (B, C). Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger.
# p 0,05, sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler
Samspillet av CDDO-Me med HSP90 i eggstokkreft celler ved dets a, p-umettede karbonylgrupper på ringene A og C.
Struktur-aktivitetsanalyser har vist at de a, p-umettede karbonylgrupper på ringene A og C er nøkkelen til aktiviteten av CDDO-Me (figur 4A) [11]. DTT kunne danne reversible addukter med CDDO-Me a, p-umettede karbonylgrupper og oppheve dens aktivitet. For å teste hvorvidt interaksjonen av CDDO-Me med HSP90 i levende celler er avhengig av α, β-umettede karbonyl-gruppen, CDDO-Me (25 uM) preinkubert med eller uten DTT (2 mM) ble brukt til å behandle HO8910 celler, etterfulgt med CETSA eksamen. Faktisk DTT kunne avskaffet stabiliserende effekten av CDDO-Me på HSP90 (fig 4B). I samsvar med dette, DTT behandling fullstendig hemmet CDDO-Me (2 mm) induserte økningen av Hsp70 (fig 4C og 4D) og hemming av celleproliferasjon (Fig 4E og 4F). DTT har blitt mye brukt som antioksidant for å redusere ROS-nivå i celler og CDDO-Me er også blitt vist å øke ROS-nivå i cellene. Dermed kan DTT hemme Hsp70 uttrykk ved å redusere ROS. Men H
2o
2 behandling ikke oppregulere uttrykk for Hsp70 (S2 fig). Disse data tyder på at CDDO-Me kan samhandle med HSP90 gjennom a, p-umettede karbonylgrupper.
A. Kjemisk struktur av CDDO-Me. B. Stue HO8910 celler behandlet med DTT, DMSO, CDDO-Me (25 mm) og CDDO-Me (25 mikrometer) preinkubert med DTT (2 mm), så var underlagt CETSA som beskrevet i materialer og metoder. Stabilitets forandringer av HSP90 ble undersøkt ved western blot (B). HO8910 og SKOV3-celler ble behandlet med CDDO-Me (2 uM) i 24 timer i nærvær eller fravær av DTT (2 mM). De angitte proteiner ble påvist ved Western blot (C, D) og cellelevedyktigheten ble undersøkt ved hjelp av CCK-8-analyse (E, F). Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. * P. 0,05
Diskusjoner
CDDO-Me har vist stor effekt mot en rekke kreftformer, inkludert kreft i eggstokkene. Imidlertid er den underliggende virkningsmekanismen til CDDO-Me on eggstokkreft celler mindre klar. I denne studien viste vi at HSP90 er en roman mål protein av CDDO-Me og målretting HSP90 bidrar til CDDO-Me indusert celledød av eggstokkreft celler.
Intensive studier på virkningen av CDDO-Me har avslørt mange target proteiner inkludert Akt, Nrf2, PTEN, ErbB2, IKKβ, STAT3, mTOR, PPARy et.al [12]. Interessant, noen av dem som ErbB2, STAT3 og Akt er substrater av HSP90, vi derfor postulere at CDDO-Me kan direkte hemme HSP90, som igjen formidler multiple effekten av CDDO-Me. For å teste denne hypotesen, brukte vi CETSA metode for å evaluere samspillet mellom CDDO-Me og HSP90. CETSA benytter konseptet som er rettet mot proteiner vanligvis får stabilisert når stoffet molekyler binder. Sammenlignet med andre metoder for å bekrefte samspillet av små molekyl forbindelser med proteiner, er CETSA mer gjennomførbart å utføre og kan direkte måle om et stoff molekyl nå sine mål i celler og dyremodeller [28-29]. Ved hjelp av denne metoden, viste vi at CDDO-Me samhandler med HSP90 i cellene. Dette ble også støttet ved induksjon av Hsp70, et univers responsen observert i celler ved behandling med HSP90-inhibitorer, spesielt de som er rettet mot den N-terminale ende av HSP90 [30]. Videre klienten proteiner av HSP90, slik som ErbB2 og Akt, kan også reduseres ved å CDDO-Me behandling. Derfor foreslår vi at CDDO-Me samhandler med HSP90 og hemmer aktiviteten i cellene.
Et viktig spørsmål er om samspillet av CDDO-Me med HSP90 bidrar til kreft effekten av CDDO-Me på eggstokkreft celler . I likhet med det som er observert i CDDO-Me behandlet celle, spesielt stanse av HSP90 resultater i induksjon av Hsp70 og nedregulering av Akt i HO8910 celler (figur 3A) [31-32]. Videre knockdown av HSP90 kan betydelig forbedre hemming spredning effekten av CDDO-Me i HO8910 celler. Disse data støtter at målretting HSP90 bidrar anti-eggstokkreft effekten av CDDO-Me. Som CDDO-Me er en kjent flere mål sammensatte, kan vi ikke utelukke at andre target proteiner også bidra til anti-eggstokkreft effekten av CDDO-Me.
CDDO-Me har to α, β- umettet karbonyl-gruppen. Den foreslåtte mekanisme ligger til grunn for anti-kreft effekt av CDDO-Me er ved dannelse av Michael-addukter mellom CDDO-Me og reaktive nukleofiler, for eksempel frie tioler på målproteiner [33]. CDDO-Me kan interagere med HSP90 på en lignende måte, fordi DTT, en -SH-gruppe inneholdende forbindelse, opphever CDDO-Me-indusert stabilisering av HSP90 i respons til oppvarming. Videre CDDO-Me-indusert oppregulering av Hsp70 og reduksjon av Akt kan også bli reversert ved DTT i celler. Som CDDO-Me kunne øke ROS nivået i kreftceller og inhibere ROS blokkerer virkningen av CDDO-Me [23], kan man si at effekten av DTT på Hsp70 kan skyldes dens antioksidantaktivitet. Men økende ROS av H
2o
2 kunne ikke oppregulere uttrykk for Hsp70 (S2 fig). Dermed DTT reverserer mest sannsynlig effekten av CDDO-Me av direkte interaksjon med CDDO-Me. Bindingssetet av CDDO-Me på HSP90 er foreløpig ikke kjent. Det er 6 cysteiner i HSP90 protein. Hvilke cystein (e) bidra til samspill av CDDO-Me med HSP90 garanterer videre etterforskning.
Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som viser at HSP90 er en roman mål protein av CDDO-Me. Målrette HSP90 gir en ny forklaring på flere effekter av CDDO-Me observert i ulike kreftceller. Anvendelsen av CDDO-Me til kreftceller med HSP90 overekspresjon fortjener ytterligere prekliniske og kliniske undersøkelser.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. STA-9090 inhiberer HSP90 funksjon i celler.
HO8910 (A) og SKOV3 (B) celler ble behandlet med STA-9090 til forskjellige tider, og de angitte proteiner ble påvist ved western blot. Hvert eksperiment ble gjentatt som minst tre ganger
doi:. 10,1371 /journal.pone.0132337.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. H
2o
2 aktiverer Erk, men ikke oppregulere Hsp70.
HO8910 (A) og (B) SKOV3-celler ble behandlet med H
2o
2 (10 uM) i forskjellige tidsrom og de angitte proteiner ble påvist ved western blot. Hvert eksperiment ble gjentatt som minst tre ganger
doi:. 10,1371 /journal.pone.0132337.s002 plakater (TIF)
