Abstract
Bakgrunn
Mir-23b ligger på kromosom nummer 9 og spiller ulike roller i ulike organer, spesielt med hensyn til kreftutvikling. Imidlertid har den funksjonelle betydningen av Mir-23b-3p i nyrecellekreft (RCC) ikke blitt rapportert.
Metoder og resultater
Vi målte Mir-23b-3p nivåer på 29 par nyrecellekarsinom og deres normale matchet vev ved hjelp av real-time PCR. Uttrykket nivået av Mir-23b-3p ble korrelert med 5 års overlevelse av nyrekreftpasienter. I 15 tilfeller (52%), ble Mir-23b-3p uttrykk funnet å være høy. Alle pasienter med moderat til lav Mir-23b-3p uttrykk som overlevde 5 år, mens de med høy Mir-23b-3p uttrykk, overlevde bare 50%. Etter banket ned miRNA-23b-3p uttrykk i RCC cellelinjer, var det en induksjon av apoptose og redusert invasive evner. MiR-23b-3p ble vist direkte rettet mot PTEN genet gjennom 3’UTR reporter analyser. Hemming av MIR-23b-3p induserer PTEN genuttrykk med en samtidig reduksjon i PI3-kinase, total Akt og IL-32. Immunhistokjemi viste mangel på PTEN protein uttrykk i kreft regioner av vevsprøver hvor uttrykket av MIR-23b-3p var høy. Vi studerte
in vitro
effekter av kosttilskudd chemo forebyggende middel genistein på Mir-23b-3p uttrykk og funnet ut at det hemmet uttrykk for Mir-23b-3p i RCC cellelinjer.
Konklusjoner
Den aktuelle studien viser at Mir-23b-3p er en onkogen miRNA og hemmer PTEN tumor suppressor genet i RCC. Derfor kan hemming av Mir-23b-3p være et nyttig terapeutisk mål for behandling av nyrecellekreft
Citation. Zaman MS, Thamminana S, Shahryari V, Chiyomaru T, Deng G, Saini S, et al. (2012) Hemming av PTEN Gene Expression av onkogene Mir-23b-3p i nyre kreft. PLoS ONE 7 (11): e50203. doi: 10,1371 /journal.pone.0050203
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 13 august 2012; Godkjent: 17 oktober 2012; Publisert: 26.11.2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne studien ble støttet av VA Merit Review, VA Program Project og NIH Grant RO1CA130860 (PI: R. Dahiya). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mirnas har vist seg å være involvert i ulike nyresykdommer [1]. MIR-23b ligger på kromosom nummer ni i en klynge med MIR-27b og MIR-24-1 [2]. Det har vist seg å spille ulike roller i ulike organer, spesielt med hensyn til kreftutvikling. I kreft som blære og oral squamous cell carcinoma [3] – [4] har det vist seg å være over uttrykt. I nyrekreft Mir-23b-5p fungerer som en potensiell oncomir ved å undertrykke prolin oksidase, som er en ny svulst suppressor protein [5]. Mens det i prostatakreft [6], spiller det en rolle som tumor suppressor mikroRNA den er rettet av onkogene transkripsjonsfaktor c-myc. Dette resulterer til slutt i en økning i protein ekspresjon av det pro-cancer enzym mitokondrie glutaminase, som er et mål for MIR-23b [7]. det har vært vist i brystkreft skal opp reguleres med Mir-27b og MIR-24-1 med oncosuppressor transkripsjonsfaktor ERβ [8]. Tilsvarende, i leverkreft fungerer den som en tumor suppressor ved å målrette den urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) og c-met som resulterer i redusert migrering og proliferasjon av HCC celler [9]. I tykktarmskreft fungerer den i å undertrykke kreft metastase ved å målrette prometastatic gener FZD7 eller MAP3k1 [10].
I denne studien undersøkte vi rollen som MIR-23b-3p i nyre klarcellet karsinom. Vi fant at uttrykket av Mir-23b-3p ble økt i A-498 og Caki-2 cellelinjer og et flertall av vevsprøver. Økt uttrykk også korrelert med lavere overlevelse for nyrecellekreft pasienter. Hemming av MIR-23b-3p uttrykk i A-498 og Caki-2 celler forårsaket en økning i apoptose og en nedgang i invasive egenskaper. PTEN protein ekspresjon ble funnet å være økt etter banket ned MIR-23b-3p i A-498-celler med en samtidig reduksjon i ekspresjonen av PI3-kinase, total Akt og IL-32. PTEN genet ble vist å være et direkte mål for Mir-23b-3p av 3 «luciferaserapportørplasmid analyser. Immunhistokjemi viste mangel på PTEN protein uttrykk i kreft regioner av vevsprøver hvor uttrykket av MIR-23b-3p var høy.
Resultater
Mir-23b-3p er Up regulert i Nedsatt Carcinoma vevsprøver og nyrekreftcellelinjer
for å forstå den kliniske relevansen av Mir-23b i nyrekreft vi målt Mir-23b-3p nivåer i 29 par med menneskelige nyrekreft (alle klarcellet nyrecellekarsinom) og matchet normalt vev ved real-time PCR. I 15 tilfeller (52%), ble Mir-23b-3p funnet økt (T /N [Tumor /Normal] var større enn 1,2). I 5 prøver (17%) uttrykket var moderat (T /N 0,8-1,2). Expression of Mir-23b-3p ble også målt i dyrkede nyrekreft cellelinjer, A-498, ACHN, Caki-1, Caki-2 og ikke ondartede normale HK-2 celler. MIR-23b-3p uttrykk i A-498 celler var omtrent 11x at HK-2 celler mens det av ACHN var 4.1x, Caki-1 4,8x, og Caki-2 5.8x (figur 1).
A) Forholdet mellom T /N-ekspresjon i vevsprøver ble funnet å være høy i et flertall av prøver. B) A-498 og Caki-2 celler hadde høyt uttrykk for Mir-23b-3p sammenlignet med ikke maligne normale HK-2 celler (T-tumor, N-Normal), [p-verdi (A) 0,032; p-verdi (B) 0,018)].
Korrelasjonen av Mir-23b-3p Expression med overlevelse i nyre kreft
Uttrykket nivået av Mir-23b-3p korrelert med 5 år overlevelse av pasientene. For pasienter med moderat til lav Mir-23b-3p uttrykk (n = 12) (figur 2), alle overlevde 5 år etter operasjonen, mens de med høy Mir-23b-3p (n = 12) uttrykk, bare 50% overlevde (Figur 2). Overlevelseskurven var basert på antall pasienter (24) som vi hadde overlevelse informasjon ut av totalt 29 pasienter. Det ble ikke observert noen sammenheng mellom svulst klasse, scene og miRNA-23b-3p nivåer.
Funksjonell rolle Mir-23b-3p i A-498 celler
Å belyse funksjonelle rolle fra Mir-23b-3p i nyrekreft vi slått ned uttrykket av MIR-23b-3p i A-498 og Caki-2 nyrekreftceller med en kommersielt tilgjengelig Mir-23b-3p hemmer. Anti-MIR-Negativ kontroll # 1 ble også anvendt for disse forsøk. MIR-23b-3p-nivået ble redusert med mer enn 99%, sammenlignet med den negative kontroll i A-498-celler (Figur 3a). Anti-MIR-23b-3p transfeksjon inn Caki-2 celler også redusert nivå av MIR-23b-3p uttrykk i disse cellene (figur 3b).
Expression of Mir-23b-3p ble redusert med mer enn 99% etter sin hemming i både A-498 (A) og Caki-2-celler (B).
effekt på Cellesyklus og apoptose
virkningene av MIR-23b- 3p slå ned på cellesyklus og apoptose ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Apoptose-analyse viste en betydelig økning i det totale antallet apoptotiske celler (tidlig apoptotiske pluss apoptotiske) i både A-498 (8,87%) (figur 4a) og Caki-2-celler (11,74%) (figur 4b) med MIR-23b- 3p slå ned i forhold til den negative kontroll [A-498 (3,37%) og Caki-2 (3,68%)]. Det var ingen signifikante endringer i cellesyklusen for både A-498 og Caki-2 celler (data ikke vist).
A) apoptose analysen viste en betydelig økning i antall totale apoptotiske celler (8.87%) i den anti- MIR-23b-3p-inhibitor transfekterte celler sammenlignet med den negative kontroll (3,37%) i A-498-celler (p-verdi 0,029). B) I Caki-2-celler antal apoptotiske celler (11,74%) i anti- MIR-23b-3p-inhibitor transfekterte celler sammenlignet med den negative kontroll (3,68%) (p-verdi 0,030).
Effekt på Cell Invasion og migrasjon Properties
For å finne ut om Mir-23b-3p påvirker nyrekreft celle migrasjon og invasjon et cytoselect 24-brønn celle migrasjon og invasjon kit ble brukt. A-498 og Caki-2-celler ble transfektert med anti-Mir-23b-3p hemmer og anti-MIR-Negativ kontroll. Både A-498 og Caki-2-celler viste en 30% reduksjon i celle invasjon i prøvene hvor MIR-23b-3p ble hemmet sammenlignet med negativ kontroll (figur 5a og 5b). Ingen vesentlig endring i migrasjon ble observert i både A-498 og Caki-2 celler (data ikke vist).
Invasive egenskapene til A-498 (A) og Caki-2 (B) celler ble redusert med 30 % etter MIR-23b-3p slå ned sammenlignet med kontroller. Y-aksen-absorbans ved 560 nm [p-verdi (A) 0,026; p-verdi (B) 0,030].
PTEN er økt etter Knock Down Mir-23b-3p i A-498 celler
For å se effekten av MIR-23b-3p uttrykk på forskjellige gener som er involvert i apoptose og invasjon vi merket protein ekspresjon av flere gener som er involvert i disse prosessene. Den pro apoptotiske genet PTEN ble funnet å være opp reguleres etter Mir-23b-3p slå ned på A-498 celler (Figur 6A). Vi har også funnet en reduksjon i protein nivåene av PI3-kinase og total Akt. Interessant, en reduksjon i uttrykket av pro inflammatoriske cytokin IL32 ble også observert etter Mir-23b-3p slå ned. Protein uttrykk nivåer ble kvantifisert ved optisk densitometry hjelp ImageJ programvare versjon 1.36b (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Fold endring ble beregnet som forholdet mellom netto intensiteten av hver prøve transfektert med anti-MIR-23b-3p dividert med GAPDH, og de negative kontroll transfektert prøver dividert med GAPDH (Anti-MIR-23b-3p transfekterte prøver /GAPDH) /(Neg kontroll MIR transfektert prøver /GAPDH) (figur 6B).
A) uttrykk for PTEN, PI3-kinase, Akt og IL-32 i A-498 celler, sammenlignet med negativ kontroll. GAPDH ble anvendt som en normaliseringskontroll. B) Kvantitative data for Western blot-analyse. PTEN var opp regulert, mens PI3-kinase, Akt og IL-32 uttrykk ble nedregulert.
PTEN er et direkte mål fra Mir-23b-3p
Siden en betydelig økning i apoptose ble observert i både A-498 og Caki-2 celler og økt PTEN uttrykk i A-498 celler etter Mir-23b-3p slå ned, så vi for å se om Mir-23b-3p rettet mot pro apoptotisk genet PTEN. Bruke TargetScan (targetscan.org) og microrna.org vi identifisert komplementære sekvenser i Mir-23b i 3’UTR av PTEN genet (figur 7a). Vi gjennomførte luciferaserapportørplasmid analyser ved hjelp av en 3’PTEN konstruere med Mir-23b-3p eller MIR-Control- uttrykker A-498 celler og observert en konsekvent reduksjon av luciferase aktivitet (figur 7b) på Mir-23b-3p transfektanter som tyder på at MIR -23b-3p undertrykker PTEN direkte.
A) Programvare analyse viser sekvenser komplementære til de frø sekvenser av Mir-23b-3p i 3 «UTR av PTEN genet. B) Luciferase-analyse viste en reduksjon i relative luciferase heter i prøver som samtidig transfektert med MIR-23b-3p var og PTEN 3»-UTR-gen-konstruksjon sammenlignet med kontrollkonstruksjoner (Neg Con-negativ kontroll, Con-kontroll-plasmid-konstruksjon mangler PTEN 3 « UTR nettsteder for Mir-23b-3p, PTEN-PTEN plasmid konstruksjon som har PTEN genet 3’UTR nettsteder for Mir-23b-3p,. (p-verdi 0,017)
Expression of PTEN Protein i Normal og kreft~~POS=TRUNC regioner av vevsprøver som har en høy Expression of Mir-23b-3p
for ytterligere å bekrefte at PTEN er et mål på MIR-23b-3p vi sjekket for ekspresjon av PTEN protein i normale og kreft regioner i pasientens vev prøvene som hadde et høyt uttrykk for Mir-23b-3p, ved hjelp av immunhistokjemi (IHC). ti prøver med høy Mir-23b-3p uttrykk ble valgt. et representativt eksempel på PTEN immunhistokjemi er vist i figur 8A.
A) Representative bilder av Immunohistochemistry (IHC) analyser. B) grafisk fremstilling av data som viser at PTEN uttrykk var høy i normale områder av nyrekreft pasientprøver mens i kreft regioner med høy Mir-23b-3p uttrykk PTEN ikke ble observert.
IHC flekker resultater for vev ble gradert etter rask score (prosent celler farget × intensiteten av flekken). Hurtig poengsum hentet fra tumorprøver ble normalisert med rask score på sine vanlige prøver (T /N) og Chi-kvadrat test ble utført med Mir-23b-3p uttrykk nivåer i de samme pasientprøvene (Figur 8b). Alle normale prøver uttrykt PTEN protein om på ulike nivåer. PTEN flekker var fraværende fra tumorprøver som uttrykte høyere nivåer av Mir-23b-3p (p 0,001). (Figur 8B)
Genistein Reduserer Uttrykk av MIR-23b-3p i A-498 celler
Vi undersøkte også effekten av chemoprevention middel, genistein (et produkt soya), på ekspresjon av MIR-23b-3p i A-498-celler. Behandling med genistein (25 mm) i 96 timer redusert uttrykk av MIR-23b-3p med 50%, mens en høyere konsentrasjon av genistein (50 mm) for samme periode redusert uttrykk med 45% (figur 9).
MIR-23b-3p-ekspresjon ble redusert med 50% i 25 uM genistein behandles A-498 celler sammenlignet med ubehandlede celler, 50 uM genistein redusert MIR-23b-3p-ekspresjon ved 45% (p-verdi 0,030).
Diskusjoner
Denne studien viser at Mir-23b-3p fungerer som en onkogene mikroRNA i nyrecellekreft. Dets ekspresjon er økt i nyrecellekreft cellelinjer og vevsprøver (klar cellekreft) sammenlignet med normale nyreceller og matchede normale vev, henholdsvis. I tillegg har vi funnet at høye nivåer av Mir-23b-3p føre til lavere overlevelse for nyrekreftpasienter. Å studere den funksjonelle rollen MIR-23b-3p uttrykket ble slått ned i A-498 og Caki-2 nyrekreft cellelinjer. Dette førte til en økning i det totale antall celler som gjennomgår apoptose i begge cellelinjer sammenlignet med kontroller. Det var imidlertid ingen signifikant endring i cellesyklusen. I tillegg A-498 og Caki-2-celler viste redusert celle invasjonen i Mir-23b-3p slått ned celler, men ingen signifikant endring i migrasjon. Western analyse av Mir-23b-3p slå ned viste økt PTEN uttrykk og samtidig bruk av nedgang i uttrykket av PI3-kinase, Akt og IL-32. PTEN ble funnet å være en direkte mål for Mir-23b-3p gjennom reporter gen-analyser.
signifikant endring i antall apoptotiske celler etter slå ned på Mir-23b-3p i både A-498 og Caki -2 celler føre oss å søke etter gener og stier som er involvert i apoptose. Tidligere studier har vist at PTEN kan indusere apoptose gjennom en PI3-kinase avhengig veien [11]. PTEN fungerer som et tumorsuppressorgen ved virkningen av sin fosfatase proteinprodukt [12], nedbrytende PIP3 til inaktive fosfatidylinositol (4,5) -diphosphate PIP2 [13], [14]. Dette i sin tur regulerer negativt pro-overlevelse PI3K /Akt signalveien. Den phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway regulerer ulike cellulære prosesser, herunder spredning, vekst, apoptose og cytoskeletal omorganisering. PI3Ks er heterodimere lipid kinaser som er sammensatt av regulatoriske og katalytiske subenheter kodet av forskjellige gener [15]. En av de viktigste funksjonene til PI3K er å syntetisere de andre messenger ptdins (3,4,5) P3 (PIP3) fra ptdins (4,5) P2 (PIP2). AKT, en serin /treoninkinase som har en rekke forskjellige underlag, blir aktivert ved rekrutteringen til plasmamembranen gjennom direkte kontakt mellom dens pleckstrin-homologi (PH) domene med PIP3, og fosforylering ved Thr308 og Ser473. AKT virker på nedstrømssiden av PI3K å regulere mange biologiske prosesser, slik som proliferasjon, apoptose og vekst, men andre signalveiene er også kjent for å bli regulert av PI3K-aktivitet og kan være involvert i PI3K-mediert tumorigenesis. PTEN er en av de mest tapt tumorsuppressorgener i human kreft. I løpet av tumorutvikling, mutasjoner og delesjoner av PTEN forekomme som inaktiverer den enzymatiske aktiviteten fører til økt celleproliferasjon og redusert celledød. Hyppig genetisk inaktivering av PTEN oppstår i glioblastom, livmorkreft, prostatakreft; og redusert ekspresjon finnes i mange andre tumorer som lunge- og brystkreft [15]. I denne studien viste Western analyse også en nedgang i IL-32 uttrykk etter hemming av MIR-23b-3p i A-498 celler. Vi fikk ikke overvåke IL-32 i kulturen media. IL-32 er et cytokin og det er pro-kreft rolle har blitt dokumentert i flere studier [16], [17], [18]. Den PI3-kinase pathway er blitt vist å indusere IL-32-ekspresjon i en rekke studier [19], [20], [21], [22], spesielt i kreft i bukspyttkjertelen, hvor dens pro- kreft rolle er blitt etablert. Derfor er disse studiene tyder på at årsaken til redusert IL-32 uttrykk på knock ned fra Mir-23b-3p er at det påvirker også uttrykk for PI3-kinase og Akt. En programvare søk etter Mir-23b-3p bindingsseter på PI3-kinase og Akt ble gjennomført på, men vi fant ikke noe bevis for at PI3-kinase og Akt er direkte mål av Mir-23b-3p.
Genistein (40,5,7-Trihydroxyflavone), en av de viktigste soya isoflavoner, har et bredt utvalg av chemopreventive handlinger. De kreft effekter av genistein har blitt tilskrevet flere signalveier og mekanismer som påvirker cellesyklus arrest, apoptose, invasjon, metastase og angiogenese, attributter som potensielt kan hindre svulsten initiering og progresjon [23], [24]. Genistein er rik på soyaprodukter og har blitt identifisert som hemmer av protein tyrosin kinaser og dermed kan spille en nøkkelrolle i cellevekst og apoptose [25], [26]. Det har blitt rapportert å ha østrogen egenskaper og anti-neoplastisk aktivitet i flere tumortyper [27]. I en tidligere studie Hillman et. al. har vist at kombinasjonen av genistein med primærtumor bestråling virker i realiteten som en terapeutisk tilnærming, i etablerte tumorer nyre, på grunn av tumorvekst inhiberes ved både primære og metastaser. I deres studie genistein alene hadde en tendens til å stimulere veksten av primære nyretumor og øke metastase [28]. Dermed disse funnene bedt oss om å overvåke uttrykk for miRNA-23b-3p etter behandling av A-498 celler med ulike konsentrasjoner av genistein. Vi fant en 50% reduksjon i ekspresjonen av MIR-23b-3p etter behandling av A-498-celler med 25 pM genistein i 96 timer (figur 8). I en tidligere studie [29] rapporterte også vi en nedgang på MIR-21 uttrykk i mus xenografttumorer dannet etter injisering 25 mikrometer genistein behandlet A-498 celler subkutant i nakne mus i forhold til mindre svulster som dannes ved ubehandlede A-498 celler. Vi målte også uttrykk for Mir-23b-3p i disse svulstene og kunne ikke finne noen vesentlig endring i sitt uttrykk.
I sammendraget, er MIR-23b-3p et onkogen i RCC og direkte hemmer PTEN svulst suppressor genet. Dermed MIR-23b-3p kan være nyttig som en nyrekreft diagnostisk markør og som et terapeutisk mål for behandling av nyrecellekreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Formalin fiksert, parafininnstøpte (FFPE) nyrekreftprøver ble hentet fra San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av UCSF komité for menneskeforskning (Godkjenningsnummer: H9058-35751-01).
Cellelinjer og cellekultur
Menneskelig nyre kreftcellelinjer A-498, ACHN, Caki-1, Caki-2, og en normal nyrecellelinje (HK-2) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Integriteten av cellelinjene ble bekreftet ved hjelp av DNA ATCC (STR) profilering. Normale nyre HK-2-celler ble dyrket som et monolag i keratinocytt Serum Free Medium (K-SFM) supplementert med 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt (BPE), 5 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF) (Life Technologies /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA), 50 mg /ml penicillin og 50 mg /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Nyrekreft cellelinjer A-498 og ACHN ble dyrket som en monolayer i Eagles Minimum Essential Medium, (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Caki-en og Caki-2 ble dyrket på samme måte i McCoy’s5A media (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Alle cellelinjer ble holdt i en inkubator med en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO2 ved 37 ° C.
Genistein Behandling av A-498-celler
A-498 celler (60 -70% sammenflytende) ble behandlet med genistein (25 uM og 50 uM). Genistein (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) ble oppløst i DMSO, og celler behandlet med vehikkel (DMSO) tjente som kontroll. Frisk genistein ble administrert hver dag med en endring av medium, og cellene inkubert i 4 dager.
Kvantitativ Real-time PCR
For real-time polymerase chain reaction (PCR), komplementære DNA var forsterket med inventoried Gene Analyse Produkter som inneholder to gen-spesifikke primere og en TaqMan MGB probe (6-FAM dye-merket) med en TaqMan Universal Fast PCR Master Mix i en 7500 Fast real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA). Termisk sykling tilstander inkludert 95 ° C i 20 sekunder (s), 40 sykluser av 95 ° C i 3 sek og 60 ° C i 30 sekunder i henhold til TaqMan Fast Universal PCR protokoll. Total mikroRNA ble hentet ved hjelp av en miRNeasy kit fra Qiagen (Valencia, CA, USA). For miRNA sanntids eksperimenter cDNA tråd ble syntetisert ved anvendelse av en Applied Biosystems Taqman mikroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), med 200 ng av total ekstrahert miRNA. RNU48 ble anvendt som en endogen kontroll. Det ble også brukt som en endogen kontroll for real-time PCR eksperimenter, hvor mirnas ble isolert fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) nyreprøver. Total miRNA ble hentet fra FFPE-prøver ved hjelp av en miRNA FFPE kit fra Qiagen.
Micro Disseksjon av nyre kreft vev og RNA Utvinning fra FFPE menneskelig nyre tumorprøver
Tilstøtende normale og kreftnyrevevet, ble oppnådd fra 29 representative FFPE- vevsblokker av radikale nephrectomy prøvene fra patologi Department of Veterans Affairs (VA) Medical Center of San Francisco. Blokkene var fra nyre kreftpasienter som ble operert på ved VA Medical Center mellom 1980-2009. Seksjoner (4 mikrometer) av blokkene ble utarbeidet, H E farget, og lysbilder ble gjennomgått av et styre sertifisert patolog for å markere de normale og kreftområder. Deretter ble 12 um glass laget av blokkene og mikro disseksjon ble utført ved anvendelse av merket H 50 mmol l-1 Tris (pH 8,0), 150 mmol l-1 NaCl, 0,5% deoksykolat, 0,1% SDS og 1,0% NP-40) inneholdende en protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Switzerland). Proteinanalyser ble utført ved bruk av en BCA proteinanalysesett (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Totalt protein (40 ug) ble elektroforisert i 12% SDS-PAGE-geler og Western blotting ble utført ved anvendelse av standard protokoller og proteiner påvist ved kjemiluminescens. Antistoffer, inkludert PTEN (kat. Nr. 9552S) og Akt (kat. Nr. 4691S) ble anskaffet fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA), PI3-kinase (kat. Ab69870) og IL-32 (kat. ab62580) var fra Abcam (Cambridge, MA, USA), mens GAPDH (kat. nr. sc-32233) var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA).
protein uttrykk nivåer ble kvantifisert ved optisk densitometry hjelp ImageJ programvare versjon 1.36b (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Fold endring ble beregnet som forholdet mellom netto intensiteten av hver prøve transfektert med anti-MIR-23b-3p dividert med GAPDH, og de negative kontroll transfektert prøver dividert med GAPDH (Anti-MIR-23b-3p transfekterte prøver /GAPDH) /(Neg kontroll MIR transfektert prøver /GAPDH).
luciferaserapportørplasmid analysen
Celler i 24-brønners plater ble transfektert med 30 nM pre-Mir negativ kontroll (NC) eller pre-MIR-23b -3p (Applied Biosystems) og PTEN konstruksjon (Katalognr. HmiT015535, Genecopoeia, Rockville, MD, USA) eller kontroll konstruere, pEZX-MT01 (Genecopoeia) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner. Kontrollen konstruere manglet Mir-23b-3p målse. Alle transfeksjon eksperimenter ble utført in triplo. Luciferase aktivitet ble analysert etter 48 timer etter transfeksjon, bruker doble luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega).
Immunohistochemistry
Farging ble gjort på nyrekreft vev lysbilder [laget av formalinfiksert, parafininnstøpte (FFPE) nyrecellekreft vevsblokker med en mikrotom (Leica)]. Glassene ble deparaffinized og antigen gjenfinning ble utført ved mikrobølger lysbildene i 10 mmol /l natriumcitrat-buffer. Lysbilder ble inkubert over natten med anti-PTEN antistoff (Cell signalering). Fargingen ble gjort ved hjelp av LABVISION Corporation (Thermo Fisher Scientific) Anti-Rabbit Farging System (LOT-RHD 80924) i henhold til produsentens anvisninger.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med Statview versjon 5.0 for Windows. T-test ble brukt til å sammenligne de ulike gruppene. p-verdier av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Chi-kvadrat test ble utført for å bestemme sammenhengen mellom Mir-23b-3p uttrykk nivåer og PTEN protein expression nivåer i vevsprøver.
Takk
Vi takker Dr Roger Erickson for støtte og hjelp med utarbeidelsen av manuskriptet.
