Abstract
Interleukin (IL) -20 er et proinflammatorisk cytokin i IL-10 familien. IL-20 er forbundet med tumorvekst i patogenesen av oral, blære, og brystkreft. Men lite er kjent om rollen som IL-20 i prostatakreft. Vi hypotese at IL-20 fremmer veksten av prostata kreft celler. Immunohistokjemisk farging viste at IL-20 og dets reseptorer ble uttrykt i humane PC-3 og LNCaP prostatakreft-cellelinjer og i prostatatumorvevet fra 40 pasienter.
In vitro
, IL-20 oppregulert N-cadherin, STAT3, vimentin, fibronectin, RANKL, cathepsin G, og cathepsin K, og økt migrasjon og kolonidannelse av prostata kreft celler via aktivert p38, ERK1 /2 , AKT, og NF-kB signaler i PC-3 celler. Vi undersøkte effekten av anti-IL-20 monoklonale antistoff 7E på prostatatumorvekst
in vivo
ved hjelp av SCID-mus subkutant og intratibial xenograft tumormodeller.
In vivo
, 7E redusert tumorvekst, undertrykt tumor-mediert osteolyse, og beskyttet bentetthet etter intratibial injeksjon av prostatakreftceller. Vi konkluderer med at IL-20 er involvert i cellemigrering, kolonidannelsen, og tumor-osteolyse av prostatakreft. Derfor kan IL-20 være en roman mål for behandling av prostatakreft
Citation. Hsu YH, Wu CY, Hsing CH, Lai WT, Wu LW, Chang MS (2015) Anti-IL-20 monoklonalt antistoff undertrykker prostatakreft Vekst og osteolysen i murine modeller. PLoS ONE 10 (10): e0139871. doi: 10,1371 /journal.pone.0139871
Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, Frankrike
mottatt: 12. mai 2015; Godkjent: 16 september 2015; Publisert: 06.10.2015
Copyright: © 2015 Hsu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi i Taiwan (MOST 103-2311-B-006-002 og MOST 104-2311-B-006-007 -MY2)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest mest hendelsen kreft og den sjette årsaken til kreft. død hos menn over hele verden [1]. Flertallet av menn med prostatakreft har stivnet skjelettmetastaser, som forårsaker store smerter og patologiske benbrudd [2, 3]. Invasjonen av benet rommet ved kreftceller fører til en ubalanse i osteoclast og osteoblastaktivitet som igjen forstyrrer bein homeostase [4]. Disse kreft-induserte responser bein begunstiger overlevelsen og veksten av kreftceller i sine nye omgivelser. Selv om prostatakreft benmetastaser er primært osteoblastisk i naturen, det er økende bevis for at osteoklastmediert osteolyse bidrar også til bein morbiditet hos pasienter med prostatakreft og benmetastaser [5, 6].
Andre rapporterer at bryst og prostata kreftformer induserer osteoclast aktivering ved avgassing av oppløselige faktorer, slik som IL-1, IL-6, og makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF). De fleste av disse mediatorer virker på osteoblaster og stromaceller, og bidra til osteolytiske lesjoner ved oppregulering reseptor aktivator av NF-kB ligand (RANKL), som gir en mulig mekanisme for å forklare øket benresorpsjon i benmetastase [6, 7]. RANKL binder seg til sin reseptor (RANG) på cellemembranen av osteoclast, noe som fører til differensiering og modning av osteoklaster [8]. Cathepsin K, en cystein protease utskilt av osteoklaster og prostata kreft celler, forringer ekstracellulære matrise under benresorpsjon [9]. Katepsin G, en kjemoattraktant for osteoklast-forløpere, er i stand til å behandle RANKL til en løselig form (sRANKL) som fremmer osteoklast-aktivering [10, 11]. Blokkering cathepsin G og cathepsin K reduserer tumorindusert osteolyse, noe som tyder på at cathepsin K og cathepsin G er avgjørende i mikromiljøet av kreft-indusert osteolytiske lesjoner [10, 12].
Betennelse er kritisk relatert til tumor betydelig progresjon. Det påvirker tumorigenesis på molekylært nivå ved å modulere tumormikromiljøet og regulere balansen av cytokiner, kjemokiner og transkripsjonelle faktorer [13, 14]. Epitel-mesenchymale overgang (EMT) er avgjørende for kreft metastasering. EMT endrer oppførselen til kreftceller og får dem til å invadere omkringliggende stroma, fører til deres intravasation, formidling, og kolonisering av fjerne områder [15, 16]. Under EMT, tumorceller, som er epiteliale-lignende celler, erverve mesenchymale egenskaper, og tapet av det epiteliale markør E-cadherin fører til en økning i mesenkymale markører N-cadherin, fibronektin, og vimentin [17]. Flere EMT-indusere som sneglen og Twist, er transkripsjonsfaktorer som undertrykker E-cadherin uttrykk [16, 18]. Andre studier [19, 20] har rapportert at kreftceller fremmes EMT ved å aktivere STAT3 signalveien.
IL-20 er et medlem av IL-10-familien, som omfatter IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 og IL-26 [21, 22]. Det signaliserer gjennom to typer heterodimer reseptor kompleks: IL-20R1 /IL-20R2 og IL-22R1 /IL-20R2 [23]. IL-20 er involvert i flere inflammatoriske sykdommer, slik som reumatoid artritt [24], aterosklerose [25], psoriasis [26, 27], osteoporose [28], oral cancer [29], og brystkreft [30].
Prostatakreft er en kompleks sykdom som metastasering til benet er en årsak til morbiditet og kan gå forut for metastasering til andre vitale organer. Vi har tidligere [28, 30] viste at IL-20 fremmer ikke bare bryst svulst spredning og migrasjon, men modulerer også osteoclast differensiering av oppregulering RANKL og rang. Anti-IL-20 monoklonalt antistoff (mAb) 7E redusert osteolytiske lesjoner i musemodeller for brystkreft og beskyttet ovariektomiserte mus mot osteoporotisk bentap, som begge støtter ideen om at IL-20 er kritisk for regulering av tumor-mediert osteolyse. Vi hypotese at IL-20 fremmer veksten av prostata kreft celler. Derfor, undersøkte vi ekspresjonen av IL-20 og dets biologiske funksjon i prostatakreftceller og vurderes det terapeutiske potensialet av 7E i xenograft prostatakreft musemodeller.
Materialer og metoder
Immunhistokjemi
Parafin-vevssnitt av 40 humane prostatakreft prøver ble oppnådd fra et kommersielt prostata kreftvev array (SuperBioChips Laboratories, Seoul, Korea), og ble anvendt for immunhistokjemisk (IHC) farging med anti-IL-20 (7E ), anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, eller anti-IL-22R1 mAb (R R 200) eller høy-uttrykk (H ≥ 200). Immunocytokjemisk farging av IL-20 og dets reseptorer i PC-3-celler ble utført ved bruk av samme protokoll som beskrevet ovenfor.
Cellekultur
prostatacancercellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Humane prostatacancercellelinjer, PC-3 og LNCaP, ble opprettholdt i RPMI-1640 med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, Rockville, MD), 100 ug /ml streptomycin, og 100 U /ml penicillin . Celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2.
celleproliferasjonsanalyse
PC-3-celler (3 x 10
4) ble dyrket over natten og deretter eksponert for human (h) IL-20 (200 ng /ml) i 72 timer i medium inneholdende 1% FBS. For å bekrefte den spesifikke aktivitet av IL-20, 7E (2 ug /ml) ble tilsatt til kultursystem, enten alene eller sammen med IL-20 ved et 10: 1 (7E: IL-20) konsentrasjonsforholdet. Cellene ble deretter inkubert med 1 mg /ml metyltiazol tetrazolium (MTT) (Sigma-Aldrich) i 3 timer og MTT-formazan-krystaller ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) (Sigma-Aldrich). Absorbansen ble målt ved 550 nm.
Cell migrasjon analysen
Cell migrasjon ble analysert ved hjelp av en modifisert Boyden kammer med en polykarbonat filter med 8-mikrometer porer (Nucleopore, Cabin John, MD). De øverste Brønnene ble lastet med PC-3 celler (5 × 10
4). De nedre kamre ble fylt med hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 pluss 7E, eller hIL-20 pluss mIgG i RPMI-1640 inneholdende 1 % FBS. RPMI-1640 med 1% FBS ble anvendt som en negativ kontroll. Cellene ble tillatt å migrere i 8 timer, og deretter ble de farget og tellet. Forsøket ble gjort for tre ganger med kvadruplikeres brønner.
Sanntids migrasjon analysen
PC-3 celler ble sådd på 5 × 10
4 celler /ml i seks-brønns retter og latt bli koblet i 18 timer. Cellene ble deretter eksponert for medium inneholdende hlL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 pluss 7E, eller hIL-20 pluss mIgG. Cell migrasjon kinetikk ble tatt opp med et fluorescerende celle analysator (Juli Smart, Montreal Bioteknologi Inc. (MBI), Dorval, Montreal, Canada) i 18 timer og deretter analysert ved hjelp ImageJ programvare (https://rsbweb.nih.gov/ij/)
Soft agar-kolonidannende analyse
Celler som utviser eksponensiell vekst ble suspendert i fullstendig vekstmedium inneholdende 0,35% Bacto-agar (A-6013 Type 1 Low EEO,. Sigma-Aldrich) og kledde på 0,5% agarosegel i 30 mm-retter (1 × 10
4 celler /skål). Medium inneholdende IL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 pluss 7E, eller hIL-20 pluss mIgG ble lagt over toppen agar. Rettene ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator (5% CO
2, 95% O
2) i tre uker. I løpet av denne perioden ble mediet skiftet hver 2 dager. Antall synlige kolonier (mer enn 50 um) ble tellet under et mikroskop. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
Sanntids kvantitativ polymerase chain reaction (RT-qPCR)
For å analysere ekspresjon av IL-20 og dets reseptorer, total RNA fra PC-3 og LNCaP celler ble hentet ved hjelp av en reagens (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, California), og deretter total RNA gikk revers transkripsjon (Clontech, Palo Alto, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Den forsterkede malen ble oppdaget ved hjelp SYBR Grønn med en real-time PCR system (StepOnePlus, Applied Biosystems) med genet spesifikke primere. Glyceraldehyd fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en intern kontroll. For å undersøke ekspresjon av E-cadherin, N-cadherin, STAT3, vimentin, fibronektin, RANKL, katepsin G, og cathepsin K, ble PC-3-celler inkubert med hIL-20 (200 ng /ml) i 2 til 6 timer. Uttrykket nivåer av disse genene ble analysert ved anvendelse av SYBR grønn (Applied Biosystems) som samspillet middel. Kvantifisering analyse av mRNA ble normalisert med menneskelig GAPDH som husholdningsgenet. Relative multipler av endring i mRNA ble bestemt ved å beregne 2
-ΔΔCt.
Western blotting
PC-3 celler (2 × 10
5) ble stimulert med hIL- 20 (200 ng /ml) (R sc) eller mus-immunoglobulin G (mIgG; 10 mg /kg ; sc) tre ganger i uken for varigheten av behandlingsregimet. Antistoffet ble injisert (s.c.) inn i periferien av den voksende tumor i tumor-bærende SCID-mus. Friske kontroller ble ikke injisert med tumorceller. Den tumorstørrelse ble målt med en passer i tre vinkelrette dimensjoner og beregnet ved hjelp av følgende formel: Tumor size = 0,5 x (lengde x bredde x dybde). Førti dager etter at tumorcellene var blitt injisert, ble musene drept ved hjelp av CO
2, og tumorvevet ble høstet og veiet. For å analysere uttrykket nivåer av IL-20 og katepsin G, ble tumorvevet isolert fra de 4 mus i hver gruppe ble oppsamlet, og det totale RNA ble ekstrahert for videre analyse.
Intratibial injeksjon av PC-3 i SCID-mus
Åtte uker gamle hann SCID-mus ble bedøvet ved hjelp av en injeksjon av pentobarbital (50 mg /kg) og deretter av buprenorfin (2 mg /kg, ip) for kirurgisk analgesi. Hver ble gitt en medial parapatellar innsnitt og en kanyle ble plassert i den intramedullære kanal av tibia. PC-3-celler, ved en konsentrasjon på 2 x 10
5/100 ul, ble langsomt injisert i tibia og snittet ble lukket med 5-0 chromic suturer. For postoperativ analgesi, buprenorfin (2 mg /kg, i.p.) ble injisert en gang daglig i 3 dager etter kirurgi. Suksessraten for intratibial svulst implantasjon var 100%. Musene ble deretter tilfeldig inndelt i tre grupper (n = 5 i hver gruppe) og injisert med bærer (PBS; ip), mIgG (10 mg /kg, ip), eller 7E (10 mg /kg, ip) tre ganger per uke. Sju uker etter behandlinger begynte, ble musene drept ved hjelp av CO
2, og deres tibial metaphyses ble analysert
in vivo
ved hjelp av mikro-computertomografi (micro-CT) med en høy oppløsning, lavdose X-ray scanner. Benmineraltetthet (BMD) ble analysert i 50 påfølgende skiver. Resultatene ble beregnet som en prosentandel i forhold til verdier fra en frisk kontroll.
Statistisk analyse
Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) ble brukt for statistisk analyse. En enveis variansanalyse (ANOVA) parametriske Kruskal-Wallis-test ble anvendt for å sammenligne de data mellom gruppene. Post hoc sammenligninger ble gjort ved hjelp av Dunn multippel sammenligningstest. Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Signifikans ble satt til
P
0,05
Resultater
Uttrykk av IL-20 og dets reseptorer i pasienter med prostatakreft
Førti prostata adenokarsinom vevsprøver (stadium II, n = 8;. Stage III, n = 32) ble IHC farget med anti-IL-20-mAb. Beising intensiteten var høy-uttrykk i 22 prøver (figur 1A) og lav-uttrykk i 18 prøver. For å undersøke om prostata kreft celle er målcellen for IL-20, vi brukte IHC flekker å analysere uttrykket nivåer av IL-20-reseptorer (IL-20R1, IL-20R2, og IL-22R1) i prostata adenokarsinom vevsprøver fra 40 pasienter. Prostata carcinoma celler ble tatt positivt farget med anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, og anti-IL-22R1 mAbs (figur 1B, 1C og 1D). Intensiteten av IHC-farging av prostata carcinoma vev var heterogen (figur 1F). Anti-IL-20 og anti-IL-20R1 mAb er sterkt farget på tumorceller, men anti-IL-20R2 og anti-IL-22R1 mAb ikke er (figur 1A, 1B, 1C og 1D, piler) på representative karsinom vev. Ekspresjonen av IL-20R1, IL-20R2, og IL-22R1 var høy i 37, 7, og 10 prøver, henholdsvis.
(AE) Kirurgisk vevsprøve prostata adenokarsinom vevsprøver (stadium II, n = 8 ; stadium III, n = 32) fra 40 pasienter som ble oppnådd fra et kommersielt prostata kreftvev array. IHC-farging med anti-IL-20, anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, og anti-IL-22R1 mAbs viste at IL-20 og dets reseptorer (IL-20R1, IL-20R2, og IL-22R1) ble farget. Mus IgG1 (mIgG1) isotype var negativ kontroll. Pilene viser prostata kreft celler. Forstørrelse: 200 ×. Dataene er representative for 2 uavhengige forsøk med lignende resultater. (F) Kvantitering av fargeintensitet av anti-IL-20, anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, og anti-IL-22R1 mAb fra 40 humane prostatacancerprøver. IHC, immunhistokjemisk farging; mAb, monoklonalt antistoff; mIgG, mus immunoglobulin.
Celleproliferering ble hemmet i 7E-behandlede PC-3 celler
For å klargjøre rollen som IL-20 i patogenesen av prostata kreft, må vi først undersøkt vidt IL-20 og dets reseptorer (IL-20R1, IL-20R2, og IL-22R1) ble uttrykt i prostata kreft cellelinjer. RT-qPCR og IHC-farging viste at IL-20 og dets reseptorer ble alle uttrykt i PC-3 celler (figur 2A og 2B), og i LNCaP-celler (figur 2A). Det første trinnet i tumorprogresjon er antatt å være et resultat av en genetisk endring som fører til unormal proliferasjon av en enkelt celle. For å avgjøre om IL-20 forfremmet PC-tre celleproliferasjon, brukte vi en MTT analyse som viste at IL-20 ikke signifikant fremme celle spredning av PC-3 celler, men at cellevekst ble doseavhengig hemmet i 7E behandlet PC-3-celler (figur 2C og 2D). Tumorprogresjon involvert cellevandring og metastasering til fjerne organer. En sanntids migrering analyse viste at cellemigrering ble øket i IL-20-behandlede PC-3-celler sammenlignet med ubehandlede kontroller, ble aktiviteten som attenuert ved 7E (figur 3A og 3B). Videre viste en Boyden kammer assay lignende resultater (fig 3C og 3D).
(A) RT-qPCR viste at IL-20 og dets reseptorer ble uttrykt i prostata cancer PC-3 og LNCaP-celler. Dataene er representative for 2 uavhengige forsøk med lignende resultater. (B) IHC viste at IL-20 og dets reseptorer ble uttrykt i prostata cancer PC-3-celler. Dataene er representative for 2 uavhengige forsøk med lignende resultater. (C) en MTT analyse viste at celleproliferasjon ble inhibert i 7E-behandlede PC-3-celler. Medium alene ble anvendt som en negativ kontroll. 7E ble anvendt for å hemme aktiviteten av hIL-20. * P 0,05 versus ubehandlede kontroller, #p 0,05 versus hIL-20-gruppen. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. (D) En MTT analyse viste at celleproliferasjon ble doseavhengig inhibert i 7E-behandlede PC-3-celler. * P 0,05, ** p 0,01 versus mIgG kontroller. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. RT-qPCR, sanntids kvantitativ polymerase chain reaction; MTT, metyltiazol tetrazolium; 7E, anti-IL-20 monoklonalt antistoff; hIL-20, human interleukin-20.
(A-B) Cell migrasjon ble evaluert ved hjelp av sanntids migrering analysen. PC-3-celler ble inkubert med medium inneholdende hlL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 pluss 7E, eller hIL-20 pluss mIgG. Cell migrasjon kinetikk ble tatt opp med en smart fluorescerende celle analysator i 18 timer. (A) Representative tid-lapse bilder for sporing bevegelse avstand fra PC-3 celler er vist for hver gruppe. Bevegelsen avstand fra hver celle er presentert i forskjellige farger (teller = 7 celler). (B) Kvantisering av bevegelsesavstand (i mikrometer) av PC-3-celler (teller = 7 celler). Mus IgG var den negative kontroll av 7E. * P 0,05 versus ubehandlede kontroller, #p 0,05 versus hIL-20-gruppen. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter som hver ble utført i fire paralleller. (C-D) Cellemigrering ble også evaluert ved bruk av et modifisert Boyden kammer analysen. De øverste Brønnene ble lastet med 5 × 10
4 PC-3 celler. De nedre kamre ble fylt med hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 pluss 7E, eller hIL-20 pluss mIgG i RPMI-1640 inneholdende 1 % FBS. RPMI-1640 med 1% FBS ble anvendt som en negativ kontroll. Cellene ble tillatt å migrere i 8 timer. (C) Representant Giemsa farging bilder skal vises for hver gruppe. (D) Kvantitering av migrerte celler per brønn. ** P 0,01 versus ubehandlede kontroller. ## P 0,01 versus hIL-20-gruppen. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter, hver utført i fire eksemplarer.
Colony formasjonen ble fremmet i IL-20-behandlede PC-3 celler
Det første trinnet i lokal invasjon av prostatacancer er en økning i kolonidannelse av kreftceller. En myk agar-kolonidannelse analyse viste at forankrings-uavhengig kolonidannelse var vesentlig høyere i IL-20-behandlede PC-3-celler enn i ubehandlede kontroller, den aktivitet som ble dempet ved 7E (figur 4A og 4B).
PC-3-celler (1 x 10
4 /brønn) ble inkubert med hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 pluss 7E, eller hIL-20 pluss mIgG i 3 uker. Dyrkningsmediet ble byttet hver 2. dag. (A) Representative bilder skal vises for hver gruppe. (B) kolonidannelse var vesentlig høyere i IL-20-behandlede PC-3-celler. 7E (2 ug /ml) ble anvendt for å hemme aktiviteten til IL-20. * P 0,05, ** p 0,01 versus ubehandlede kontroller, ## p 0,01 versus hIL-20-gruppen. Verdier er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter, hvert foretatt in triplo.
Signaloverføring ble indusert i IL-20-behandlede PC-3-celler
Epithelial-mesenchymale overgangs ( EMT) er grunnleggende i tumorprogresjon og metastasering. For å undersøke hvorvidt IL-20 er involvert i prostata tumormetastase gjennom EMT, ble RT-qPCR brukt til å analysere ekspresjonen av epiteliale markør E-cadherin, N-cadherin, STAT3, vimentin, og den mesenchymale markør fibronektin i PC-3-celler inkubert med IL-20. Den viste at E-cadherin var blitt nedregulert (figur 5A), og N-cadherin, STAT3, vimentin, og fibronektin var blitt signifikant oppregulert (figur 5B, 5C, 5D og 5E), mens i 7E-behandlede celler, dette oppregulering var svekket. For å klargjøre den mulige mekanisme mellom IL-20 og tumorprogresjon, signal molekyler av ERK1 /2, AKT, NF-kB, og p38 ble vurdert og funnet å være fosforylert i IL-20-behandlede PC-3-celler (fig 5F) .
(AE) PC-3-celler ble behandlet med hIL-20 (200 ng /ml) i de angitte tidsrom, og uttrykket nivåer av E-cadherin, N-cadherin, STAT3, vimentin, og fibronektin ble analysert ved hjelp av RT-qPCR med spesifikke primere. * P 0,05, ** p 0,01 versus 0-timers kontroller. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter, hvert foretatt in triplo. (F) PC-3-celler (2 x 10
5) ble inkubert med hIL-20 (200 ng /ml) for de angitte tidsperioder, og deretter cellelysater ble samlet og analysert ved hjelp av immunoblotting med spesifikke antistoffer mot fosfo p38, fosfor-ERK1 /2, fosfor-AKT, og fosfor-NF-kB. p-aktin-antistoff ble anvendt som en intern kontroll. Kvantifisering av båndene ble gjort ved hjelp ImageJ programvare. * P 0,05 versus 0-min-kontroller. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
RANKL, cathepsin G, og katepsinaktivitet K transkripsjoner og sRANKL proteinproduksjon ble indusert i IL-20-behandlede PC-3 celler
for å teste om IL-20 regulerer katepsin og RANKL i prostatakreft, ble PC-3 celler behandlet med IL-20 i 6 timer. En RT-qPCR-gen-transkript analyse viste oppregulert RANKL, katepsin G og cathepsin K ekspresjon i IL-20-behandlede PC-3-celler, ble aktiviteten til som nøytraliseres av 7E (figur 6A, 6B og 6C). Videre er en ELISA-analyse viste en signifikant (p 0,05) økning i sRANKL ekspresjon i IL-20-behandlede PC-3-celler (figur 6D). Derfor hypotese vi at IL-20-behandlede PC-3 celler produserer cathepsin G og deretter holde seg RANKL å generere sRANKL, noe som ytterligere fremmer osteoclast aktivering i bein mikromiljøet. For å bekrefte at spalting av RANKL var cathepsin G-avhengige, brukte vi en bestemt cathepsin G-hemmer (TPCK, 1 mm) for å blokkere protease aktivitet av cathepsin G. Resultatet bekreftet vår hypotese (Fig 6E).
(AC) PC-3-celler ble behandlet med hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 pluss 7E, eller hIL-20 pluss mIgG for 6 timer, og uttrykket nivåer av RANKL, katepsin G, og cathepsin K ble analysert ved hjelp av RT-qPCR med spesifikke primere. * P 0,05, ** p 0,01 versus ubehandlet kontroll, #p 0,05 versus hIL-20-gruppen. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter, hvert foretatt in triplo. (D) PC-3-celler ble inkubert med hIL-20 (100, 200 eller 400 ng /ml) i 48 timer ble kulturmediet oppsamlet og deretter konsentrasjonen av sRANKL ble bestemt ved hjelp av ELISA. * P 0,05 versus ubehandlede kontroller. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter, hvert foretatt in triplo. (E) PC-3-celler ble preinkubert med 1 uM av cathepsin G-spesifikk inhibitor (TPCK) i 1 time og deretter behandlet med hIL-20 (400 ng /ml) i 72 timer. Kjøretøyet kontrollen var 0,0175% EtOH i kulturmedium. Konsentrasjonen av sRANKL ble bestemt ved hjelp av ELISA. * P 0,05 versus ubehandlede kontroller, #p 0,05 versus kontrollene HIL-20 pluss EtOH kjøretøy. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer. RT-qPCR, sanntids kvantitativ polymerase chain reaction; sRANKL, løselig RANKL; EtOH, etanol.
Tumorvekst ble hemmet i 7E-behandlede PC-tre prostatakreft xenografter
Basert på vår
in vitro
resultater, vi videre undersøkte effekter av 7E på prostata tumorvekst
in vivo
i vår mus xenograft modell. PC-3-celler ble injisert (sc) i SCID-mus, som så ble behandlet med PBS, mIgG (10 mg /kg, sc), eller 7E (10 mg /kg, SC) injeksjoner 3 ganger per uke og tumorvekst var målt i 40 dager. Det var mindre vekst i 7E-behandlede gruppe enn i den mIgG- og PBS-behandlede kontrollgrupper (Figur 7A). Etter 40 dager ble musene drept og deres tumorer ble veiet. Svulster i 7E-behandlede gruppen veide mindre enn i mIgG- og PBS-behandlede grupper (figur 7B). Tumorvev fra hver gruppe ble deretter isolert for å ekstrahere RNA. RT-qPCR viste at IL-20-ekspresjon i 7E-behandlede gruppe var betydelig lavere enn i den mIgG- og PBS-behandlede kontrollgrupper (Figur 7C). I tillegg ble katepsin G ekspresjon nedregulert i 7E-behandlede gruppe (figur 7D).
(A-D) PC-3-celler ble injisert (s.c.) inn i melkefettputer av SCID-mus. En dag senere ble musene injisert (s.c.) med PBS, 7E (10 mg /kg), eller mIgG (10 mg /kg; n = 4 pr gruppe) tre ganger per uke. (A) Tumorstørrelsen ble målt ved hjelp av en skyvelære. (B) Mus ble drept 40 dager etter at de hadde blitt injisert med PC-3 celler, og deres svulster ble samlet og veid. (C-D) Tumor vevsprøver fra hver gruppe (n = 4) ble isolert ved slutten av forsøket. Ekspresjon av IL-20 og cathepsin G i tumorvev ble analysert ved hjelp av RT-qPCR med spesifikke primere. * P 0,05, ** p 0,01 versus mIgG kontroller. Dataene er midler ± SD. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter med lignende resultater. (E-F) 7E behandling beskyttet mot bentap og redusert bein minsk tettheten i intratibial PC-3-injisert osteolytiske mus. PC-3-celler (2 x 10
5/100 ul) ble langsomt injisert i benmargen hulrom av tibia. Mus ble injisert i.p. med PBS, 7E (10 mg /kg), eller mIgG (10 mg /kg) (n = 5 i hver gruppe) tre ganger per uke. Friske kontroller ble ikke injisert med kreftceller. (E) Den tibial metafyse ble tatt fra friske kontroll mus og mus med PC-3-osteolyse. Representative mikro-CT er vist for hver gruppe. (F) tibial BMD ble målt, og resultatene uttrykkes i prosent sammenlignet med friske kontrollverdier. * P 0,05 versus mIgG kontroller. Data er vist som gjennomsnitt ± SD. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter med lignende resultater. BMD, bone mineral density; mikro-CT, mikro-computertomografi.
7E hemmet tumorindusert osteolyse i PC-3 prostatakreft xenografter
I utviklingen av prostatakreft, mange pasienter etter hvert utvikler benmetastaser . Basert på vår
in vitro
data, spekulerte vi at IL-20 kan fremme osteoclastogenesis ved å regulere sRANKL og cathepsin G uttrykk i prostatakreftceller. Derfor lurte vi på om hemme IL-20 vil redusere prostatakreft-osteolyse
in vivo
. PC-3 celler ble sprøytet inn i beinmargen hulrom av skinnebein i SCID-mus, som ble deretter injisert (intraperitonealt) med PBS, mIgG, eller 7E tre ganger per uke for de neste 7 ukene. Mikro-CT-skanninger, som brukes for å undersøke effekten av 7E på prostatakreft-osteolyse, viste at PC-3-kreft-osteolyse ble hemmet i den 7E-behandlede gruppe sammenlignet med mIgG- og PBS-behandlede grupper (Fig 7E) . BMD var betydelig lavere i mIgG- og PBS-behandlede kontrollgruppene enn i friske kontrollgruppen;
