Abstract
Sammensetningen av den menneskelige tarmfloraen er knyttet til helsetilstand. Målet var å analysere microbiota av normale og tykktarmskreftpasienter for å etablere kreftrelaterte dysbiosis
Pasienter og metoder
Krakk bakterielt DNA ble ekstrahert før koloskopi fra 179 pasienter. 60 med tykktarmskreft, og 119 med normal koloskopi. Bakterielle gener oppnådd ved pyrosekvensering av 12 avføringsprøver (6 Normal og 6 kreft) ble utsatt for et validert Principal Component Analysis (PCA) test. Den dominerende og subdominant bakteriell befolkningen (
C. Leptum
,
C. Coccoides
,
Bacteroides /Prevotella
,
Lactobacillus /Leuconostoc /Pediococcus grupper
,
Bifidobacterium slekten
, og
E. coli, etter og
Faecalibacterium prausnitzii
arter) ble kvantifisert i alle personer som bruker qPCR og spesifikke IL17 produsentceller i tarmslimhinnen ble karakterisert ved hjelp immunhistokjemi.
Funn
pyrosekvensering (Minimal sekvens 200 nucleotide leser) viste 80% av alle sekvensene kan bli tildelt totalt 819 taxa basert på standardparameteren Klassifiserings programvare. Fylogenetisk kjerne i Cancer individer var forskjellig fra den i normale individer i henhold til PCA-analyse, med en tendens til forskjeller i de dominerende og subdominant familier av bakterier. Derfor All-bakterier [log
10 (bakterier /g avføring)] i Normal og kreft personene var lik [11.88 ± 0.35 og 11.80 ± 0.56, henholdsvis (P = 0,16)], i henhold til qPCR verdier mens blant alle dominerende og subdominant arter bare de av
Bacteroides /Prevotella
var høyere (alle bakterie bestemt bakterie; P = 0,009) i Cancer (-1,04 ± 0,55) enn i Normal (-1.40 ± 0.83) personer . IL17 immunreaktive celler ble betydelig uttrykt mer i normal slimhinne av kreftpasienter enn hos de med normal koloskopi.
Konklusjon
Dette er den første store serier til å demonstrere en sammensetning endring i bakterieflora i tykktarmen kreftpasienter med mulig innvirkning på slimhinnene immunrespons. Disse data åpner ny arkivert for masse screening og patofysiologi undersøkelser
Citation. Sobhani jeg, Tap J, Roudot-Thoraval F, Roperch JP, Letulle S, Ella P, et al. (2011) Microbial dysbiosis i tykktarmskreft (CRC) Pasienter. PLoS ONE 6 (1): e16393. doi: 10,1371 /journal.pone.0016393
Redaktør: Sylviane Pied, Lille 2 University, Frankrike
mottatt: 12. september 2010. Godkjent: 14 desember 2010; Publisert: 27 januar 2011
Copyright: © 2011 Sobhani et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Cancéropole Ile de France, CoMiCa 2007-2010 prosjekt, (Charles Debray foreningen-ACD); LNCC (fransk National League mot kreft), CCR INSERM Promotion (2004-2006). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den menneskelige kolon inneholder opptil 10
14 bakterier [1]. De spiller en viktig rolle i gjæring av gjenværende mat, modulering av tarmimmunfunksjon, og beskyttelse mot patogener og sykdommer [2] – [5]. Selv om tarmfloraen er i stor grad gunstig, kan endringer i bakteriepopulasjoner eller i produkter av bakteriell metabolisme bidra til sykdom.
I 1971, en studie beregnet identifisere assosiasjoner mellom normalflora sammensetning og kolorektal kreftutvikling, men det hadde å bli forlatt på grunn av tekniske problemer. Senere, Moore og medarbeidere rapporterte at 13 bakteriearter var signifikant assosiert med høy risiko for tykktarmskreft og den vestlige kosthold [1]. Men resultatene var noe overbevisende fordi de etterforsket et lite antall fag og ingen intestinal etterforskning dvs. radiologi eller koloskopi ble utført. Likevel, siden denne undersøkelsen ble gjennomført, har den menneskelige colonic microbiota dukket opp som en viktig miljøfaktor som ser ut til å modulere risikoen for tykktarmskreft, og dysbiosis i tarmen bakterieflora er nå antatt å være en faktor bak utviklingen av sykdommen hos genetisk -predisposed enkeltpersoner. Imidlertid er det ingen bevis om dysbiosis virker faktisk forekommer i tykktarmskreft.
Bare et begrenset sett av bakteriestammene i naturen har blitt identifisert i menneskekroppen, og ca 80% av de humane bakterier identifisert ved molekylære verktøy dvs. metagenomic sekvensering, betraktes uncultivable [6]. Selv om noen utbredt bakteriearter hos normale individer er nå identifisert ved hjelp av hele genomet sekvensering [7], mer enn 60% av arten forblir ukjent, og det er ingen data på hvordan dysbiosis som eventuelt kan forekomme i kolon kreftpasienter. Dermed har DNA-sekvensering som er rettet mot hypervariable områder innenfor små ribosomale-subenhet RNA gener, spesielt 16S rRNA gener har gjort det mulig å karakterisere biologiske mangfoldet i bakterieflora, noe som kan føre til sykdommer (for en oversikt, se ref [8]). 16S rRNA-genet er et ribosomalt komponent som er konservert i alle bakterier, og det inneholder variable sekvenser der det gis artsspesifisitet. Ifølge denne teknikken dominerende taxa i den menneskelige tarmfloraen rapporteres å være
Clostridium leptum, etter C
lostridium coccoides,
Bacteroides /Prevotella
grupper og
Bifidobacterium
slekten [9]. Sanntids kvantitativ PCR (qPCR) tilnærming har blitt tilpasset for å evaluere disse bakteriestammene i et stort antall prøver [10] – [11], og endringer i bakterieflora komponentene kan nå studeres i forbindelse med helse /sykdomsstatus. Arter som er involvert vil påvirke eksperimentelle og metabolske studier med nye patofysiologi tilnærminger. For eksempel,
Bacteroides
populasjoner, og mer spesielt de av
Bacteroides fragilis
, har nylig blitt vist å produsere en metallprotease i kolon kreftpasienter, men ikke i kontroller [12]. Denne bakteriearter er blitt vist å indusere slimhinne regulatoriske T-celleresponser i tarmen som involverer TH17 cellerekruttering i dyr [13] – [14] antyder sterkt at de kan forandre homeostase av effektor hjelper-T-celle-populasjoner i tarmen [14] – [15].
Ved å bruke pyrosekvensering teknikk, rapporterer vi bevis for at tykktarmskreft sykdom er knyttet til dysbiosis hovedsakelig på grunn av en endring i dominerende og subdominant arter. Ved å bruke qPCR, sammenlignet vi tarmbakteriesamfunn i normale individer og i de med tykktarmskreft i den største serien så langt rapportert og viser nivået av dysbiosis på dominerende bakterieflora arter. Vi setter disse resultatene i perspektiv med slimhinneimmun homeostase og avføring markør for massescreening
Resultater
Kjennetegn på personer
De ble klassifisert som følger:. Normal (n = 119 ), som hadde normal koloskopi; de med kolon (n = 44) eller rektalt (n = 16) kreft (total n = 60). Pasienter med kreft var kjønns matchet (selvsagt to normalt for en kreft), men var 10 år eldre enn de med normal koloskopi (tabell 1) som i vår kohort (tabell S1 i Tilleggs File S1) i fordi påfølgende personer ble inkludert. Normale individer sjeldnere rapportert en tidligere personlig historie av polypper eller en historie med tykktarmskreft i familien, og ikke vise forskjell om BMI. Derfor, bortsett fra denne artikkelen og alder, ble de matchet for hoved andre egenskaper, inkludert BMI og mat eller medisin opptak med kreft pasientgruppen (tabell 1, Tabell S1 og figur S1 i Tilleggs File S1).
Fylogeni sak basert på taxon distribusjon
fra alle datasett, 1,210,781 trimmet sekvenser ble oppnådd og 978 710 av disse kan bli tildelt totalt 819 taxa (tabell S2 i Supplerende File S1). En vakuum, av data ble utført og ga tilstrekkelig representasjon av mangfoldet i tarmen mikrobielle samfunn (Tabeller S1, Tabell S2 og Figur S3 i Supplerende File S1). Vi identifiserte 18 bakterielle slekter med en overflod av mer enn 1%, og disse slektene inkludert 75% av sekvensene. Tretten av de 18 slektene (
Alistipes, Collinsella, Bacteroides, Lachnospira, Prevotella, Subdoligranulum, Dorea, Faecalibacterium, Roseburia, Coprococcus, Streptococcus, Bifidobacterium Hotell og
Ruminococcus)
samsvarer med menneskets tarm microbiota fylogenetisk kjerne [16]. PCAIV analyse viste også at ca. 5% av variasjonen kunne tilskrives sykdomsstatus for hver prøve (Normal versus Cancer; p 0,05), og den taksa indikativt for bakterieflora hos normale og kreft individer var tydelig skjelnes (figur 1 og Figur S2 i supplerende File S1). Videre er 55 ut av de 66 bakterielle arter som tilhører den tidligere beskrevne fylogenetisk kjerne ble påvist i disse prøver. Monte Carlo test viste at mer enn 7% av variasjonen ble påvirket av helsestatus (Normal versus Cancer; p 0,05). Variasjonen innen person var lav og ubetydelig sammenlignet mellom person-variant (figur 1 og tabell S4 i supplerende File S1).
Principal komponentanalyse, basert på 16S rRNA-gensekvensen overflod av 7 diskriminerer slekter som representerte minst 1% av bakterieflora overflod, ble gjennomført med 6 friske individer (N) og seks kreft * pasienter (Ca) med to gjentak (bemerket som mid1 og mid2). To første komponentene (PC1 og PC2) ble plottet og representerte 70,83% av hele treghet. Individer (representert ved deres prøve id) ble samlet og tyngdepunkt beregnet for hver klasse. * De har alle blitt valgt fra stadium I-II av TNM klassifisering (se også tabellene S2 og S3 og figurene S2 S3 i tilleggs File S1)
Sammenligning av bakterielle populasjoner i avføringen
All-bakterier tyder ikke avviker i Normal og kreft grupper (tabell 2), mens en signifikant forskjell ble observert for
Bacteroides /Prevotella
gruppe. Denne forskjellen var relatert til forhøyet nivå av disse bakteriene i kreft sammenlignet med normale grupper (tabell 2). Tar alle personer sammen
Bacteroides /Prevotella
gruppe tetthetsnivået ble ikke knyttet til alder eller BMI (r = 0,05; p = 0,46, se også figur S1 i supplerende File S1). Tar alle personer med kreft bakterienivåene ble ikke knyttet til tumorstørrelse eller svulst staging refererer til den internasjonale TNM klassifisering (Figur S1 i supplerende File S1) og små invasive karsinomer kan være assosiert med høye nivåer av bakteriell tetthet. Nivåene av
Bacteroides /Prevotella
gruppe ble ikke påvirket av andre pasientkarakteristika som alder, BMI, årsaken til koloskopi, den tidligere historie av polypper eller kreft i familien (tabell S1 i supplerende File S1), med størrelse eller plassering (venstre-versus høyresidig, eller rektal versus colon) av kreft (Tabell 2). For de andre dominerende eller subdominant bakterier dvs.
C. leptum
gruppe,
C. coccoides
gruppe,
Lactobacillus /Leuconostoc /Pediococcus
grupper,
Bifidobacterium
slekten,
E. coli, etter og
Faecalibacterium prausnitzii
arter, vi fant ikke noen forskjell mellom pasienter versus normal koloskopi individer.
IL17 immunceller og
Bacteroides
i slimhinnene
Disse cellene ble funnet infiltrere fleste tumorprøver (poengsum ++ til +++) og i
lamina propria
av homolog normal slimhinne (poengsum + til ++) i kreft pasienters vevsprøver mens de var sjelden, eller ikke påvist i den normale slimhinne (0 til +/-) i normale individer (figur 2). Ingen parametrisk statistisk test viste signifikant høyere IL17 immunostained celle score i normal slimhinne av tykktarmskreft pasienter enn i normal koloskopi individer (median +/- versus ++; p 0,5). Etter dobbel (CD3 og IL17) farging av seriesnitt vev, ble de fleste av IL17 immunreaktive celler funnet å være av CD3 markør i begge (Normal slimhinnen eller homologe til kreft normal slimhinne) tilfeller selv om alle CD3 cellene ikke ble immunostained med IL17 antistoff. Men IL17 /CD3 forhold i normal tykktarmsslimhinnen dukket ikke signifikant forskjellig mellom Normal og kreft koloskopi individer (figur 2C, D). Disse halv kvantitative immuncelle funn ble knyttet til spesifikke vev tilhenger
Bacteroides
tetthet (figur 3).
Bacteroides
genamplifisering produktet ble funnet 1000 ganger mer uttrykt i avføringen enn i tykktarm vevsprøver som avslørt av qPCR (figur 3B). Videre
Bacteroides
amplifikasjonsprodukt var signifikant høyere i tykktarmskreft pasientens vev (normal, så vel som tumor) enn i normale individer «vev som vurdert ved qPCR og avdekket ved gel-analyse (Figur 3 og Figur S4 i supplerende File S1). I pasienter med kolorektal kreft,
Bacteroides
genamplifisering produkt var betydelig høyere i svulstvev enn ved normal homolog vev (figur S5 i supplerende File S1).
Prøver fra de samme personene og colonic områder var legges DNA-ekstraksjon og PCR. Interleukin 17 (IL17) -immunoreactive celler i colonic vev ble hovedsakelig lokalisert i
lamina propria
i normalt vev [A: colonic normal slimhinne fra en normal person (høy forstørrelse x40 nederst), B: colonic normal slimhinne fra en pasient med tarmkreft (høy forstørrelse x40 nederst)] og infiltrert tumorvevet i en og samme person enn i B [C: IL17 imlmunoreactive celler infiltrerer tumoren med høy forstørrelse x40 nederst D: I dette dobbeltfarging IL17 og CD3, geit anti-humant IL-17-antistoff ble tilsatt før farging med Naphthol /Fast (red) etterfulgt av kanin anti-humant CD3-antistoff som ble åpenbart med DAB-substrat (brun); Dette viste at CD3 var ikke den eneste celle som produserer IL-17.
I normal enkeltes vev (A) gel migrasjon systemet viser
Bacteroides Twitter /Albumin forholdstall nær 1, mens de dukket høyere homolog normal (N) eller tumor (Ca) slimhinner i tykktarmskreft pasientens vev (B). Merk at
Bacteroides
genamplifisering produkt i avføringen er dramatisk høyere enn det som registreres fra slimhinnene DNA; forsterkning kalles den menneskelige Albumin gen.
Diskusjoner
Vi rapporterer forskjeller i tykktarmen microbiota i personer med tykktarmskreft kontra de med normal koloskopi. Vi viste at fordelingen av bakteriell slekter i microbiota variert, avhengig av sykdomsstatus og qPCR avdekket betydelig heving av
Bacteroides /Prevotella
befolkningen i kreftpasienter som syntes å ha sammenheng med forhøyet IL17 produserende celler i slimhinnene personer med kreft.
Denne studien sammenligner personer som opplever en normal eller syk koloskopi. Selv om de med en normal kolonoskopi ikke var friske frivillige, kan de anses å utgjøre en meningsfylt kontrollgruppe. Dette er fordi de ble tilfeldig valgt fra blant påfølgende personer som hadde blitt henvist til koloskopi som ble funnet å være normal. For å redusere skjevhet valgte vi 2 normale individer for en kreft saken. Deres egenskaper matchet de av pasientene i kreft gruppen, med unntak av deres alder og tilfeller av polypper eller kreft i slektninger. Aldersforskjeller reflektere de epidemiologiske data i litteraturen. Bakteriell dysbiosis funnet i vår studie var tydelig uavhengig av alder. Ingen av mikrobielle forskjeller observert i denne studien var knyttet til alder. En annen forskjell mellom saker og kontroller bekymringer høyere prevalens av svulster i tykktarm kreft pasientenes slektninger. Dette kan gjenspeile rolle miljøfaktorer heller enn germinal genetiske forandringer siden ingen av pasientene hadde stigmata av Lynch eller polypose adenomatøs familiære PAF syndrom sykdommer.
høy gjennomstrømming sekvense teknikker for normalflora har vesentlig bidratt til å avsløre en forskjell i bakterie fylogenetisk kjernen hos normale individer og de som lider av forskjellige sykdommer [7]. Men denne framgangsmåte ikke er kreft sykdom. For å verifisere om fylogenetisk kjerne var annerledes hos friske personer og kreftpasienter, har 16S rRNA gener blitt angrepet av pyrosekvensering som et alternativ til alle bakterier genomsekvensering. Faktisk kan den V3 V4-variable regionen av 16S rRNA anvendes for å tilveiebringe en bakteriell klassifisering av normalflora [17] på basis av pyrosekvensering. Ved å bruke denne teknologien, vi klart identifisert mer enn 40.000 informative sekvenser på V3-V4 16S rRNA-genet region fra hver avføringsprøve, i denne studien, og dette førte til byggingen av fylogenetisk kjernen av bakterieflora [16]. Denne fylogenetisk kjerne ble funnet å være forskjellig hos kreftpasienter versus normale individer. Forskjellene gjelder særlig dominerende og under dominerende bakteriepopulasjoner. Det er svært lite sannsynlig at forskjellene vi funnet av pyrosekvensering kan være epiphenomenal, siden alle pasienter ble inkludert gjennom en standardisert prosedyre (kjønn og alders matchet, vilkår for avføring prøvetaking og DNA-ekstraksjon) og sekvens likheter mellom duplikater (innen person-variant ) var meget høy. Følgelig hovedgrupper, slekten og arten av dominerende og under dominerende bakteriepopulasjoner, har blitt kvantifisert ved qPCR som nå rutinemessig brukt for å kvantifisere bakterie sammensetningen av bakterieflora av friske eller syke mennesker eller dyr [9], [18]. Tettheten av «all-bakterier» i avføringsprøver gjenspeiler ikke koloskopi funnene, selv om en (dvs .;
Bacteroides
) ut av de sju artene som er undersøkt her ble funnet å være høyere i kreft gruppe individer. Alle disse metodene er validert, og rutinemessig brukt [6]. Selv om pyrosekvensering teknikk, som bør betraktes som en halv kvantitative verktøy indikert mange andre bakterielle arter forandring, ble bare hoved dominerende og subdominant arter kvantifisert i den foreliggende studie av qPCR. Videre molekylære analyser inkluderer artsrelaterte forskjeller i sonde permeabilitet, og forsterkeregenskaper, og på grunn av den relativt lite antall prober tilgjengelig for å analysere de mange uncharacterized gut arter [19], kan vi ikke utelukke muligheten for at vi kan ha gått glipp annen vesentlig forskjeller i mikrobiell tetthet. Så dette bør ikke utelukke muligheten for forskjeller mellom pasientgrupper i form av bakterier taxa eller arter som nå kaller for videre undersøkelser på bakgrunn av high-throughput sekvense resultater for kreft og kontroll microbiota. RRNA-genet baserte sekvensering kan oppdage de dominerende medlemmer av samfunnet, men disse tilnærmingene kan ikke oppdage de sjeldne medlemmer av et samfunn med divergerende mål sekvenser. For å overvinne begrensninger av enkelt gen-baserte amplikon sekvensering av pyrosekvensering, og hel-genom hagle sekvensering fremkom som et attraktivt strategi for å vurdere kompleks mikrobiell diversitet i blandingskulturer [7]. Likevel er dette den største mikrobiologisk undersøkelse for å ha blitt rapportert så langt, og det store antall individer registrert med kjente koloskopi og histopatologiske egenskaper gjør det svært robust og kan åpne veien til nye pathophysiologic felt og nye screening markører.
Bakgrunnen for en sammenheng mellom
Bacteroides /Prevotella
gruppe tetthet høyde som vurderes av qPCR og ondartede colontumorer er ikke klart. Alle primere som brukes for qPCR i denne studien ble utformet for å kvantifisere dominerende og under dominerende arten som foreslått av pyrosekvensering tilnærming. Om slike mikrobiologiske forskjeller som finnes i denne studien er årsak eller konsekvens av svulst funn ved koloskopi bekymringer mekanistisk tilnærming som ikke er designet for å bli analysert her og krever prospektive studier. Men vi kan spekulere at
Bacteroides /Prevotella
gruppe tetthet er sannsynligvis ikke konsekvensen av svulst forekomst fordi deres nivå ikke var korrelert med tumorstørrelse eller sykdom iscenesettelse og
Bacteroides
slekten arter kunne påvises fra vasket slimhinner tyder det tilhører slimhinneheftbakteriegrupper. Primere vi utformet målrettet
Bacteroides Hotell og
Prevotella
genus populasjoner. Endringer i
Prevotella
er bare rapportert i den muntlige og mage hulrom [20] uten noen kobling med tumorvekst. I kontrast,
Bacteroides
slekten populasjoner og mer spesielt de av
Bacteroides fragilis
, har nylig blitt vist å gi en metallprotease i kolon kreftpasienter, men ikke i kontroller [12] tyder på denne arten sub befolkning kan favorisere kreftutvikling. Det er verdt å merke seg at blant de mange mekanismer som kan medierer assosiasjoner mellom bakterieflora og menneskers helse [21] – [22], pro-inflammatoriske og immuncelleaktivering i kolon mukosa er av stor betydning i forbindelse med malignitet. Noen medlemmer av tarmbakterieflora kan styre verts T-celle-responser [13], [15] andre kan opprettholde homeostase av effektor hjelper-T-celle-populasjoner i tarmen [14].
B. fragilis
har vist seg å indusere slimhinne regulatoriske T-celleresponser i tarmen som involverer TH17 cellerekruttering i eksperimentelle modeller [13] – [14]. Av interesse slimhinne-tilhenger
Bacteroides
arter i vår studie vises høyere i kolon kreftpasienter enn hos normale koloskopi individer i et forhold knyttet til slimhinne IL17 immunoreactive celletetthet. Dette er i tråd med vår tidligere studie i menneskelig som rapporterte TH17 celler overekspresjon i mer enn 80% av sporadisk tykktarmskreft mikro miljø [23]. IL17 immunreaktive celler infiltrere mer homolog normal kolon slimhinnene i tykktarmen kreftpasienter enn normalt vev i normale koloskopi personer som vurderes av immunhistokjemi eller mRNA qPCR kvantifisering fra slimhinnene (data ikke vist). Dette kan tyde på T-celle-aktivering kan være forbundet med slimhinne IL17 endring som følge av
Bacteroides
som rapportert i dyremodeller [13] – [14], [21] – [22]. Kort fortalt disse dataene argumenterte for en forstyrret immunrespons i tykktarm kreft vev med IL-17 over forverre [24] – [25] sykdommen trolig på grunn av
Bacteroides
Ekstra interessant. aspekt av microbiota er den potensielle verdien som en markør for tykktarmskreft siden flertallet av pasientene kunne identifiseres fra en høyde av
Bacteroides /Prevotella
befolkning med mulighet for en kvantitativ test en cut-off basert på en spesifisitet sats. Sammenlignet med koloskopi så langt de forhøyelser av
Bacteroides
i avføringen og /eller IL17 immunreaktive celler i den normale slimhinner synes å være lovende sensitive markører.
Metoder
fra september 2004 til september 2006, 648 personer med en gjennomsnittlig eller høyere enn gjennomsnittlig risiko for CRC (f.eks med historie av kreft i slektninger eller en personlig tidligere historie med polypper, eller abdominal eller intestinal relaterte symptomer eller anemi som krevde koloskopi), var som inngår i en prøvesamling bank studien. For å være kvalifisert for inkludering, pasientene måtte ha noen tidligere historie med kolon eller endetarms kirurgi, av sykdommer som kreft, eller av inflammatoriske eller infeksiøse skader i tarmen, og ikke til å trenge en nødsituasjon koloskopi. To uker før koloskopi, pasienter ble inkludert etter å gi informert samtykke, og ble bedt om å gi en frisk avføringsprøve innen 2 uker opp til tre dager før koloskopi. Studien ble godkjent av etisk komité av Val de Marne Paris-EST område som autorisert rekruttering av pasienter i alle tilknyttede sentre. Alle pasientene fikk informasjon om studien, sine mål, og prøver de skulle gi. All informasjon ble gitt av et maskinskrevet brev skrevet i har blitt oppnådd i et tre eksemplarer kopi skjema fransk og formell samtykke; En av disse var bevart av pasienten, holder vi en kopi ved Institutt for klinisk forskning (CIC) og den siste kopien er bevart av arrangøren (Statens institutt for vitenskapelig forskning i medisin-INSERM). Så, er en formell samtykke tilgjengelig for hver pasient. I alle tilfeller avføringsprøver ble samlet inn før tarmen rensing for koloskopi. Noen spesielle dietter (diabetikere, vegetarianere) og medisiner (anti-diabetiker medisiner, hypocholesterolemics og avføringsmidler) i løpet av denne perioden ble registrert. En anestesilege besøkte deltakerne minst tre dager før den planlagte koloskopi. Studieperioden fortsatte til koloskopi og patologi data hadde blitt sjekket, og den endelige status kan bli tildelt som «normal koloskopi», «Tumor ved koloskopi» eller «andre abnormiteter ved koloskopi». De ble holdt i en samling bio-bank for patofysiologi eller test screening studier, inkludert en rapportert her. Etter kjønn matchende mellom personer med tumor og normale koloskopier, prøver fra 180 pasienter (en kreftpasient for 2 person med normal koloskopi) som ble sjekket ikke ta antibiotika med enten «normale» eller «kreft» funn ble utsatt for bakterier DNA-analyse i nåværende serien.
Fekale prøver og bakterielt DNA ekstraksjon
Hele fersk avføring ble samlet i sterile bokser, og innen 4 timer 10 gr ble frosset ved -20 ° C, for analyse. Bakteriell DNA ble ekstrahert fra prøver av avføring, og etter den endelige utfelling, ble DNA resuspendert i 150 ul TE-buffer og lagret ved -20 ° C for videre analyse, slik som tidligere beskrevet [26].
pyrosekvensering analyse fra avføring
Bakteriell DNA-prøver fra 6 personer (3 hanner og 3 tisper blir tilfeldig valgt) med en normal koloskopi, og 6 alders- og kjønns matchet pasienter med invasiv CCR av trinn i eller II av TNM klassifisering , ble anvendt for å konstruere 12 DNA-biblioteker. De følgende universelle 16SrRNA primere ble anvendt for PCR-reaksjonen: V3F-drivsystemet (TACGGRAGGCAGCAG) [27] og V4R (GGACTACCAGGGTATCTAAT) [28] for å målrette V3 V4-regionen, noe som gir de laveste feilrater [29]
Strekkode sekvenser (GsFLX nøkkel) TCAG og MIDGsFLX (12 nukleotider) ble festet mellom 454 GsFLX adaptator sekvens og termin primer V3F-drivsystemet. Den GsFLX tasten og 454 GsFLX adaptator var festet til revers primer. Konsentrasjonen og kvaliteten av PCR-produktene ble vurdert med Picogreen for å oppnå like mengder av hver av prøvene (10
8-molekyler /mikroliter), og deretter 16S rRNA gense amplikonene ble sekvensert på en Roche GS FLX 454 sequencer ( Genoscreen, Lille, Frankrike) og behandlet med standard protokoll fra produsent (https://genoscreen.fr/). For å bekrefte tilstedeværelsen av spesifikke bakterielle arter i de 2 grupper av pasienter til tross for variasjoner som følge av tekniske prosess, ble hver DNA-prøve sekvensert i duplikat. Dermed 12 avføring bakterielle DNA-ekstrakter ble sendt til pyrosekvensering analyse, med to replikater av hver. Disse 24 sett med sekvenser ble sendt til intra individ og inter individuelle analyser og klassiske mangfold indekser ble beregnet. Vanlige sekvenser i to duplikater ble vurdert for hver enkelt; da inter individuelle og mellomgruppeanalyser ble utført i henhold til «Normal» versus «Cancer» status.
Kvantitativ PCR-analyse
Vi brukte en real-time qPCR teknikk for å undersøke forskjellen i bakterie tettheter innenfor microbiota mellom normale og kreftpasienters krakk (N = 179) og slimhinne DNA (N = 44). Primerne og probene som brukes i denne undersøkelsen, er blitt beskrevet andre steder [26], og er presentert i tabell S1 supplerende File S1. Real-time qPCR ble utført ved hjelp av en ABI 7000 Sequence Detection System med programvareversjon 1.2.3 (Applied-Biosystems, Foster City, CA, USA), og totalt antall bakterier ble utledet fra gjennomsnittlige standardkurver og uttrykt som log10 verdi, som tidligere beskrevet [26]. Verdier av qPCR ble oppnådd per pasient og for hver komponent av tarmfloraen (totalt n = 180 pasienter, 60 med kreft og 119 med normal koloskopi, en manglende prøve). For å overvinne det faktum at avføringsprøver kan inneholde mer eller mindre vann, vil dataene for hver fekal prøve ble normalisert som tidligere beskrevet [26]. Nivået funnet for hver enkelt dominant og sub-dominante bakteriepopulasjon ble subtrahert fra alle-bakterieinnhold, og resultatene er uttrykt som logaritmen av antall bakterier per gram avføring. Disse analyser ble anvendt for å sammenligne sammensetningen av tarmfloraen av de 179 individer og resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD i normal, og kreftpasientgrupper. I tillegg representant kolon (N = 32) eller rektalt (N = 12) normale vevsprøver fra 22 personer med normal tykktarm og 22 pasienter med tykktarms (N = 16) eller rektalt (N = 6) kreft ble sendt til DNA-ekstraksjon og qPCR kvantifisering ifølge den samme fremgangsmåten for å analysere slimhinne vedheftende bakterier komponent. Colonic eller rektal vev ble oppnådd etter kirurgi; stykker ble vasket og representative prøver ble konservert enten i formalin for histokjemi eller fryses inntil DNA-ekstraksjon for menneskelig albumin og
Bacteroides
PCR prosessen.
Immunohistochemistry
Vevsprøver ble valgt for hvert enkelt tilfelle (normale og kreft individer), og parafininnstøpte 4-um seksjoner ble anvendt og immunfarging ble utført i henhold til fremgangsmåter som er beskrevet tidligere [23], [30]. I korte trekk ble geite-anti-humant IL-17-antistoff (fortynnet 1:40) tilsatt i 2 timer, og deretter farging ble gjennomført ved bruk av (Vectastain kit AP fra Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), og viste ved naftol /Fast Red (Sigma-Aldrich). For å kvantifisere De immuncellene, ble fem godt orientert glide prøver /individ fra normale vev i enten kontroll eller tykktarmskreftpasienter undersøkt ved en forstørrelse på 400 x (for en 3 mm lang epitel prøven i hvert tilfelle). Merkede celler per millimeter ble bestemt ved anvendelse av en okulær gitter. Immunostained celler ble regnet med 10 sammenhengende felt og semi-kvantitativt scoret (som +/-, +, ++ eller +++) og klassifisert. For IL17 /CD3 dobbeltfarging, geit anti-humant IL-17-antistoff (fortynnet 1:40) ble tilsatt i 2 timer, og deretter farging ble foretatt ved bruk av Vectastain kit AP fra Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA), og avslørte av naftol /Fast Red (Sigma-Aldrich).
