Abstract
Tumor suppressor p53, som aktiveres ved ulike stress og onkogen aktivering, er et mål for anti-kreft narkotika utvikling . I denne studien ved screening paneler av protein kinase inhibitorer og protein fosfatase-inhibitorer identifiserte vi 5-Iodotubercidin som en sterk p53 aktivator. 5-Iodotubercidin er purinderivat og blir brukt som en inhibitor for en rekke kinaser inkludert adenosin kinase. Har vi funnet at 5-Iodotubercidin kan føre til DNA-skade, verifisert ved induksjon av DNA-brudd og foci positive for γH2AX og TopBP1, aktivering av Atm og Chk2, og S15 fosforylering og oppregulering av p53. Som sådan, induserer 5-Iodotubercidin G2 cellesyklus-stans i et p53-avhengig måte. Itu induserer også celledød i p53-avhengige og-Uavhengig oppførsel. DNA leiligheter ble sannsynligvis dannet ved inkorporering av 5-Iodotubercidin metabolitt i DNA. Videre har 5-Iodotubercidin viste anti-tumor aktivitet som det kunne redusere tumorstørrelsen i carcinoma xenograft musemodeller i p53-avhengige og-Uavhengig oppførsel. Disse funnene viser fem-Iodotubercidin som en roman gentoksisk stoff som har kjemoterapeutisk potensial
Citation. Zhang X, Jia D, Liu H, Zhu N, Zhang W, Feng J et al. (2013) Identifisering av 5-Iodotubercidin som Gentoksisk Drug med Anti-Cancer Potential. PLoS ONE 8 (5): e62527. doi: 10,1371 /journal.pone.0062527
Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA
mottatt: 17. desember 2012; Godkjent: 22 mars 2013; Publisert: 07.05.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (81130039, 31071229, og 81121001), Ministry of Science and Technology i Kina (The National Key Scientific Program (2012CB966901, til BL)), Shanghai Pujiang Program (10PJ1405000), Cheung Kong Scholars Program for Kunnskapsdepartementet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en av de viktigste årsakene til dødelighet over hele verden. Ifølge den nylig utgitte data, var det 12,7 millioner nye krefttilfeller og 7,6 millioner kreftpasienter døde i 2008, med brystkreft er mest vanlig hos kvinner og lungekreft mest vanlig hos menn [1]. Kreftbehandling omfatter kirurgiske prosedyrer for å fjerne ondartet vev og bruk av strålebehandling og kjemoterapi å drepe ondartede celler og /eller begrense tumorvekst. Kjemoterapeutiske legemidler er klassifisert i alkyleringsmidler, anti-metabolitter, topoisomerase-inhibitorer, plante alkaloider og terpenoider, anti-tumor-antibiotika, og andre [2]. Opp til nå, er det en mangel på sviktsikker behandling for de fleste typer kreft [3].
anti-metabolitter er derivater av nukleosider, inkludert pyrimidin-analoger. f.eks, gemcitabin og purinanaloger, f.eks, fludarabin [4]. De kan bli innlemmet i DNA, som fører til opphør av begynnende DNA-kjede forlengelse. Enkelte nukleosid-analoger kan også hemme involvert i DNA-syntese eller enzymer som opprettholder deoksynukleotider homeostase enzymer, noe som ytterligere interfererer med DNA-syntese. Som sådan, er mange av disse nukleosidanaloger føre til DNA-skade, inkludert dobbelt- og enkelttrådet DNA bryter for å utløse de indre forsvarsmekanismer for å drepe hurtig delende celler eller celler som gjennomgår aktiv DNA-reparasjon, eller forårsake cellesyklus-stans i S-fasen [4]. Dette er en viktig mekanisme som de fleste anti-metabolitter utføre sin anti-kreft aktivitet.
I celler, DNA-skade eller gentoksisk stoffet aktiverer en familie av PI3K som kinaser (PIKKs) inkludert Atm, Atr, og DNA- PKCS på DNA-bryter eller fastlåste replikering gafler, hvor de fosforylerer ulike proteiner inkludert γH2AX, TopBP1, Chk1 /2 og p53. Den integrerte aktiveringen av disse effektor proteiner induserer cellesyklusrest, cellebegynnende alderdom eller apoptose [5], [6]. Som et resultat, er celler med ustabil genomet eliminert, noe som forhindrer dannelse av tumorer [7] – [11]. ATM-p53 veien er en stor tumor undertrykker reaksjonsveien og p53 er mutert i mer enn 50% av de humane primære tumorer [12] -. [14]
p53-aktivering fremmer cellesyklus-stans, begynnende alderdom og apoptose. Aktivering eller opp-regulering av p53 i tumorer er blitt vist å hemme tumorvekst, etablere p53 som et mål for anti-kreft legemiddel utvikling [13], [15]. Flere små molekyl forbindelser har blitt utviklet som spesifikt retter MDM2-p53 interaksjon, stabilisere p53, og hemme tumorvekst. I tillegg kan p53 leveres til tumorer med virus, og dette har vist seg å ha betydelige terapeutiske effekter [16]. For å søke etter nye potensielle anti-svulst narkotika, skjermet vi lite molekyl hemmere av et panel av protein kinaser og et panel av protein fosfataser for forbindelser som kan aktivere p53 [17]. Her rapporterer vi identifisering av fem-Iodotubercidin (ITU) som en p53 aktivator. Itu blir brukt som en generell kinase-inhibitor, særlig adenosin kinase (ADK) på grunn av sin affinitet for ATP-bindingsseter for disse enzymene, og har vist seg å påvirke celle-proliferasjon og overlevelse. ADK katalyserer overføringen av γ-fosfat-gruppe fra ATP til adenosin, for derved å nedregulere de cellulære nivåer av adeninnukleotider [18] – [20]. ITU har en struktur som ligner på adenosin og ble vist her for å generere DNA-skader, aktivere ATM-p53 vei, og induserer cellesyklus arrest i G2 fase i p53-avhengige oppførsel. Itu fremmer også celledød i p53-avhengige og-Uavhengig oppførsel. Enda viktigere, ble Itu funnet å ha anti-tumoraktivitet, også i en p53-avhengige og-Uavhengig oppførsel. Disse resultater antyder at Itu er en potensiell kjemoterapeutisk middel med egenskaper som skiller seg fra de fleste andre anti-metabolitter. Siden Itu utfører sin anti-tumoraktivitet hovedsakelig via generering av DNA-skade, kan også forårsake Itu genom ustabilitet i normale celler og potensielt føre til utvikling av kreft. Dermed bør det utvises forsiktighet ved bruk av Itu for potensielle ikke-kreft relatert terapeutiske formål.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Dyreforsøk i denne studien, inkludert BALB /cASlac nakne mus, normale C57B /6 mus, ATM +/- mus, ble gjennomført i samsvar med anbefalingene i National Research Council guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, med protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Shanghai Kina [SYXK (SH) 2011-0112]. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelsene til mus
Cell Culture
Den primære museembryo fibroblast (MEF) celler (fra C57B /6 mus) og ATM -. /- MEFs (fra 129 mus ) ble samlet i laboratoriet som tidligere beskrevet [11]. Den menneskelige tykktarmskreft cellelinjer HCT116 (p53 + /+) og HCT116 (p53 – /-) var en gave fra B. Vogel laboratorium [21], [22]. Disse cellene ble dyrket i DMEM supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Hyclone) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2.
Western Blot analyse
Celler ble lysert i TNEN-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, og 0,1% Triton X-100) supplementert med 1 mM NaF, Na
2VO
3, 1 mM PMSF og 1 ug /ml aprotonin, leupeptin og pepstatin A. Proteinkonsentrasjonen konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved anvendelse av en Bio-Rad analyse. Proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore). Antistoffer mot p-Atm, p-Chk2 (Thr68), Chk2, p-p53 (Ser15), eller p53 ble hentet fra Cell Signaling. Antistoffer mot ATM (GTX70103) var fra Genetex. Antistoffer mot β-actin var fra Santa Cruz Biotechnology.
RNA Slå
Små forstyrrelser RNA (siRNA) rettet mot human ADK ble hentet fra GenePharma selskap og ble transfektert inn i HCT116 cellene følge produsentens protokoll. Nedregulering av ADK ble evaluert ved realtime PCR 72 timer etter transfeksjon. Sekvensene av siGENOME ADK SMARTpool var AGGGAGAGAUGACACUAUA; GGAGAGAUGACACUAUAAU; AAAGUUAU GCCUUAUGUUG; og GAGAGAUGACACUAUAAUG. Negativ kontroll UUCU CCGAACGUGUCACGUTT; ACGUGACACGUUCGGAGAATT.
Immunofluorescence histokjemi
MEFs eller HCT116-celler dyrket på dekkglass ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) to ganger og deretter fiksert i 4% paraformaldehyd (PFA), som ble permeabilisert med 0,1% Triton X i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. De primære antistoffer ble fortynnet i PBS med 1% BSA (1:200). Platene ble blokkert (1% BSA i PBS) i 60 minutter ved romtemperatur, inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C, og etterfulgt av sekundært antistoff inkubasjon i 60 minutter ved RT. Platene ble deretter montert og observert etter konfokalmikroskop.
RNA Utvinning og Realtime PCR
RNA fra celler ble hentet ved hjelp Trizol (Invitrogen). cDNA ble syntetisert ved hjelp av en Quantscript RT Kit (Tiangen). De mRNA-nivåer av interesse ble bestemt ved sanntids-PCR, og normalisert til nivåene av β-aktin. Realtime PCR ble utført ved bruk av Applied Biosystems 7500 system.
Cell Cycle Analysis
Celler ble sådd på 35 mm-retter og dyrket i 24 timer, og nådde 60-70% konfluens. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Itu i 24 eller 48 timer, høstet ved trypsinering, resuspendert i 200 ul PBS, og fiksert i 100% etanol over natten ved 4 ° C. De fikserte celler ble pelletert ved sentrifugering, resuspendert i 800 ul PBS inneholdende ribonuklease A (100 pg /ml) og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Da 10 mL propidiumjodid (PI, 4 mg /ml PBS) ble tilsatt til prøvene, som ble vurdert på en FACSCalibur fl ow cytometeret bruker Cell quest software (BD Biovitenskap).
Cell Survival analysen
å måle celle overlevelse etter Itu behandling ble cellene sådd ut i 1 x 10
4 i 96 brønners plater og dyrket over natten, som deretter ble behandlet med Itu i 48 timer. Celleproliferasjon reagens WST-1 (Roche) ble tilsatt til hver brønn, og ble ytterligere inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Absorbansen ble målt mot en kontroll ved hjelp av mikroplateleser ved 440 nm. Referanse bølgelengde var 630 nm.
Carcinoma Xenotransplantat musemodeller
Mann BALB /cASlac-hårløse mus (3 uker gammel) ble kjøpt fra Shanghai SLAC Forsøksdyr C. LTD. Musene ble holdt i SPF-mus anlegg for en uke før de ble podet med HCT116-celler. HCT116 (p53 + /+ og p53 – /-) celler ble høstet ved trypsinering, tellet og resuspendert i PBS ved en konsentrasjon på 5 x 10
7 /ml. Vi injisert subkutant 3 × 10
6 celler til BALB /cASlac naken mus rygg, med p53 + /+ celler på venstre side og p53 – /- celler på høyre side. Etter 2 uker ble musene delt i flere grupper og ble behandlet med Itu eller løsningsmiddel (PBS). Musene ble veid og størrelsen på tumoren målt. Lengden (L) og bredden (W) av tumoren ble målt ved hjelp av et digitalt skyvelære og uttrykt i tumorvolum (0,5 L x W
2, mm
3).
Genomisk DNA Analyse ved HPLC-MS
MEF celler og HCT116-celler i stasjonær eller logg fase ble behandlet med Itu for ulike tidsperioder. Genomisk DNA ble ekstrahert med fenol /kloroform, vasket grundig med 70% etanol, og deretter spaltet ved anvendelse av en tidligere rapportert fremgangsmåte med modifikasjoner [23]. I korthet, ble aliquoter av genomisk DNA inkubert med 1 pl DNase I (2 U /pl, NEB), 10 ul Snake Venom fosfodiesterase (0,26 mU /pl, Sigma Aldrich), og 2 pl Antarktis fosfatase (5 U /ul, NEB) over natten ved 37 ° C. Den komplette fordøyelse ga opphav til en blanding av mononucleosides, dømt av HPLC. Det fordøyde DNA-prøver ble analysert på en HPLC-MS system utstyrt med et Agilent C18-kolonne (Agilent, San Jose, CA, USA). Løsningsmiddel A var vann inneholdende 0,5% (v /v) maursyre og løsningsmiddel B ble metanol inneholdende 0,25% (v /v) maursyre. En elueringsprofil ble anvendt av 2-20% B over 30 min økende til 98% i løpet av ytterligere 20 min, deretter 98% B i 10 minutter, og endelig tilbake til 2% B over 20 min. Strømningshastigheten ble innstilt på 20 ul /min, og eluatet ble overvåket ved 254 nm. Vanligvis ble 5 pl av hver prøve injiseres ved hjelp av vel-plate-sampler.
Massespektrometrisk analyse av prøvene danner HPLC-systemet ble foretatt direkte med et Agilent ESI-TOF massespektrometer. Masse spektraldata ble registrert i positiv ion-modus i løpet av hele varigheten av HPLC-kjøringen. Data ble analysert ved hjelp Analytiker QS (Agilent, San Jose, CA, USA).
Analyse av Cellular dNTP Levels
En tidligere validert LC-MS /MS metode ble benyttet for å bestemme dNTP konsentrasjoner [24]. Standardoppløsninger av dATP og dGTP (dCTP og dTTP ble utelatt på grunn av tekniske vanskeligheter ved bruk av dette systemet) ved en konsentrasjon på 100 mmol /l ble anvendt for å konstruere en 0, 19,5, 39, 312,5, 625, 1250 og 2500 ng /ml standard kalibreringskurve.
cellene ble oppsamlet og ble resuspendert i 500 ul iskald 60% metanol, vortex-blandet, og plassert ved 95 ° C i 3 minutter og lydbehandlet i 30 s i en Branson Sonifier 450 ( Branson, Danbury, CT, USA). Ekstraktene ble sentrifugert ved 16000 g i 5 min ved 4 ° C for å fjerne cellerester og utfelte proteiner og DNA. De resulterende supernatanter ble ført gjennom preekvilibrert Amicon ultra-0,5-ml sentrifugal-filtre ved 4 ° C for å fjerne makromolekyler ( 3 kDa) ved å følge protokollen fra produsenten (Millipore, Billerica, MA, USA). Filtratet ble inndampet under sentrifuge vakuum ved -70 ° C og den resulterende pellet ble resuspendert i 25 ul nuklease-fri vann klar for å analysere eller lagret ved -80 ° C inntil bruk. Før HPLC-analyse ble prøvene vakuumtørket igjen, suspendert i 0,5 ml HPLC-H
2o som inneholdt to enheter av sur fosfatase (0,26 mU /pl, Sigma Aldrich) og ble inkubert i 30 minutter ved 37 ° C, å generere deoksynukleotider. 30 pl av prøven ble injisert inn i en Acquity UPLC (Waters, USA) HPLC-system som kjører termo C18-kolonne 100 x 2,1 mm, etterfulgt av partikkel 5 um kvadrupol tandem-massespektrometer (Applied Biosystems trippel QUAD 5500). Analyst 1.5.2.A trinngradient program ble anvendt for å separere alle analyttene med en strømningshastighet på 300 ml /min. Den mobile fase bestod av metanol (komponent A) og 20 mmol /l ammoniakk-acetat-buffer ved pH 4,5 (komponent B). Etter separering, ble analyttene i HPLC efferente innføres i massespektrometeret gjennom en TurboIonspray grensesnitt kombinert med en oppvarmet turbo nitrogenstrøm for å fordampe oppløsningsmidlene og for å øke effektiviteten ionisering. Følgende masse overganger ble overvåket-dA: 252,2 /234,1; dA1:252.2 /96,0; dG: 268,1 /232,1; dG1:268.1 /184,1; dG2:268.1 /124,1. A og A1 er derivater av dATP og G, G1 og G2 er derivater av dGTP.
Resultater
Identifikasjon av Itu som en p53 Activator
For å søke etter p53 aktivatorer, vi skjermet av western blot analyse et panel av kinase hemmere og et panel av fosfatase inhibitorer for å se etter kjente forbindelser som kan opp-regulerer p53 på protein nivåer (for listen over de hemmere, se tabell S1) [17]. Primære MEFs ble anvendt for screening fordi cellelinjer som vanligvis bærer mutasjoner i p53 og /eller dets oppstrøms regulatorer. Disse inhibitorene ble tilført ved 10 uM, konsentrasjonen anbefalt av produsenten for inhibering av kinaser eller fosfataser. To forbindelser av de 113 inhibitorene var i stand til å indusere p53-ekspresjon på proteinnivå. Det ene er 5-Iodotubercidin (fig. 1 A), en forbindelse som anvendes som en inhibitor for adenosin kinase og andre kinaser så som Erk2. Itu har vist seg å ha antikonvulsiv aktivitet og [19]. Itu-indusert p53 oppregulering ble observert i både MEFs og HCT116, med det sistnevnte er et koloncancer cellelinje positive for p53 (fig. 1B og 1C). Doserings eksperimenter indikerte at Itu var i stand til å opp-regulerer p53, ved konsentrasjoner så lave som 0,25 uM (fig. 1B og 1C).
A. Strukturer av Itu, adenosin, og fludarabin. B. Western blot viser at Itu opp-regulerer p53 i MEFs på en doseavhengig måte. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Itu i 8 timer, og nivåene av p53 ble analysert ved western blot. C. Western blot viser at Itu opp-regulerer p53 i HCT116-celler på en doseavhengig måte. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Itu i 8 timer, og nivåene av p53 ble analysert ved western blot. En lengre-eksponerte filmen ble også vist for å indikere at p53 ble uttrykt i HCT116-celler i det basale nivå. D. Knock-down av ADK ikke aktiverer p53. Venstre panel: reduksjon av ADK mRNA i nærvær av ADK siRNA; Høyre panel. Protein nivåene av p53 i nærvær av kontroll og ADK siRNA i HCT116 cellene
Hvordan Itu indusere p53 oppregulering? p53 uttrykk er oppregulert av ulike stress og onkogen aktivering, spesielt gentoksisk spenning [25]. Siden Itu er en mye brukt hemmer av ADK, som spiller en avgjørende rolle i adenosin homeostase [26], [27], er det mulig at Itu forstyrrer adenosin homeostase, forstyrrer DNA-syntese og forårsaker DNA-skade og aktiverer dermed p53. Hvis dette er sant, ville slå ned ADK ligne ADK hemming med Itu i opp regulerende p53. Vi brukte samlet siRNA å slå ned ADK i HCT116-celler (fig. 1D, venstre panel), og fant at reduksjon av ADK nivåer, i motsetning til hemming av ADK med Itu, ikke signifikant påvirker protein nivåer av p53 på basalnivå ( fig. 1D, panel til høyre), noe som tyder på at Itu-indusert p53 oppregulering er ikke sannsynlig forårsaket av direkte hemming av ADK.
Itu Årsaker DNA Damage
ITU har en purin-lignende struktur med «NH» blir erstattet av «CI» i 7
th stilling av purinnukleosid (fig. 1A). Itu kan bli inkorporert i DNA etter å ha blitt omdannet til deoksyribose av ribonukleotid-reduktase [4]. Itu teoretisk kunne danne 2 hydrogenbindinger med tymidin i dobbelttrådet DNA (fig. S1). Imidlertid kan ITU-T sammenkobling forårsake et avstands problem som «C-I» av Itu (posisjon 7) er mye større enn «N-H» av adenosin, og endret purine ring kan ikke være gjenkjennelig med DNA-polymeraser. Videre «C-I» av Itu er ganske aktiv og ustabil. Itu er således sannsynlig å bli metabolisert, og deretter inkorporert i DNA for å forårsake DNA-skade. For å bekrefte dette, må vi først testet om Itu kunne endre Karyotyper av HCT116-celler. Cellene ble først behandlet med Itu i 36 timer og deretter med spindelen gift kolkisin å kondensere kromosomene. Antallet og utseende av kromosomene ble analysert under et lysmikroskop etter gimsa farging. Det er åpenbart at Itu behandling førte til fremkomsten av ødelagte kromosomer i 32% av Itu-behandlede celler i forhold til 0% i ubehandlede celler (fig. 2A), noe som tyder på at Itu kan føre til dobbelttrådet DNA pauser.
EN. Representative bilder av Karyotyper av HCT116 i fravær eller nærvær av Itu. B. Påvisning av Itu derivat i genomisk DNA i å kopiere celler. HPLC-MS-analyse av Itu metabolitter i det genomiske DNA av Itu-behandlede celler. Genomisk DNA ble isolert fra Itu-behandlede celler og spaltet til nukleosider, som ble analysert med HPLC (venstre panel), som ble direkte knyttet til massespektrometer. MS analyse av molekylet med størrelsen på DTU ble vist på høyre panel. C. intracellulære dATP og dGTP bassengene ble ikke påvirket av Itu behandling. A og A1 er derivater av dATP og G, G1 og G2 er derivater av dGTP.
Noen av cellegifter virker ved å interkalere DNA (f.eks doxorubicin) eller tverrbinding DNA (f.eks cisplatin), mens nukleosidanaloger generere DNA pauser ved å bli innlemmet i DNA og forstyrrende nucleotide sammenkobling. For å teste hvorvidt Itu kan bli metabolisert og inkorporeres i genomisk DNA i løpet av replikasjon, direkte vi analyserte nukleotider avledet fra genomisk DNA isolert fra Itu-behandlede celler som enten var i den stasjonære fase eller den log-fase, med HPLC-massespektrometer. Identiteten av nukleosidene ble bekreftet ved å sammenligne med tilsvarende referansestoffet. Itu (MW 392,153) kan metaboliseres til deoxy-iodotubercidin (dITU, MW 376,154), tubercidin (TU (med ustabil -I fjernet), MW 266,257), og deoksy-tubercidin (DTU, MW 250,257). Vi først sammenlignet nukleotider avledet fra det genomiske DNA av HCT116 og MEFs og fant at HCT116 viste en mye mer komplisert spektrum av nukleotider og deres derivater liknet med MEFs, hvilket antyder at metabolismen nukleotider kan bli endret i kreftceller. Vi bestemte oss for å bruke MEFs å teste om Itu derivater er innlemmet i DNA. Vi fant at DTU var til stede i det genomiske DNA av Itu-behandlede log-fase celler, men ikke i stasjonære celler eller ubehandlede celler (fig. 2B). Disse resultatene tyder på at Itu metaboliseres (med -I fjernet) og innlemmet i DNA.
Flere studier har vist at purinanaloger slik som fludarabin, og klofarabin kunne inhibere ribonukleotid-reduktase, et enzym som katalyserer omdannelsen av ribonukleotider til deoksyribonukleotider, og dermed redusere nivåene av cellulære dNTP og forstyrrer DNA-syntese [4]. Vi har funnet at behandling med Itu ved doser som er tilstrekkelige til å oppregulere p53 viste ingen effekt på mRNA-nivåene av ribonukleotidreduktase. Vi sammenlignet også bassenger av dATP og dGTP, som er produkter av ribonukleotidreduktase, i kontroll og ITU-behandlede celler med massespektrometri følgende en etablert protokoll, og funnet ut at Itu behandling ikke påvirke bassenger av dATP eller dGTP i cellene ( fig. 2C). Disse funnene tyder på at Itu ikke hemmer ribonukleotidreduktase.
For å validere dette funnet, vi behandlet HCT116 og MEFs med Itu for 8 timer og analysert dannelsen av DNA-skader indusert atombrennpunkter, som er foreslått som DNA-skader og reparasjon sentre [28], [29]. Blant de tidligste proteiner samlet på DNA pauser er γH2AX, en histon H2A variant som er allestedsnærværende uttrykt. Det kan bli fosforylert av Pikk medlemmer som ATM og ATR raskt etter DNA-skade [30]. Vi fant at Itu behandling resulterte i en opphopning av kjernefysisk foci positivt for γH2AX både HCT116 (10,39 ± 1,82% for ubehandlede celler vs. 90,19 ± 2,21% for Itu behandlede celler) og MEFs (7,45 ± 0,29% for ubehandlede celler vs. 91,63 ± 0,73% for Itu behandlede celler) (fig. 3A og 3B). Videre Itu behandling resulterte også i en opphopning av kjernefysisk foci positivt for TopBP1, en annen foci-lokaliserte protein, i HCT116 (14,25 ± 5,12% for ubehandlede celler vs. 95,24 ± 1,39% for Itu behandlede celler) og MEFs (13.08 ± 5.15% for ubehandlede celler sammenlignet med 93,32 ± 2,70% for Itu behandlede celler) (fig. 3A og 3B).
A. Behandling av HCT116 med en mikrometer av Itu for 8 timer induserte atom foci positivt for γH2AX, TopBP1, og aktivert atm. Koffein behandling redusert dannelsen av disse foci. HCT116-celler ble forbehandlet med koffein (5 mM) i 1 time og deretter Itu ble tilsatt til kulturene for 8 flere timer. Celler ble den faste og farget for γH2AX, TopBP1, eller p-Atm. B. Behandling av MEFs med en mikrometer av Itu for 8 timer indusert atom foci positivt for γH2AX, TopBP1, og aktivert atm.
Itu Aktiverer Atm
I tillegg til foci positivt for γH2AX og TopBP1, Itu behandling resulterte også i atom foci positivt for p-Atm (10.13 ± 2.88% for ubehandlede celler vs. 85,84 ± 4,63% for Itu behandlede celler) (S1981 fosforylering, en indikasjon på Atm aktivering) (fig. 3A og 3B) [31], noe som indikerer at Itu forårsaker DNA-skade og aktiverer Atm. I samsvar med denne observasjonen, Itu-indusert p-kontroll og γH2AX foci formasjon i HCT116 cellene kan bli redusert (ned til 15,37 ± 1,15% og 9,00 ± 1,19% henholdsvis) ved behandling med koffein, en hemmer av ATM og ATR (Fig. 3A ). For å underbygge funn som Itu aktiverer Atm, brukte vi western blot å analysere Atm S1981 fosforylering, samt Atm-mediert Chk2 fosforylering. Selv om Atm er antatt å være kun aktiveres av dobbelttrådet DNA pauser [7], [31], [32], nylige studier viste at nukleosid-analoger kan også aktivere Atm så vel som dens nedstrøms trasé [30], [33], [ ,,,0],34]. Atm er funnet å være lokalisert på de fastlåste replikering gafler og kan bidra til å hindre gaffel kollaps i cellene [30], [33]. Vi fant at Itu behandling førte til en tidsavhengig fosforylering av S1981 fra Atm samt Chk2 fosforylering ved Thr68 i HCT116-celler (fig. 4A). Itu behandling førte også til Ser15 fosforylering av p53 (fig. 4A), som er utført av PIKKs også. Tilsvarende Itu kunne stimulere p53 fosforylering og Chk2 fosforylering i MEFs (Fig. 4B). Disse resultatene støtter videre den konklusjonen at Itu forårsaker DNA-skade og aktiverer atm.
A. HCT116 cellene ble behandlet med 1 mikrometer Itu for ulike tidsperioder og aktivering av Atm, Chk2, og p53 ble vurdert med western blot bruke spesifikke fosfo-antistoffer. B. MEFs celler ble behandlet med 1 mikrometer Itu for ulike tidsperioder og aktivering av Atm, Chk2, og p53 ble vurdert med western blot bruke spesifikke fosfo-antistoffer.
Itu Førte til S fase Extension og G2 /M arrest i et p53-avhengig måte
Mange nukleosidanaloger forårsake cellesyklus-stans i S-fasen med unntak som 20-C-cyano-20-deoksy-1-β-D-arabino- pentofuranosylcytosine (CNDAC), noe som fører til cellesyklus-stans i G2-fasen [4], [35]. Innlemmelse av nukleosidanaloger opphører forlengelsen av begynnende DNA-tråden og fører til steiling av replikering gafler. For å teste om Itu aktiverer cellesyklus sjekkpunkter, behandlet vi p53 + /+ og p53 – /- HCT116-celler med ulike konsentrasjoner av Itu i 24 eller 48 timer. Det ble funnet at 24-timers behandling med høye konsentrasjoner av Itu førte til en moderat økning i andelen av S-faseceller, noe som ble ledsaget med en reduksjon i prosentandelen av G1 faseceller, uten vesentlig å endre prosentandelen av G2 /M fasen -celler (fig. 5A og 5B). Når cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Itu i 48 timer, ble flere celler i G2-fasen, ledsaget av en nedgang i G1 fase, men ingen vesentlig endring i prosentandelen av S-faseceller (Fig. 5C og 5D). En forklaring er at cellene var i utgangspunktet fast i S-fasen, men klarte å passere gjennom S-fasen og ble til slutt blokkert i G2 /M-fasen. Dermed aktiverer Itu hovedsakelig G2 sjekkpunkt. Dette er i motsetning til de fleste av nukleosidanaloger, noe som fører til S-fasen cellesyklus-stans [4], og ioniserende stråling (IR), som induserer cellesyklus-stans ved G1 og G2 fase og er ledsaget av en reduksjon i S-fasen i HCT116-celler [21]. I fravær av p53, 24-timers-behandling resulterte i en innledende økning i S-fasen ved høyere doser av Itu (Fig. 5A og 5B), men likevel 48 timer etter behandling, forskjellen mellom kontroll og behandlede celler ble minimal (Fig . 5C og 5D), noe som indikerer at p53 – /- HCT116-celler, men ikke p53 + /+ HCT116-celler, gjennomgå S fase arrest og at p53 – /- celler klarte å rømme dette sjekkpunktet. Videre p53 – /- celler viste ikke en G2 fase arrest (Fig. 5A og 5B). Disse resultatene indikerer at Itu-indusert G2 fase arrest krever tilstedeværelse av p53.
A. HCT116 (p53 + /+ og p53 – /-) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Itu i 24 timer. Cellene ble fiksert, farget med PI, og analysert med FACS. Prosent av celler i ulike faser ble vist. B. Representative cellesyklus profiler av p53 + /+ og p53 – /- HCT116 i nærvær av 2,5 uM av Itu i 24 timer. C. HCT116 (p53 + /+ og p53 – /-) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Itu i 48 timer. Cellene ble fiksert, farget med PI, og analysert med FACS. Prosent av celler i ulike faser ble vist. D. Representative cellesyklus profiler av p53 + /+ og p53 – /- HCT116 i nærvær av 1,0 uM av Itu i 48 timer
Itu induserer p53-avhengig og-uavhengig celledød
.
p53 har en sterk proapoptotiske rolle, og det har blitt godt etablert at DNA-skade induserer celledød hovedsakelig gjennom ATM-p53 pathway. Vi testet cytotoksisitet av Itu i HCT116 og involvering av ITU-indusert p53 oppregulering. Itu behandling resulterte i celledød i p53 + /+ HCT116-celler (EC50 = 1,88 uM), men p53 – /- HCT116-celler viste resistens mot Itu-indusert celledød (EC50 = 7,8 pM) (figur 6A.), Noe som antyder en viktig rolle for p53 i mediering Itu-indusert celledød. Videre Atm mangel, som er kjent for å redusere p53 induksjon, også hemmet Itu-indusert celledød i MEFs (Fig. 6B) [36], i overensstemmelse med godt akseptert rolle for Atm i å fremme celledød i henhold genotoksiske stress. Den mindre enn fullstendig redning av celledød ved p53 mangel antyder at Itu kan ha cytotoksisitet som er uavhengig av p53, for eksempel ved inhibering av pro-overlevelse signalering, for eksempel Erk2.
A. HCT116-celler (p53 + /+ og p53 – /-) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Itu i 48 timer, og antallet celler ble målt ved hjelp av Wst-1-assay. * P 0,05 når p53 – /- celler ble sammenlignet med p53 + /+ -celler. B. Atm + /+ og Atm – /- MEFs ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Itu i 48 timer, og antallet celler ble målt ved hjelp av Wst-1-assay. * P 0,05 når Atm – /- celler ble sammenlignet med Atm + /+ -celler. C. villtype og p53 – /- HCT116-celler behandlet med Itu i 24 timer, og antallet celler ble målt ved Wst-1-assay. Itu ikke indusere celledød når cellene ble dyrket i 0,1% serum eller sammenflytende i villtype HCT116-celler. * P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler
Mange av nukleosidanaloger kreve DNA inkorporert å utføre sin cytotoksiske effekt.. For ytterligere å teste den cytotoksiske effekt av Itu på ikke-delende celler, dyrkes vi HCT116 enten til stasjonær fase, eller i nærvær av 0,1% serum i 24 timer, med de fleste av cellene være i G1 fase. Under disse betingelser, Itu mislyktes i å drepe cellene (Fig. 6C), noe som tyder på at Itu trenger å bli innlemmet i DNA for å utføre sin cytotoksisk aktivitet. Dette er konsistent med vår observasjon at Itu metabolitt er til stede i det genomiske DNA i replikerende celler (Fig. 2B).
imidlertid strømningscytometri-analyser viste ingen signifikant økning i de sub-G1 faseceller, en angivelse av apoptotiske celler, etter 24 eller 48 timer med Itu-behandling med forskjellige doser (fig. 5B og 5D). Dette er i motsetning til IR eller HADC (histon deacetylases) inhibitor MGCD0103, noe som førte til en markert økning i sub-G1 fase i HCT116-celler [21], [37]. Dessuten ble det ikke DNA stiger observert etter Itu behandling (data ikke vist).
