Abstract
Lungekreft er fortsatt den vanligste årsaken til kreftrelatert dødelighet. Vi brukte et svært multiplekset proteomikk teknologi (SOMAscan) for å sammenligne protein expression signaturer av ikke småcellet lungekreft (NSCLC) vev med friske tilstøtende og fjerne vev fra kirurgiske reseksjoner. I denne første rapporten om SOMAscan påført vev, merker vi 36 proteiner som viser de største uttrykk forskjeller mellom matchet tumor og ikke-tumorvev. Konsentrasjonene av tyve proteiner øket og seksten redusert i tumorvev, tretten som er nye for NSCLC. NSCLC vev biomarkører identifisert her overlapper med en kjerne sett identifisert i en stor serum-basert NSCLC studie med SOMAscan. Vi viser at storskala komparativ analyse av protein uttrykk kan benyttes for å utvikle nye histokjemiske prober. Som forventet, relative forskjellene i proteinekspresjon er større i vev enn i serum. De kombinerte resultatene fra vev og serum presentere den mest omfattende utsikt til dags dato av de komplekse endringene i NSCLC protein uttrykk og gir viktige implikasjoner for diagnose og behandling
Citation. Mehan MR, Ayers D, Thirstrup D, Xiong W , Ostroff RM, Brody EN, et al. (2012) Protein underskrift Lung Cancer vev. PLoS ONE 7 (4): e35157. doi: 10,1371 /journal.pone.0035157
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italia
mottatt: 28 november 2011; Godkjent: 09.03.2012; Publisert: 11 april 2012
Copyright: © 2012 Mehan et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: SomaLogic finansiert den proteomikk biomarkør forskning. SomaLogic hadde en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, og utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: M Mehan, D Ayers , D Zichi, R Ostroff, E Brody, J Walker, L Gold, T Jarvis, N Janjić og S Wilcox er heltidsansatte i SomaLogic. D Thirstrup og G Baird har fått forskningsmidler fra SomaLogic. Disse interessene endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
progresjon fra sunn tilstand til sykdommen er ledsaget av endringer i protein uttrykk i berørte vev. Sammen avhør av den menneskelige proteomet hos friske og syke vev kan tilby innsikt i sykdomsbiologi og føre til oppdagelsen av nye biomarkører for diagnostikk, nye mål for terapeutisk intervensjon, og identifisering av pasienter som mest sannsynlig å dra nytte av målrettet behandling. Spesielt er nye diagnostikk for tidlig påvisning av lungekreft presserende behov. For formålet med behandling og prognose, er lungekreft klassifiseres som enten patologisk liten celle (15%) eller ikke-småcellet (85%). Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall, hovedsakelig fordi 84% av tilfellene er diagnostisert på et avansert stadium, med en fem-års overlevelse på mindre enn 15% [1] – [3]. Worldwide i 2008 ble 1,5 millioner mennesker diagnostisert og 1,3 millioner døde – en overlevelsesrate uendret siden 1960 [4]. Men pasienter diagnostisert med NSCLC på et tidlig stadium og behandles kirurgisk å fjerne sine svulster oppleve en 86% fem års overlevelse [1], [2].
Vi har nylig utviklet en ny affinitet-basert proteomikk teknologi for biomarkører som i dag måler over 1000 proteiner fra små prøvevolumer på plasma eller serum (f.eks ~ 10 mL av plasma) med lave deteksjonsgrenser (medianverdi på 300 fM), 7 logger av totale dynamiske området (~ 30 fM – 1 mikrometer ved hjelp av prøvefortynning), og 5% median variasjonskoeffisient [5]. Denne teknologien, som kalles SOMAscan, er aktivert som SOMAmers (Slow Off-rate Endret aptamerer), en ny klasse av proteinbinding reagenser som inneholder kjemisk modifiserte nukleotider, som i stor grad utvide fysio mangfoldet av nukleinsyre bibliotekene. Slike modifikasjoner innføre funksjonelle grupper som ofte finnes i protein-protein interaksjon, antistoff-antigen-vekselvirkninger, og interaksjoner mellom små-molekyl narkotika med sine protein mål, men er fraværende i naturlige nukleinsyrer. Disse modifikasjonene er kompatible med SELEX (Systematisk Utviklingen av ligander ved eksponentiell Enrichment) prosess som brukes til å lage SOMAmers i tillegg til standard DNA-metoder inkludert PCR og hybridisering. Totalt sett er bruken av disse endringene utvider utvalget av mulige mål for SELEX, resulterer i økt bindende egenskaper, og legger til rette for valg av SOMAmers med langsomme dissosiasjon priser [5].
SOMAscan er en høyt multiplekset plattform for kvantitativ måling proteiner i komplekse matrikser så som plasma eller serum, hvor en signatur av proteinkonsentrasjoner er transformert inn i en tilsvarende DNA-signatur, som deretter kvantifisert på en kommersiell DNA mikroarray plattform [5]. I korthet, blir likevekt binding mellom en blanding av SOMAmers og proteiner oppnådd i oppløsning, etterfulgt av fjerning av ubundne art ved suksessive kule-baserte immobilisering trinn sammen med grundig vasking. Høy spesifisitet, allerede et iboende trekk ved SOMAmers, er i tillegg forsterket med inkluderingen av dekstransulfat under bindende og vasketrinn. Dekstransulfat, som i likhet med nukleinsyrer er et polyanion, er effektiv fordi beslektede SOMAmer-proteinkomplekser er mer kinetisk stabil enn ikke-spesifikke komplekser. Ved slutten av forsøket, bestemte SOMAmer-proteinkomplekser forbli hvorfra SOMAmers kan elueres i henhold denaturerende betingelser, hybridisert på kommersielt tilgjengelige mikromatriser, og direkte kvantifisert gjennom en fluorofor kovalent bundet til den SOMAmer. I hovedsak tar analysen nytte av doble natur SOMAmers som begge kastet bindingsentiteter med definerte former og unike nukleinsyresekvenser gjenkjennelige av bestemte hybridisasjonsprober. Nytten av denne analyse er vist tidligere i samtidige målinger av et stort antall proteiner som strekker seg fra lav picomolar til høy mikromolar konsentrasjon i plasma og serum, og kliniske biomarkør studier av kronisk nyresykdom og lungekreft [5], [6].
Resultater
proteomikk analyse av NSCLC kirurgiske reseksjoner
i denne rapporten utførte vi i stor skala protein uttrykk analyse av homogenis lunge vevsprøver fra kirurgiske reseksjoner innhentet fra åtte ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter. Alle NSCLC var røykere, som varierer i alder fra 47 til 75 år diagnostisert med patologi-bekreftet NSCLC etapper IA gjennom IIIB (tabell 1). Vi fikk tre prøver fra hver reseksjon: svulst vevsprøve, ved ikke-svulstvev (innen 1 cm av svulsten) og fjern uninvolved lungevev (lengst kanten av reseksjon fra svulsten). Man sørget for å bevare integriteten av vevet, med alle prøvene som blir frosset i løpet av 5-10 minutter etter eksisjon. Totalt proteinkonsentrasjonen ble justert og normalisert i hvert homogenat for proteomikk profilering etterfulgt av analyse på våre biomarkører array å måle konsentrasjonene av 820 humane proteiner som nylig beskrevet [5].
Disse protein konsentrasjonsmålinger, uttrykt som relative fluorescensenheter (RFU), tillate store sammenligninger av protein signaturer blant prøver (fig. 1). Vi først sammenliknet protein expression nivåer mellom de tilstøtende og fjerne vevsprøver for hver pasient (fig. 1A). Alt i alt, de signaler som genereres av de fleste analyttene var tilsvarende i tilstøtende og fjerne vev. I denne sammenligningen bare en analytt (fibrinogen) oppviste mer enn en to-gangers forskjell mellom de to kontrollprøver. Fibrinogen-konsentrasjonen var høyere hos tilstøtende ikke-svulstvev enn fjernt ikke-tumorvev. Fibrinogen er den oppløselige forløper av fibrin, som omdannes ved hjelp av trombin i løpet av koagulering. Fibrin avleiringer forekommer i tilstøtende stroma i de fleste tumorer, først og fremst i den ekstracellulære matriks (ECM) hvor fibrin og andre ECM-proteiner fremme og støtte tumorvekstprosesser, inkludert, celleproliferasjon, adhesjon, invasjon, migrering og angiogenese [7].
signalforskjeller mellom nærliggende og fjerntliggende vev (felt A), tumor og tilstøtende vev (felt B) og tumor og fjerne vev (felt C) er uttrykt som log
2 median forholdstall. Den stiplede linje representerer to ganger endring (log
2 = 1).
I motsetning til dette, sammenligning av tumorvev med ikke-tumorvev (ved siden av eller fjernt) identifisert 11 (1,3%) proteiner med mer enn fire-gangers forskjeller og 53 (6,1%) med proteiner som er større enn to ganger forskjellen (fig. 1B og 1C). De resterende (93,9%) proteiner viste relativt små forskjeller mellom svulst og ikke-svulstvev. Noen proteiner ble betydelig undertrykt mens andre ble forhøyet i tumorvev i forhold til tilstøtende eller fjerne vev. Differensiell ekspresjon av proteiner mellom tilstøtende og tumorvev, eller mellom distal og tumorvev, var lik samlet. Endringer i mellom tumor og distale vev ble vanligvis noe større i forhold til tumor og tilstøtende vev (fig. 1), noe som viser at de fleste forandringer observerte protein er spesifikke for den lokale tumormiljøet. Figur 2 viser et varme kart fremstilling av resultatene. Det var en trend med proteinforandringer som reflekterer patologisk stadium, noe som kan tyde på at protein uttrykk korrelerer med sykdomsbyrde. Gitt den lille størrelsen på utvalget, korrelasjoner med histologisk klassifikasjon kunne ikke være frikoplet fra scenen.
Prøvene vises i kolonner og separert i fjernt ikke-tumor, ved ikke-tumor, og tumorvev. Innenfor hver vevstype, er prøvene delt inn adenokarsinomer (AC) eller plateepitelkarsinom (SCC). Tallene over hver kolonne tilsvarer pasient koder. Proteinene vises i rader og ble beordret til å bruke hierarkisk clustering.
Biomarker identifikasjon
For å identifisere potensielle NSCLC vev biomarkører, så vi for analytter med den største endringen i protein uttrykk nivåer mellom svulst, tilstøtende, og prøver fjerne vev. Her kan vi markere trettiseks proteiner med størst gjennomsnittlig fold-endring i protein uttrykk mellom svulst og vevsprøver ikke-tumor (Fig. 3, tabell 2). Vi testet betydningen av disse endringene med Mann Whitney test og krevde en p-verdi på 0,05 etter å ha korrigert for flere tester (falske funnrate cutoff av q 0,05). Selv om antall prøver ble brukt ved denne undersøkelsen var forholdsvis liten, studien bestod av parvise tumor- og ikke-tumor vevsprøver fra hvert individ. Dette gir mer makt til å identifisere endringer i en individuell og eliminerer populasjonsvariansen forbundet med tverrsnittsstudiedesign. Tilgjengeligheten av hensiktsmessig valgt referanseprøver blir stadig mer anerkjent som en avgjørende viktig komponent i biomarkører forskning [8] – [10]. Til slutt vurderes vi reproduserbarhet av denne nye metoden ved å analysere triplikate prøver av tumor og ikke-tumorvev resections for to pasienter i denne studien og fant en 4,5% median CV mellom triplikate målinger for de 820 proteinene målt (fig. 4) og Spearman korrelasjon koeffisienter 0,99 (delvis oppblåst av det store RFU utvalg målt). Triplikate målinger for de 36 proteiner med største midlere gangers forskjell mellom tumor og ikke-tumorvev er plottet i fig. 5.
Proteiner med øket (panel A) eller redusert (panel B) nivåer i tumorvev sammenlignet med tilstøtende eller distale vev (felt A) fra åtte NSCLC prøvene brukt i denne studien. Hvert individ er indikert med et annet symbol. De horisontale linjene i hver boks tilsvarer de første, andre og tredje kvartil (25% /50% /75%) og kinnskjegg tilsvarer maksimums- og minimumsverdier.
Svulsten, tilstøtende non-tumor, og fjerne vev resections ikke-tumor ble samplet, ekstrahert og analysert med SOMAscan proteomikk analyse i tre eksemplarer for to personer i studien. Median CV for alle 6 triplicates var 4,5% (sort linje).
Svulsten, ved ikke-tumor, og fjerne ikke-svulstvev resections ble samplet, ekstrahert og analysert med SOMAscan proteomikk analyse i triplikat for to individer (pasienter 56 og 61) i studien. Prøvene er farget av individet og tumorprøver blir fremhevet som trekanter. Y-aksen er på en log skala.
High-innhold proteomikk analyser av biologiske prøver som aktiveres av vår multiplexed analysen gir objektivt funn av sykdomsrelaterte proteiner. Hittil har vi gjennomført flere blodbaserte klinisk biomarkør studier av menneskelige sykdommer, inkludert lungekreft [6] og kronisk nyresykdom [5]. Disse studiene har identifisert nye potensielle sykdoms biomarkører samt biomarkører som har blitt rapportert tidligere. Den aktuelle studien følger denne trenden. Om lag en tredjedel (13/36) av de potensielle NSCLC vevet biomarkører er identifisert her er romanen, til det beste av vår kunnskap. De resterende to tredjedeler (23/36) er rapportert tidligere så ulikt uttrykte proteiner eller gener i NSCLC svulstvev (tabell 2). Novelty ble bestemt ved å utføre litteratursøk i Pubmed og på internett ved hjelp av potensielle biomarkører «genet navn og protein aliaser som identifiseres av Uniprot.
De potensielle biomarkører kan klassifiseres grovt i fire biologiske prosesser knyttet til viktige kjennetegn på tumorbiologi [11], som vist i tabell 3: 1), angiogenese, 2) vekst og metabolisme, 3) inflammasjon og apoptose, og 4) invasjon og metastase. Riktignok disse er praktiske, men unøyaktig klassifikasjoner som omtrent en svært kompleks og dynamisk system hvor disse molekylene ofte spille flere og nyanserte roller. Derfor er den spesifikke tilstanden til et gitt system slutt påvirker ekspresjon og funksjon av en bestemt molekyl. Vår forståelse av de biologiske fundamentet for disse systemene er langt fra komplett. Med SOMAscan plattformen, begynner vi å utforske den kvantitative ekspresjon av et stort antall proteiner i forskjellige vev og sykdomsprosesser. Disse dataene gir nye koordinater for å kartlegge dynamikken i disse systemer, som i sin tur vil gi en mer fullstendig forståelse av biologien til denne sykdommen. Resultatene fra denne studien gir et nytt perspektiv på NSCLC tumorbiologi, med både kjente og nye elementer.
Angiogenese
Angiogenese driver veksten av nye blodkar for å støtte tumorvekst og metabolisme. Reguleringen av angiogenese er en kompleks biologisk fenomen kontrollert av både positive og negative signaler [11]. Blant de potensielle NSCLC vevet biomarkører er identifisert i denne studien (Fig. 3) ble godt kjent positive og negative angiogenese regulatorer, som alle har blitt observert tidligere i NSCLC svulstvev [12] – [16]. Disse omfatter det prototypiske angiogenese indus VEGF-inhibitorer og endostatin og trombospondin-1 (TSP-1). VEGF er en kraftig vekstfaktor som fremmer ny vekst av blodkar; VEGF ble sterkt oppregulert i NSCLC tumorvev, i overensstemmelse med tidligere observasjoner [12], inkludert vårt studium av serumprøver fra pasienter med NSCLC [6]. Det er verdt å merke seg at VEGF opprinnelig ble oppdaget som tumorcelle-utskilt vaskulær permeabilitetsfaktor (VPF) som økte leakiness av tumorassosierte blodkar til store molekyler, slik som fibrinogen, som er normalt begrenset til plasma [17]. Denne aktiviteten kan ha betydelig effekt på sammensetningen av proteiner forbundet med tumorvev. Endostatin er et proteolytisk fragment av kollagen XVIII og en sterk inhibitor av endotel celleproliferasjon og angiogenese [13]. TSP-1 og den tilhørende TSP-2 var i det vesentlige opp-regulert i NSCLC tumorvev. TSP-1 og TSP-2 er ekstracellulære matriksproteiner med komplekse, kontekstavhengige effekter modulert via en rekke interaksjoner med celleoverflatereseptorer, vekstfaktorer, cytokiner, matriks-metalloproteinaser, og andre molekyler. Archetypically i modellsystemer, TSP-1 og TSP-2 inhiberer angiogenese ved å hemme endotelisk celleformering gjennom CD47-reseptoren (ikke målt i denne studien), og indusering av endotel celle apoptose via CD36-reseptoren. Det er også bevis for proangiogenic påvirkninger til TSP-1 og TSP-2 [18]. Til slutt, rapporterte TSP-1 og TSP-2 relative og absolutte uttrykk nivåer i NSCLC vev variere [16], [19] – [21] sannsynligvis på grunn av deres komplekse funksjoner. I vår studie fant vi også at CD36 ble nedregulert i NSCLC svulstvev, noe som kan tyde på en tilpasning av tumorceller redusere følsomheten for TSP-1 og TSP-2-mediert apoptose.
Vekst og metabolisme
ti av de potensielle NSCLC biomarkører vi identifisert er knyttet til vekst og metabolisme funksjoner. Halvparten av disse biomarkørene er involvert i komplekset hormonell regulering av cellevekst og energiomsetning. Tre insulinlignende vekstfaktorbindende protein (IGFBP), som modulerer aktiviteten til insulin-lignende vekstfaktorer (IGF), ble oppregulert i NSCLC-tumorer (IGFBP-2, -5, og -7). Flere rapporter har kvalitativt vurderes IGFBP-2, -5, -7 og i NSCLC (tabell 2) og antyder høyere ekspresjon i NSCLC vev enn i normalt vev. Insulin og IGF virker som hormoner som sterkt påvirker cellulær vekst, metabolisme, og overlevelse. Kreftceller er ofte avhengige av disse molekylene for vekst og spredning [11]. IGFBP-2 har også vært assosiert med et anti-apoptotiske virkning via caspase-3 [22]. Disse hormonene er i sving forringet av insulysin [23], der konsentrasjonen var høyere i NSCLC svulstvev. Hormonet adiponectin styrer lipidmetabolisme og insulinfølsomhet, og vi fant adiponectin nedregulert i NSCLC tumorer. De resterende fem biomarkører, karboanhydrase III, NAGK, TrATPase, tryptase β-2, og MAPK13, er alle enzymer med kjente roller i cellenes stoffskifte (Tabell 3).
Betennelse og apoptose
betennelse og apoptose er kjennetegnene ved kreft biologi, og vi finner en rekke potensielle biomarkører knyttet til disse prosessene som har vært forbundet tidligere med NSCLC (tabell 2). Vi fant caspase-3 konsentrasjoner høyere i NSCLC svulstvev. Caspase-3 har blitt assosiert med metastase [24]. Et annet kjent eksempel er oppløselig reseptor for avansert glykerte sluttprodukter sRAGE, som har blitt rapportert å være dramatisk nedregulert i NSCLC vev [21], [25]. Dette funnet er i tråd med vår måling, der sRAGE hadde den største observerte endringen for proteiner som er lavere i svulst enn i ikke-ondartet vev. En hypotese er at RAGE spiller en rolle i epitel organisasjon, og reduserte nivåer av RAGE i lungesvulster kan bidra til tap av epitelvev struktur, som potensielt kan føre til malign transformasjon [25]. Flere kjemokiner, slik som BCA-1, CXCL16, IL-8, og NAP-2, som blir påvirket i vårt studium, i samsvar med hypotesen om at invasjon av tumorer med celler fra den medfødte og ervervede armer av immunsystemet tilveie bioaktive molekyler påvirker proliferative og angiogene signaler [11].
Invasion og metastase
Den største gruppen av potensielle biomarkører inneholder proteiner som fungerer i celle-celle og celle-matrise interaksjoner og er involvert i invasjon og metastase . Mange har tidligere blitt rapportert å være assosiert med NSCLC. De mest kjente er to av matriks-metallproteaser, MMP-7 og MMP-12, noe som bidrar til proteolytisk nedbrytning av ekstracellulære matriks-komponenter og behandling av substrater, så som vekstfaktorer. For eksempel, er den viktigste substrat for MMP-12 elastin. Slike prosesser er vel kjent for å spille en rolle i å skape tumor microenvironments. Vi har observert MMP-7 og MMP-12 oppregulert i NSCLC vev, noe som er i samsvar med tilsvarende undersøkelse som ble anvendt antistoffbaserte målinger [26]. Den over-ekspresjon av MMP-7 og MMP-12 er blitt assosiert med dårlig prognose i NSCLC [26]. MMP-12 nivåer er korrelert med lokalt residiv og metastatisk sykdom [26]. Det er interessant å merke seg at to av de åtte individer undersøkt hadde normale nivåer av MMP-12, mens de andre seks hadde 15-50 gangers heving av MMP-12 i tumorvev sammenlignet med ikke-tumorvev.
SOMAmers som histokjemi sonder til NSCLC biomarkører
Forstå forskjellene i proteinuttrykk mellom tumor og ikke-tumorvev kan identifisere nye histokjemi mål. Denne tilnærmingen ble anvendt tidligere med MMP-12 og andre [27]. Slike prober kan aktivere mer presis molekylær karakterisering av svulster og deres effekter på omkringliggende stroma. Vi har tidligere demonstrert at fluoroforen-merket SOMAmers gi rask og selektiv histokjemisk farging i frosne vevssnitt [28]. Her undersøkte vi vev farging av flere av de SOMAmers som ble identifisert som biomarkører i vår analyse av vevshomogenater. Frosne vevssnitt ble kuttet fra de samme kreft resections brukes for biomarkører. For eksempel, TSP-2 farging med en fluorofor-merket SOMAmer i tumorvev var slående og som hovedsakelig er lokalisert i områder av fiber stromal arrdannelse (fig. 6A), men en slik farging var stort sett fraværende i normalt vev (Fig. 6B). Dette er konsistent med den rapporterte rollen til TSP-2 i matrisen modulering [18], [29]. I motsetning til dette, i normalt lungevev, makrofag mannosereseptoren (MRC1) SOMAmer farging lokalisert på overflaten av alveolære makrofager (fig. 6D) som forventes for dette målet [30]. Tumor vevsprøver, som mangler alveolene, viste liten MRC1 farging (Fig. 6C). Figur 6E viser MRC1 SOMAmer farging utføres samtidig med antistoffbasert immunfluorescens for andre mål (cytokeratins og CD31), noe som indikerer muligheten for multipleksing SOMAmer og antistoffreagenser i histologiske studier. Tissue farging med SOMAmers var således i overensstemmelse med homogenatet profiler, hvori TSP-2 ble forhøyet og MRC1 ble redusert i tumor sammenlignet med friskt vev. Vi bekreftet SOMAmer fargemønstre av TSP-2 og MRC1 med antistoffer Figur 7. sammenfall mellom histochemical fargings resultater med retning av endring i protein uttrykk mellom svulst og homogenates friske vevet gir ytterligere bevis for at de identifiserte biomarkører er assosiert med sykdom. Storskala proteomikk sammenligning mellom vev som er beskrevet her er også en kraftig metode for å identifisere nye histochemical sonder.
(A) Thrombospondin-2 SOMAmer (rød) farging fibrocollagenous matrix rundt en svulst reir. (B) Tilsvarende normale lunge prøven farget med Thrombospondin-2 SOMAmer (rød). (C) Makrofag mannosereseptoren SOMAmer (rød) farging spredt makrofager i en lunge adenokarsinom. (D) Makrofag mannosereseptoren SOMAmer (rød) farging av mange alveolære makrofager i en del av normal lunge parenchyma. (E) Multicolor bilde fremhever cytomorphologic fordelingen av makrofag mannosereseptoren SOMAmer farging: Grønn = Cytokeratin (AE1 /AE3 antistoff), Rød = CD31 (EP3095 antistoff), og Orange = SOMAmer. Alle kjerner i dette tallet er kontra med DAPI.
TSP-2 er identifisert i serie frosne deler av en enkelt lungekarsinom eksemplar av (A) en hjemmelaget kanin polyklonale TSP-2 polyklonale antistoff, (B) pre-immunserum fra kaniner som brukes til å lage hjemmelagde polyklonale antistoff, (C) en kommersiell (Novus) kanin polyklonale TSP-2 antistoff, og (D) TSP-2 SOMAmer. TSP-2 SOMAmer ble brukt til å farge frosne deler av normal og ondartet lungevevet, med standard Avidin-Biotin-Peroxidase fargeutvikling, for å demonstrere ulike morfologiske fordelinger: (E) Sterk farging av fibrotisk stroma rundt kreft reir, med minimal cytosolic farging av karsinomceller, (F) sterk farging av fibrotiske stroma som omgir tumor rede i en mucinous adenokarsinom, uten signifikant farging av karcinomceller, (G) normalt lungevev, og viser sterk cytosoliske farging av bronkiale epitel og spredt alveolære makrofager, og (H) sterk cytosolic farging av et adenokarsinom, med ingen signifikant farging av ikke-fibrotisk, hovedsakelig inflammatorisk stroma.
Noen generelle begrensninger knyttet til oppdagelsen av potensielle NSCLC biomarkører er verdt å merke seg. Først må det faktum at et protein er assosiert med tumorvevet ikke bety at det er spesifikt for tumorvevet. For eksempel, inflammasjon, ekstracellulær matriks remodellering, hypoksi, og vevsnekrose ledsager tumorprogresjon men også mange andre ikke-maligne tilstander slik som skade, sårheling eller infeksjon. For det andre, biomarkører vi identifiserte kunne reflektere en forskjell i forholdet mellom celletyper som utgjør en tumorprøve sammenlignet med den normale lungevevet. Hvis for eksempel tumorvev består av kreftcellevekst, noen av biomarkører er forventet å være spesifikke for den celletype (i dette tilfellet, epitelceller), transformeres eller ikke. Tilsvarende, dersom en svulst vevsprøve er enten mer eller mindre vaskularisert enn det omgivende normalt vev, er en endring i ekspresjonen av endotel-celle-spesifikke proteiner kan observeres. Faktisk ble det observert signifikant lavere konsentrasjoner av ESAM, et protein som er spesifikk for endotelceller, sammenlignet med matchet, ikke-tumorvev. Vi har bekreftet dette histochemically, som vist i figur 8 hvor vi målt 35 ganger mer ESAM-positive endotelialceller i fjerne ikke-tumorvev sammenlignet med tumorvev. Endelig SOMAmers, som alle affinitet reagenser, bind og gjenkjenne spesifikke epitoper av target proteiner generelt i en konformasjon avhengig måte, og en bestemt måling gjenspeiler tilgjengeligheten av dette epitop.
ESAM farging er vist i lungesvulst ( A, C) og normal lunge (B, D) fjernt fra svulsten. Endotelceller er synlig mer rikelig i normal lunge-delen, i samsvar med den høye vaskularitet normal lunge. RAW-bilder er vist i A og C, med ESAM-positive celler identifisert av CellProfiler algoritmen merket med «1» i bilder B og D.
Sammenligning av NSCLC vev og serum biomarkører
Vi har nylig avsluttet en NSCLC studien [6] som analyserte vi 1326 serumprøver fra fire uavhengige kliniske studiesentre bruker samme proteomikk plattform og et protein meny nesten identisk med den som brukes for vev (813/820 proteiner). Studien inkluderte pasienter med diagnosen patologisk eller klinisk stadium I-III NSCLC og en kontrollpopulasjon med en historie av langvarig bruk av tobakk, inkludert aktive røykere og eks-røykere med minst 10 stk-års røyking. Tar omfattende forholdsregler på kontoen for pre-analytiske variabler, identifiserte vi 44 kandidat biomarkører, og utviklet en 12-protein panel som skilte NSCLC fra kontroller med 91% sensitivitet og 84% spesifisitet i et treningssett, og 89% sensitivitet og 83% spesifisitet i en blindet, uavhengig bekreftelse sett. Tilgjengeligheten av denne databasen gir oss mulighet til å sammenligne endringer i proteinuttrykk i vev og serum fra NSCLC pasienter.
Mens metoden som er benyttet for å analysere proteinprofiler i prøver fra disse to NSCLC studiene er det samme, noen vesentlige forskjeller er verdt å merke seg. Først ble observert serum pre-analytisk variasjon mellom studiesentre, kanskje maske noen kreft biomarkører [6]. For det andre, i det NSCLC vev studie rapportert her, har hver tumorprøve sin egen kontroll vev (nærliggende og fjerntliggende ikke-tumor), mens den større NSCLC serum studie av nødvendighet er sammensatt av saks og kontrollprøver fra forskjellige individer. Ikke desto mindre, differensial ekspresjon av proteiner i sera fra NSCLC pasientene, i forhold til kreft-frie kontroller sammenlignet med den til NSCLC-vevsprøver gir nyttig innsikt (fig. 9, tabell 4). Den mest slående observasjon er at relative endringer i proteinekspresjon er større i vev enn i serum. Dette resultat kan forventes fordi tumorvevet er kilden av endringene i proteinekspresjon det er da, selv om helt frigjort i sirkulasjon, fortynnet mange ganger til totalvolumet av blod. Denne trenden er tydelig i den langstrakte fordelingen av datapunkter langs x-aksen i figur 9, hvor aksene er tegnet i samme målestokk for å illustrere dette. Elleve av de analytter som er vist i figur 3 som endres i tumorvev ble også uttrykt forskjellig i sera fra pasienter med NSCLC lignet med kontroller (fylt røde sirkler i fig. 9). Det er verdt å merke seg at vår publisert NSCLC serum studie [6] ikke måle MMP-12, som denne studien identifisert som en topp vev biomarkør. I påfølgende NSCLC serum studiene ble MMP-12 målt og vi fant det var også en topp serum biomarkør med en KS-avstand på 0,42 (tabell 2). Dette tyder på at forhøyet serum MMP-12 gjenspeiler direkte NSCLC tumorbiologi. De fleste av de andre biomarkører som er felles for vev og serum også endre seg i samme retning, men noen få ikke. Lokale konsentrasjoner av proteiner i en vevhomogenatet åpenbart ikke trenger korrelerer med sirkulerende nivåer av proteiner og inverse korrelasjoner kan gi ledetråder om omfordeling av enkelte biomarkører i syke versus normalt vev.
De to øverste panelene viser log2 forholdet (LR) avledet fra serumprøver versus log-forhold avledet fra tilstøtende vev og fjerne vev, henholdsvis. De fire nederste panelene funksjonen zoomet deler av tomter ovenfor, indikeres av fargen på tomten (grønn for redusert og rødt for økt uttrykk sammenlignet med ikke-svulstvev). Analytter vist i figur 2 har blitt merket og analytter nevnt i publikasjonen på serumprøver er vist i fylte røde symbolene rødt.
Diskusjoner
Oppdagelsen av nye biomarkører med påviselig diagnostiske eller kliniske verktøyet har vært en stor utfordring i de senere år [8]. Årsakene til dette er: allestedsnærværende preanalytiske og analytiske gjenstander, utilgjengelighet av egnede sunt statskontroller, problemstillinger knyttet til å studere design, og vanskeligheten med å oppdage små endringer i proteinnivåer ved svært lave konsentrasjoner. Denne utfordringen er spesielt tydelig med kreft biomarkører der målet er ofte å finne biomarkører for en liten malignitet i blodet til en relativt stor menneskekroppen på et tidlig stadium.
Den nylig gjennomførte National Lung Screening Trial (NLST) rapportert en betydelig dødelighet fordel for screening for NSCLC med lavdose CT og oppdager tidlig stadium sykdommen i en høy risiko befolkning [31].
