Abstract
Adrenokortikal karsinom (ACC) er en svært sjelden endokrin svulst, med variabel prognose, avhengig av svulst trinn og diagnosetidspunktet. Imidlertid er det vanligvis dødelig, med en total overlevelse av 5 år fra deteksjon. Strålebehandling nytten for ACC behandling har vært mye debattert, og synes å være avhengig av molekylære endringer, som igjen fører til økt radio-motstand. Mange studier har vist at p53 tap er en viktig risikofaktor for ondartet adrenokortikal tumor utbruddet, og det har blitt rapportert at somatiske mutasjoner i
TP53
genet forekommer i 27-70% av voksen sporadisk ACC. I denne studien undersøkte vi rollen som somatiske mutasjoner av
TP53
genet som svar på ioniserende stråling (IR). Vi studerte status for p53 i to binyrebark cellelinjer, H295R og SW-13, husing ikke-fungerende former av dette proteinet på grunn av mangel på eksoner 8 og 9 og en punktmutasjon i exon 6, henholdsvis. Videre disse cellelinjene viser høye nivåer av p-Akt og
IGF2
, spesielt H295R. Vi la merke til at restaurering av p53 aktivitet førte til hemming av vekst etter transient transfeksjon av celler med villtype p53. Evaluering av deres respons på IR i form av celleproliferasjon og levedyktigheten ble bestemt ved hjelp av celletall og TUNEL assay.
wtp53 overekspresjon også økt celledød ved apoptose følgende stråling i begge cellelinjer. Videre RT-PCR og Western blotting analyse av noen p53 målgener, for eksempel
BCL2
,
IGF2 Hotell og Akt vist at p53-aktivering følgende IR førte til en nedgang i
IGF2
uttrykk. Dette var forbundet med en reduksjon i den aktive formen av Akt. Samlet utgjør disse resultatene markere rollen p53 som svar på stråling fra ACC cellelinjer, noe som tyder på sin betydning som en prediktiv faktor for stråleterapi i maligne binyrebark svulster tilfeller
Citation. Sampaoli C, Cerquetti L, Gawhary RE , Bucci B, Amendola D, Marchese R, et al. (2012) p53 Stabilisering induserer cellevekst Hemming og Påvirker
IGF2
Pathway i Response til Strålebehandling i Adrenokortikal kreftceller. PLoS ONE 7 (9): e45129. doi: 10,1371 /journal.pone.0045129
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu «, Italia
mottatt: 23 april 2012; Akseptert: 14. august 2012; Publisert: 19.09.2012
Copyright: © Sampaoli et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av det italienske departementet for universitet og forskning (20085P5S49_005), ved Sapienza Universitetet i Roma (C26A1097KR), av Fondazione Guido Berlucchi per la Ricerca sul Cancro, forskningsprosjekt: «Tumori del sistema endocrino» Borgonato di Corte Franca – Brescia, Italia . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Adrenokortikal karsinom (ACC) er en svært sjelden endokrin svulst, med en insidens anslått til omtrent 1 til 2 tilfeller
per
1 million mennesker hvert år i den generelle voksne befolkningen [1], [ ,,,0],2], mens i spedbarn befolkningen i Sør-Brasil hyppigheten av denne malignitet er relativt høy, fra 3,4 til 4,2
per
millioner barn [3], [4]. Statistiske aldersfordeling følger en bimodal trend, med en første topp oppstår i tidlig barndom og en annen en i fjerde og femte tiår av livet [2], [5].
ACC vise variabel prognose, avhengig av svulst trinn og diagnosetidspunktet, selv om de er vanligvis dødelig, med en total overlevelse av 5 år fra deteksjons [6]. Hyppigheten av metastasering forbundet med ACC varierer avhengig av studien, som strekker seg fra 30% til 85% av pasienter med fjernmetastaser ved presentasjonen [7].
For tiden er den terapi som ser ut til å produsere beste resultatene i ACC tilfeller er kirurgisk fjerning av binyre masse. Men postoperativ sykdomsfri overlevelse på 5 år er bare rundt 30% og gjentakelse priser er opptil 85%. Medisinsk behandling med o, er p’DDD (orto, para «, diklor-, difenyl-, dikloretan, eller mitotane) og andre cytostatika begrenset av viktige bivirkninger. Derfor er andre adjuvant behandling etter fullstendig fjerning av svulster som trengs [8], [9].
Stråleterapi har ofte blitt betraktet som ineffektiv for ACC behandling. Faktisk trenger opptil 58% av pasientene som ikke viser en betydelig respons. Selv om data fra pasienter behandlet med adjuvant svulst seng bestråling vist at strålebehandling kan være effektive i å redusere den høye frekvensen av lokalt tilbakefall av ACC, høy variasjon i de observerte effektene tyder på at flere undersøkelser er nødvendig for å fullt ut forstå den effektive terapeutiske rollen av strålebehandling [8], [10]. I dag er det tenkt at strålebehandling bør individualiseres, samtidig som det tas hensyn til parametere som tumorstørrelse, reseksjon status, Ki-67-indeksen og tumor spredning [11].
Videre variasjonen av svarene observert understreket betydningen av identifikasjon av genetiske og molekylære endringer som er involvert i motstanden av noen svulster til strålebehandling [2], [12]. I dag er kjennskap til genetiske endringer som fører til ACC predisposisjon er ganske dårlig. Imidlertid har mange studier vist at p53 tap er en viktig risikofaktor for ondartet adrenokortikal tumor utbruddet. Pasienter rammet av Li-Fraumeni syndrom, som arver germline mutasjoner av
TP53
, er mer sannsynlig å utvikle ondartede binyrebark svulster. Videre en bestemt mutasjon i kodon 337 (R337H) ser ut til å være ansvarlig for de fleste tilfeller av ACC i barnebefolkningen i Sør-Brasil. Videre har det vært også rapportert at somatiske mutasjoner i
TP53
genet forekommer i 25-70% av voksen sporadisk ACC [2], [9].
I denne studien har vi undersøkt rolle av p53 som respons på ioniserende stråling (IR) i ACC
in vitro
modeller. Spesielt vi analyserte status for
TP53
genet i to menneskelige ACC cellelinjer, H295R og SW-13, og vi fant ut at dette genet er mutert i begge cellelinjene, som er delvis resistente mot IR i en dose av 6 Gy, som tidligere vist [13]. Den over-uttrykk for
IGF2
mRNA er et annet typisk trekk ved ACC funnet i H295R cellelinje. Her viste vi at restaurering av p53-aktivitet, ved transfeksjon av villtype p53 (
wtp53), førte til inhibering av vekst og indusert celledød ved apoptose følgende IR-administrering i begge cellelinjer. Vi har også lagt merke til en pålitelig nedgang i
IGF2
genekspresjon og en reduksjon i Akt aktivering etter IR behandling i cellene over-uttrykker villtype p53.
Samlet utgjør disse resultatene markere betydningen av p53 i cellulær respons på IR i ACC cellelinjer. De indikerer også en molekylær mekanisme som involverer IGF2, og dermed styrke effektiviteten av strålebehandling som adjuvant behandling i ACC.
Resultater
TP53
mRNA analyse
I en tidligere artikkel av vår gruppe [13], en stor delesjon i
TP53
gen, påvirker exonene 8 og 9, ble oppdaget i H295R cellelinje. Vi utførte sekvensanalyse av
TP53
kodende sekvens i disse celler for å evaluere effekten av denne delesjon på mRNA produksjon. Vi har funnet at en kortere mRNA blir transkribert, hvor ekson 7 er direkte bundet til ekson 10 (figur 1, felt A, topp). I samsvar med dette, RT-PCR-analyse av
TP53
, ble utført ved anvendelse av primere som flankerte eksoner 8 og 9 region. Denne viste en kortere mRNA produkt, som mangler 211 basepar (figur 1, felt B).
(A) Representasjon av
TP53
mutasjoner identifisert i H295R og SW-13-cellelinjer, som viser et stor sletting påvirke 211 basepar i H295R celler (øverst) og en homozygot punkt mutasjon i ekson 6 (
r.577c u
) i SW-13 cellelinje (nederst). SW-13 celler utviser også en polymorfe området ligger i ekson 4 (
r.215c g
). (B) Omvendt bilde i forhold til RT-PCR analyse av eksoner 7 til 10 av
TP53
genet. Elektroforese på en 2% agarosegel avslørte en stor gjeng ~575 bp, tilsvarende SW-13 avskrift, og et mindre band av ~364 bp, som tilsvarer H295R transkripsjon (DNA ladder, en Kb pluss). (C) Forutsagt aminosyresekvens av p53 i H295R og SW-13 cellelinjer. Sletting av eksoner 8 og 9 i H295R bestemmer et rammeskifte starter ved kodon 261, noe som skaper en påfølgende stoppkodon i posisjon 274 (øverst). I SW-13-celler, en homozygot punktmutasjon i kodon 193 bestemmer en amino-syresubstitusjon (histidin til tyrosin) i DBD av proteinet (nederst). (D) Western blotting-analyse av p53 i H295R og SW-13-celler, som viser tilstedeværelsen av en kortere protein i H295R cellelinje, hvilken molekylvekt er ~44 kDa.
delesjon av exon 8 og 9 angir en aminosyresekvens endring som starter fra kodon 261, som også innfører et for tidlig stoppkodon i aminosyre-posisjon 274 (figur 1, felt C, øverst). Ifølge våre tidligere data, var dette mRNA vist seg å bli oversatt til en kortere protein, hvis molekylvekt er omtrent 44 kDa (Figur 1, panel D).
Sekvense analyse av
TP53
koding sekvens i SW-13 celler bekreftet tilstedeværelsen av en homozygot punkt mutasjon i ekson 6 (
r.577c u
)., som ble beskrevet for første gang av Reincke
et al product: [ ,,,0],14] (figur 1, felt A, nederst). Dette resulterer i aminosyreforandring i kodon 193 (histidin til tyrosin) (figur 1, felt C, nederst). Videre identifiserte vi en polymorfisme i kodon 72 (CCC til CGC) (figur 1, felt A, nederst) i denne cellelinje, noe som resulterer i en aminosyresubstitusjon på posisjon (arginin i stedet for prolin) (figur 1, felt C, bunn). Resulterer p53-proteinet i disse cellene har en standard molekylvekt (Figur 1, panel D), og er sterkt uttrykt i forhold til LNCaP-cellelinjen, som havner villtype form av p53, slik det ble demonstrert ved Western blot-analyse (figur S1).
Effekt av vill type
TP53
på celleproliferasjon og respons for ioniserende stråling
for å vurdere betydningen av
TP53
mutasjoner på celleproliferasjon, vi transient transfektert H295R og SW-13 celler med tom vektor (mock) eller en vektor som uttrykker villtype-form av
TP53 plakater (WT) og evaluert effekten på cellevekst 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon. Vi vurderte også effekten av
TP53
restaurering i respons til bestråling ved dose på 6 Gy.
Det samme analyse ble utført på radio bestandig eggstokkene adenokarsinom SK-OV-3 celler, som gjør ikke uttrykker enten p53-protein eller mRNA [15].
i H295R celler (figur 2, panel A, venstre), ble ingen signifikant vekst inhibering observert i celler som uttrykker villtype p53 sammenlignet med celler transfektert med tom vektor ( -11% etter 48 timer og -9% ved 72 timer). Dette tyder på at p53 alene er ikke i stand til å indusere en stabil vekstarrest i disse cellene. IR var ikke signifikant endrer celleformering i celler transfektert med tom vektor (-4% etter 72 timer), mens effekten av bestråling på cellevekst var tydelig i celler som uttrykker
wtp53. Denne effekten var tydelig i 48 timer etter transfeksjon (-18% i forhold til spotte bestrålte celler; p 0,05) og styrket på 72 timer etter transfeksjon (48 timer etter bestråling), når veksthemming nådde -25% (p 0,01).
celle~~POS=TRUNC vekst~~POS=HEADCOMP ble evaluert i H295R, SW-13 og SK-OV-3 cellelinjer transfektert med tom vektor (mock) eller p53-vektor (WT), enten bestrålte eller ikke. (A) I H295R cellelinjer (til venstre), induserer ioniserende stråling (IR) behandling en signifikant inhibering av cellevekst i celler som uttrykker villtype p53, fra 48 timer etter transfeksjon (-18% i forhold til håne bestrålte celler; p 0,05 ) og nå -25% etter 72 timer (p 0,01). Bestråling induserer ikke en stabil effekt i SW-13-celler (høyre) transfektert med tom vektor, mens celler som uttrykker villtype p53 er betydelig hemmet ved 48 timer etter transfeksjon (-28%, p 0,05) til slutten av forsøket ( -31%; p 0,01). I SK-OV-3 celler (nederst), p53 restaurering induserer en sterk effekt på cellevekst, som er tydelig siden 48 fra transfeksjon (-20% av veksthemming i WT + IR prøven sammenlignet med mock + IR; p 0,01) og tåler opptil 72 timer (-28%; p 0,01). Dataene er gjennomsnitt ± S.D. av minst tre uavhengige eksperimenter utført av duplikater. (B) Western blotting-analyse av cyclin E og cyklin D1 ekspresjon i H295R celler ved 72 timer etter transfeksjon avslørte en nedregulering av disse proteiner i celler som uttrykker
wtp53 behandlet med IR ved en dose på 6 Gy. (C) Analyse av cyclin E og cyklin D1 ekspresjon i SW-13-cellelinjen ved Western blotting viser en reduksjon i proteinnivåer i prøver transfektert med p53-vektor etter bestråling. Bands «intensiteter ble kvantifisert med ImageJ programvare, ved hjelp vinculin for normalisering. (*, P 0,05).
I motsetning til vår forrige rapport [13], i dette arbeidet vi forbedret transfeksjon effektivitet ved hjelp pBABE-neo-p53 vektor, som inneholder MMLV lang terminal gjentagelse. Morgenstern og Land [16] støtte muligheten av denne vektor for å forbedre genekspresjon i mange cellelinjer.
Lignende resultater ble observert i SW-13-cellelinjen (figur 2, felt A, til høyre). Celler transfektert med tom vektor eller p53-vektor viste en svært lik spredning trend. Videre bestråling ikke signifikant påvirke celleformering i celler transfektert med tom vektor. Tvert imot, en sterk virkning av IR behandling i celler som uttrykker
wtp53 var tydelig ved 24 timer etter bestråling (48 timer etter transfeksjon), med 28% av hemming av cellevekst (p 0,05) sammenlignet med bestrålte celler transfektert med tom vektor. Effekten var enda større ved 72 timer etter transfeksjon, når vi observerte 31% av veksthemning i WT bestrålte celler sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,01).
SK-OV-3-celler (figur 2, panel A, nederst), gjenopprettelse av
wtp53 induserte en svak inhibering av cellevekst, noe som imidlertid ikke overskred 17% etter 72 timer. Vi observerte også at IR-behandling med en dose på 6 Gy hemme vekst av -27% (p 0,05) etter 24 timer i celler transfektert med tom vektor, som nådde -35% (p 0,01) etter 48 timer. Men tilstedeværelsen av
wtp53 forsterket effekten av IR-behandling. Faktisk ble det observert en hemming av cellevekst på -20% (p 0,01) 24 timer etter bestråling i celler som uttrykker p53 sammenlignet med de transfektert med tom vektor. Denne effekten økes etter 48 h (-28%, p 0,01).
Viktigheten av p53 i SK-OV-3-celler som respons på bestråling ble ytterligere bekreftet ved observasjonen at celler transfektert med tom vektor begynte gjenopprette 72 timer etter IR-behandling, mens de som uttrykker
wtp53 fortsatte å bli hemmet (data ikke vist).
i H295R og SW-13 cellelinjer, kan effekten av p53 stabilisering på cyclin E og cyklin D1 ble evaluert, da disse proteiner bidrar til celleproliferasjon ved å akselerere G1-fasen av cellesyklus [17], [18]. Ved 72 timer etter transfeksjon med tom vektor (mock) eller p53 vektor (WT), observerte vi en reduksjon av cyklin E og cyklin D1 ekspresjonsnivåene i prøver som uttrykker
wtp53 bestrålt med en dose på 6 Gy, i begge H295R (figur 2, panel B) og SW-13 (figur 2, felt C) celler. Dette resultat derav indikerer at IR-behandling er i stand til å forsinke formeringshastigheten av de cellelinjer i et p53-avhengig måte.
Disse data indikerer at gjenopprettelse av
wtp53 ekspresjon i H295R og SW-13 cellelinjer er ikke tilstrekkelig til å utøve en virkning på celleformering. Nærværet av villtype p53 form synes å være fundamental for veksthemming av disse cellene i respons på bestråling, som celler transfektert med tom vektor blir nesten ikke påvirket av denne behandling. Imidlertid
wtp53-uttrykkende celler blir hemmet signifikant.
SK-OV-3-celler, er effekten av IR sterkere enn i H295R og SW-13-celler, til og med i prøvene transfektert med tom vektor, noe som tyder på at denne cellelinje er mer følsomme for bestråling enn ACC-cellelinjer. Likevel er den maksimale veksthemming oppnådd når villtype form av p53 blir uttrykt, noe som viser at dette protein er involvert i respons på IR i SK-OV-3-celler i tillegg.
Stabilisering av p53 som respons for ioniserende stråling
villtype p53 overekspresjon ble bestemt ved RT-PCR og Western blotting. p53 nivåer betydelig økt i H295R og SW-13 cellelinjer på 24 timer etter transfeksjon med pBABE-neo-p53 vektor og var maksimalt på 48 timer. Ved 72 timer fra transfeksjon, ble det observert en reduksjon i p53-nivåer, noe som så ut til å være på grunn av en reduksjon i
TP53
mRNA, sannsynligvis på grunn av tap av transfekterte vektorer (figur S2).
Men i celler transfektert med vill-type p53 kastes IR behandling, effekten på celleformering var sterkest etter 72 timer etter transfeksjon (48 timer etter bestråling). Derfor ble uttrykk nivåer av p53 evaluert ved hjelp av RT-PCR og Western blotting i H295R, SW-13 og SK-OV-3-celler på samme tidspunkt.
Real Time RT-PCR-analyse bekreftet at
TP53
gen er overuttrykt i alle prøver transfektert med pBABE-neo-p53 vektor (figur 3, panel A, C, E), enten bestrålt eller ikke. Sammenlignet med mock,
TP53
mRNA var 5- og 3 ganger mer uttrykt i H295R og SW-13 celler, henholdsvis. Ifølge Yaginuma og Westphal [15], i SK-OV-3 celler, ingen
TP53
mRNA var synlig i mock prøver, i motsetning til celler transfektert med p53-vektor.
Expression nivåer av
TP53 Kjøpe og p53 protein evaluert av real Time RT-PCR og Western blotting i H295R, SW-13 og SK-OV-3 celler 72 timer etter transfeksjon med tom vektor (mock) eller p53-vektor (WT) . Prøvene ble behandlet med IR ved en dose på 6 Gy er angitt. (A) RT-PCR (øverst) og Real Time RT-PCR (nederst) analyse av
TP53
uttrykk i H295R celler. Prøver transfektert med pBABE-neo-p53 vektor viser en fem-dobling i
TP53
mRNA sammenlignet med mock. (B) Western blotting-analyse av p53 i H295R celler (øverst) viste et hovedbånd av ~53 kDa (
wtp53) og et mindre bånd av ~44 kDa, som tilsvarer den avkortede form av p53 (p53
Δ8 -9). Densitometry viser at
wtp53 stabiliseres av IR behandling (nederst). (C) RT-PCR-analyse av
TP53
mRNA i SW-13-celler viser over-ekspresjon av genet i prøver transfektert med pBABE-neo-p53 vektor (øverst). Real Time RT-PCR-analyse avdekket en 3-dobling i
TP53
avskrift i prøver transfektert med p53 vektor. Uttrykket av
TP53
ikke modulert ved bestråling (nederst). (D) Nivåer av p53 protein i SW-13 celler øke etter IR behandling i celler transfektert med pBABE-neo-p53 vektor, mens ingen endring kan påvises i prøver transfektert med tom vektor. (E) I SK-OV-3-celler, no
TP53
transkripsjon var påvisbar ved hjelp av RT-PCR i prøvene transfektert med tom vektor, mens i celler transfektert med pBABE-neo-p53 vektor et sterkt signal, som tilsvarer
TP53
mRNA, er observerbar (øverst). Real Time RT-PCR-analyse viser ingen modulering av
TP53
uttrykk etter bestråling (nederst). (F) Western blotting-analyse av p53 i SK-OV-3-celler viste et detekterbart bånd bare i prøver transfektert med pBABE-neo-p53 vektor (øverst). Densitometry viser at p53-nivåene øker etter bestråling, noe som indikerer stabilisering av proteinet (nederst). Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
GAPDH Hotell og vinculin ble brukt for normalisering. (*, P 0,05; #, p 0,01).
Selv om
TP53
mRNA nivåer ble høyere i p53-transfekterte celler, gjorde de ikke varierer mellom WT bestrålt og ikke -irradiated celler. Tvert imot, p53-protein nivåer viste seg å være vesentlig høyere i p53-transfekterte celler underkastet IR-behandling, sammenlignet med de ikke-bestrålte seg. Faktisk, i H295R celler nivåer av vill-type p53 økt tre ganger i bestrålte WT-celler sammenlignet med p53-transfiserte, ikke-bestrålte celler (figur 3, felt B). Men den endogene form av p53 (p53
Δ8-9) ble ikke modulert ved strålebehandling. SW-13 celler viste en 1,3-ganger økning i p53 i bestrålte WT prøvene sammenlignet med WT (figur 3, panel D), mens p53 var 1,5 ganger høyere i bestrålte SK-OV-3 celler sammenlignet med ubehandlede celler (Figur 3, panel F).
Behandling av H295R og SW-13 celler med ulike stråledoser (4, 6 og 8 Gy) bekreftet at
TP53
mRNA uttrykk nivåer ikke ble påvirket av IR (figur S3, panelene A, C). Administreringen av en strålingsdose av 4 Gy fremkalte ikke en betydelig variasjon i p53-protein enten. Tvert imot, ble p53 oppregulert etter administrering av strålingsdoser på 6 og 8 Gy; imidlertid ble det ikke observert noen signifikante endringer mellom disse to doser (figur S3, paneler B, D), noe som indikerer at IR-behandling med en dose på 6 Gy er tilstrekkelig til å indusere en stabilisering av p53 i ACC-cellelinjer.
økningen i p53 protein nivåer observert i bestrålte prøvene er ikke på grunn av en økning i
TP53
uttrykk, siden mRNA nivåer ikke ble påvirket av stråling. Dette kan forklares ved en aktivering av p53 ved hjelp av IR, som oversettes i en stabilisering av dette protein bare i celler utsatt for denne behandling. Stabilisering av p53 kan vurderes forutsier sin aktivering, noe som forklarer effekten på celleproliferasjon bare observert i prøver som mottok bestråling.
TUNEL analyse av celledød
Som p53 er et godt kjent induser av den apoptotiske prosess som reaksjon på genotoksiske påkjenninger [19], [20], utførte vi en TUNEL assay for å analysere tilstedeværelsen av apoptose i H295R, SW-13 og SK-OV-3 cellelinjer transfektert med tom vektor (mock) eller p53-vektor (WT), enten bestrålt eller ikke.
Som forventet, ingen tegn på apoptose var påvisbar i prøver ikke utsatt for behandling med IR (data ikke vist). Apoptotisk celledød var også fraværende i bestrålte celler transfektert med tom vektor, mens prøver hvor villtype form av p53 ble uttrykt som syntes å være positiv for TUNEL-farging i alle cellelinjer (figur 4, felt A), noe som indikerer at tilstedeværelse av en funksjonell p53 er nødvendig for induksjon av celledød i respons til radioterapi.
H295R, SW-13 og SK-OV-3 cellelinjer ble transfektert med tom vektor (mock) eller p53-vektor (WT) og bestrålt ved en dose på 6 Gy. (A) TUNEL-analysen ble utført ved 48 og 72 etter transfeksjon. I alle cellelinjer, tunel-positive celler kan påvises bare i bestrålte prøvene som uttrykker villtype form av
TP53
. Celler ble også farget med Hoechst 33342 og deretter visualisert med et fluorescens-mikroskop ved en forstørrelse på 40 x. Figuren er representativt av tre eksperimenter utført i duplikat. (B) Prosent av apoptose i H295R, SW-13 og SK-OV-3 ble beregnet ved å sammenligne TUNEL-positive celler med totalt celler farget med Hoechst 33342. apoptose økning i celler transfektert med p53 vektor sammenlignet med mock-bestrålt prøvene, å starte fra 48 H etter transfeksjon og effekten styrker etter 72 timer. (*, P 0,05; #, p 0,01). (C)
BCL2
ekspresjon ble evaluert i H295R cellelinje ved RT-PCR. p53 restaurering induserer en betydelig reduksjon i
BCL2
uttrykk ved 48 og 72 timer etter bestråling. (D) Invertert bilder i forhold til semi-kvantitativ RT-PCR-analyse av
BCL2
genekspresjonen utført på SW-13 celler, viser en betydelig reduksjon i
BCL2
signal i celler transfektert med p53- vektor følgende ioniserende stråling behandling. (E) Virkningen av p53 restaurering på
BCL2
mRNA-nivåer i respons på bestråling ble evaluert i SK-OV-3 cellelinjer. p53 hemmer
BCL2
uttrykk og effekten er sterkere i 72 timer etter transfeksjon. Bilder er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
GAPDH
ble brukt for normalisering.
apoptose kunne påvises etter 48 timer etter transfeksjon av
wtp53 og økt på 72 timer etter transfeksjon (48 timer etter bestråling) i alle celle linjer (figur 4, paneler A, B, Tabell S1). Apoptotisk celledød økt med 2,6 ganger på 48 timer i bestrålte H295R celler transfektert med p53-vektor sammenlignet med celler transfektert med tom vektor (10,3%
vs
3,9%) (p 0,05) og med 4,4 ganger ved 72 h (15,1%
vs
3,4%) (p 0,01) (figur 4, panel B; Tabell S1). Mindre differensierte SW-13 celler viste også en 2-ganger økning i apoptose etter 48 timer (8,4%
vs
4,3%) (p 0,05) og en 3,7 ganger økning på 72 timer etter transfeksjon (16,3 %
vs
4,4%) (p 0,01) i bestrålt WT prøven sammenlignet med bestrålte mock celler (Figur 4, panel B, Tabell S1). Tilsvarende transfeksjon av tom vektor ikke i stor grad påvirke celledød i SK-OV-3-cellelinjen heller, mens transfeksjon av
wtp53 betydelig økt prosentandel av apoptotiske celler i respons til strålebehandling ved to gangers etter 48 timer (8,7%
vs
4,2%) og med 3,5 ganger på 72 timer (17,1%
vs
4,9%) (p 0,05) (figur 4, panel B;. Tabell S1)
Siden mange rapporter vist at p53 er i stand til å undertrykke
BCL2
ekspresjon som reaksjon på en stimulus apoptotiske [21] – [23], analyserte vi
BCL2
mRNA-nivåer i celler behandlet med IR- , enten som uttrykker villtype-form av
TP53 plakater (WT) eller ikke (mock), etter 48 timer og 72 timer etter transfeksjon. RT-PCR-analyse viste at
BCL2
uttrykk nivåer redusert i bestrålte celler bare når
wtp53 var til stede, mens de holdt stødig i prøver transfektert med tom vektor. I samsvar med TUNEL analyseresultatene,
BCL2
nivåene begynte å avta fra 48 h og minimumsnivåene ble observert ved 72 timer etter transfeksjon (figur 4, felt C, D, E).
disse data bekrefter at villtype p53 er nødvendig for induksjon av celledød ved apoptose og nedregulering av
BCL2
som respons på bestråling i H295R og SW-13-celler. Videre fravær av disse virkninger i bestrålte celler som uttrykker bare den endogene mutant p53 synes å indikere at disse mutanter er ikke-fungerende proteiner er ikke på noen måte påvirket av IR-behandling.
Effekt på
IGF2
ekspresjon
IGF-II representerer den viktigste markør for ACC [24], [25] og dens ekspresjon er strengt regulert av p53 [26], [27]. Siden vi demonstrert at
wtp53 er i stand til å redusere celleproliferasjon og indusere apoptose i ACC cellelinjer som respons på IR, vi undersøkte også effekten av p53-aktivering på
IGF2
uttrykk. RT-PCR analyse av
IGF2
mRNA uttrykk i H295R celler (Figur 5, panel A) viste at bestråling ikke endre
IGF2
nivåer i prøvene transfektert med tom vektor. Men
IGF2
uttrykk ble redusert til 48 timer etter transfeksjon (24 timer etter bestråling) og dramatisk redusere på 72 timer etter transfeksjon (-42%; p 0,01) i celler som uttrykker villtype p53
.
(A) Inverted bilder i forhold til semi-kvantitativ RT-PCR analyse av
IGF2
genuttrykk utført på H295R celler, som viser et massivt tap av
IGF2
signal i bestrålte cellene ved 72 timer etter transfeksjon av p53-vektor (WT). (B) RT-PCR analyse av
IGF2
mRNA nivåer utført på SW-13 celler. En betydelig reduksjon i
IGF2
uttrykk er påvisbar i celler transfektert med p53-vektor (WT) som følge av ioniserende stråling behandling. Bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
GAPDH
uttrykk ble brukt for normalisering og band «intensiteter ble kvantifisert ved hjelp ImageJ. Band densitometry er vist i høyre panel. (*, P 0,05; #, p 0,01).
Lignende resultater ble observert i SW-13-cellelinjen (figur 5, panel B), selv om disse cellene uttrykker meget lave nivåer av
IGF2
mRNA. Selv i dette tilfellet, ingen effekt på
IGF2
ekspresjon ble observert etter administrering IR i celler som uttrykker endogent mutante p53, mens en sterk nedgang i
IGF2
mRNA-nivåer ble observert i celler transfektert med
wtp53 vektor. Denne reduksjonen var maksimum på 72 timer etter transfeksjon (-35%; p 0,05).
Effekt på Akt aktivering
Til slutt undersøkte vi effekten av IR på Akt aktivering i H295R og SW -13 cellelinjer enten transfektert med p53-vektor (WT) eller ikke (mock). Dette proteinet, faktisk er en hoved nedstrøms effektor av IGF-II-signalveien og en nøkkel negativ regulator av apoptotisk prosessen.
Western blotting-analyse av total Akt og av dens fosforylert aktiv form i H295R (figur 6 , panel A) og SW-13 (figur 6, panel B) celler viste at Akt var til stede i alle prøver og er ikke påvirket av
wtp53 uttrykket (data ikke vist). Tvert imot, densitometrisk analyse av p-Akt normalisert til total Akt viste at celler transfektert med p53-vektor viste en markert reduksjon i Akt fosforylering som respons på IR, sammenlignet med kontroller, noe som betyr at p53-aktivering kan være i stand til å undertrykke aktiviteten av anti -apoptotic protein Akt.
(A) Western blotting-analyse av totale Akt og fosforylert Akt nivåer, utført på bestrålte H295R celler transfektert med tom vektor (mock) og p53-vektor (WT) ved 48 og 72 timer etter transfeksjon. Densitometrisk analyse av Akt normalisert til vinculin og p-Akt
versus
Akt viser at Akt uttrykk ikke er påvirket av p53 status, mens den aktiverte formen av proteinet er betydelig redusert i
wtp53-uttrykkende celler. (B) Totalt cellelysater hentet fra SW-13 cellelinje ble utsatt for vestlige blotting analyse ved hjelp av antistoffer rettet mot Akt og Akt-pSer473. Fosforylering nivåer av Akt er betydelig redusert ved p53 stabilisering som respons på ioniserende stråling behandling. Resultatene som er vist er representative for minst tre forsøk. Bands «intensiteter ble kvantifisert ved hjelp ImageJ og band» densitometry er vist i høyre panel. (*, P 0,05; #, p 0,01).
I henhold til våre opplysninger om celleproliferasjon og apoptose, effekten på Akt fosforylering var tydelig i 48 timer etter transfeksjon (-16% i H295R og -17% i SW-13 celler, henholdsvis) og var maksimalt 72 timer etter transfeksjon (-53% i H295R og -51% i SW-13 celler, p. 0,01)
Diskusjoner
ACC er en aggressiv og heterogen malignitet og de fleste av terapeutiske alternativer er ofte mislykket, noe som indikerer at alternative terapeutiske strategier for ACC trengs [8], [9]. Rapportert toksisitet av strålebehandling er milde til moderate, noe som tyder på at strålebehandling kan representere et gyldig valg. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
