Abstract
Bukspyttkjertel duktale adenokarsinomer er desmoplastic og hypoksisk, som begge er assosiert med dårlig prognose. Hypoksi-aktivert forløpere (HAP) er spesielt aktivert i hypoksiske miljøer for å frigjøre cytotoksiske eller cytostatiske effektorer. TH-302 er et HAP som er til vurdering i en fase III klinisk studie i bukspyttkjertelkreft. Ved hjelp av dyremodeller, viser vi at tumor hypoksi kan forsterkes ved hjelp av en vasodilator, hydralazin, bedre TH-302 effekt. Hydralazine reduserer svulst blodstrømmen gjennom «stjele» fenomen, der atonal umoden tumorvaskulatur unnlater å utvide i samarbeid med normal blodkar. Vi viser at MIA PACA-2 tumorer oppviser en «stjele» effekt som reaksjon på hydralazin, noe som resulterer i redusert tumorblodstrøm og påfølgende tumor pH-reduksjon. Effekten er ikke observert i SU.86.86 tumorer med moden tumor blodkar, som målt ved hjelp av CD31 og glatt muskulatur aktin (SMA) immunhistokjemisk farging. Kombinasjonsbehandling med hydralazin og TH-302 resulterte i en reduksjon i MIA Paca-2 tumorvolumvekst etter 18 dagers behandling. Disse studiene støtter en kombinasjon virkningsmekanisme for TH-302 med en vasodilator som forbigående øker svulsten hypoksi
Citation. Bailey KM, Cornnell HH, Ibrahim-Hashim A, Wojtkowiak JW, Hart CP, Zhang X, et al. (2014) Evaluering av «Steal» fenomen på effekten av hypoksi Aktivert Prodrog TH-302 i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 9 (12): e113586. doi: 10,1371 /journal.pone.0113586
Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 30 juni 2014; Godkjent: 26 oktober 2014; Publisert: 22.12.2014
Copyright: © 2014 Bailey et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd R01CA125627-02; R01CA077575-10; P30CA076292-16 (Robert J. Gillies) og P30CA023074-35 (Amanda F. Baker). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og forfatterne av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser: Charles P. Hart er ansatt i Threshold Pharmaceuticals. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer (PDAC) pasienter har svært dårlige prognoser, med en 5-års overlevelse fra omtrent 6%. Survival er fortsatt lavt både på grunn av mangel på tidlig deteksjon av lokaliserte PDAC og ineffektivitet av tradisjonelle chemotherapies å kontrollere PDAC progresjon. Disse lave overlevelse viser behovet for å utvikle nye behandlingsstrategier. Patologisk PDAC tumorer er svært heterogene og inneholder en dynamisk desmoplastic stromal kammer, som begge bidrar til tumorprogresjon og kjemoterapi motstand [1], [2]. I tillegg til å være en mekanisk barriere for narkotika penetrasjon, bidrar desmoplastic stroma til svulsten hypoksi; en vanlig fysiologisk egenskap av PDAC svulster som også er forbundet med resistens mot kjemoterapi og radioterapi [3] – [5]. Hypoksi-forbundet motstand kjemoterapi kan være mediert av: en mangel på medikamentavgivelse til tumoren på grunn av dårlig perfusjon [4]; hypoksi-indusert resistens mot apoptose [6]; og nedsatt celleformering av de hypoksiske cellefraksjoner [7]. I tillegg har hypoksiske tumorvev vist seg å ha økt metastatisk potensiale [8] og et flertall av PDAC svulster tilstede som metastatisk sent stadium sykdommen [9].
Nylig, arbeidet med å terapeutisk målrette hypoksiske avdelinger av svulster har vært gjort gjennom bruk av hypoksi-aktivert forløpere (Haps). HAP er relativt inert i vev med normal oksygene (pO
2), men reduseres ved å velge en-elektron oksidoreduktaser henhold hypoksiske betingelser for å frigi cytotoksiske stridshoder. En første generasjon HAP, tirapazamin viste potensiell terapeutisk fordel i kombinasjon med standardbehandling [10] – [12], og viste moderat suksess i fase I – II kliniske studier [13], [14]. Ufullstendig tumor gjennomtrengning og en kort halveringstid har stimulert arbeidet med å utforme forbedret tirapazamin analoger med bedre oppløselighet, cytotoksisitet, selektivitet og penetrering vev [15] – [17]. En andre generasjon HAP, TH-302, er satt sammen på en 2-nitroimidazol hypoksi-sensitive trigger og blir selektivt aktivert under ekstrem hypoksi ( 0,5% O
2) frigjør brom-isophosphoramide, et DNA tverrbindings cytotoksiske effektor [18]. TH-302 er svært effektivt i prekliniske xenograft tumormodeller [19], og blir undersøkt klinisk i flere kreftformer, inkludert PDAC. En fase I /II-studie viste at TH-302, i kombinasjon med gemcitabin, økt progresjonsfri overlevelse etter 2 måneder for PDAC pasienter [20], og denne kombinasjonen har nå avansert til fase III (NCT01746979, EMD Serono).
Preklinisk TH-302
in vitro Hotell og
in vitro
monoterapistudier identifiserte sensitive og resistente kreft i bukspyttkjertelen linjer likner tett klinisk respons i PDAC pasienter [21], [22]. Som tumor hypoksi er nødvendig for TH-302-aktivitet, og fordi TH-302 oppviser en tilskuer effekt ved å drepe celler i tilgrensende normoksisk vev [22], har vi antatt at TH-302 effekt kan forbedres ved forbigående å øke hypoksisk fraksjonen i faste tumorer . I silikoaluminofosfater modeller og eksperimentelle bevis viser at den mest effektive metode for å redusere tumor pO
2 er for å øke cellulær respirasjon [23]. Dette ble tidligere demonstrert i colon carcinoma cellelinje, RKO, hvori farmakologisk inhibering av HIF-1α med echinomycin økt oksygenforbruk, redusert tumor pO
2 og økt aktivitet av HAP, tirapazamin [24]. Denne behandlingen resulterte i en kronisk hypoksisk miljø som kan føre til ytterligere hypoksisk tilpasning av tumorceller og HAP bivirkninger. I motsetning til dette, foreslår at forbigående og akutt forverring av hypoksi, i kombinasjon med TH-302, ville være mer effektivt med færre bivirkninger. Før arbeidet har også observert at eksogene pyruvat øker hypoksisk fraksjonen i plateepitelkarsinom (SCC) svulster [25] gjennom en forbigående økning i oksygenforbruk [26]. Vi har også observert at eksogen pyruvat økt virkning av TH-302 i pre-kliniske SCC og PDAC modeller [26], [27]. For å utforske alternative farmakologiske metoder for å midlertidig forverre hypoksi og dermed forsterke anti-tumor egenskaper av TH-302, vi her undersøke «stjele» fenomen. Den «stjele» fenomenet oppstår når vasodilatorer, for eksempel hydralazin, forårsake friske blodårene utvider seg fører til redusert systemisk blodtrykk. Tumor blodkar er ofte umodne og atonal, mangler evnen til å innsnevre eller utvide seg. Derfor, under systemisk vasodilatasjon, det er en fysiologisk reduksjon i blodtrykk som ikke kan matches av svulsten mikromiljøet og blodkar. Den resulterende trykkforskjellen skaper en forbigående reduksjon i tumor perfusjon, som påvirker tumor fysiologi og resulterer i økt hypoksi og acidose [28] – [33]
I denne studien vi hypotese om at hydralazin kan brukes til å redusere akutt perfusjon. og øke hypoksi i svulstens mikromiljø, og dermed forsterke effekten av TH-302. Vi valgte tre humane bukspyttkjertelcancercellelinje xenograft-modeller, som tidligere hadde blitt vist å være følsomme overfor variabelt TH-302 mono [18], [21], [22]. Tumor pH ble målt før og etter administrering av hydralazin som en biomarkør for redusert perfusjon. Forandringer i blodstrømmen etter hydralazin behandling ble kvantitativt målt ved bruk av Doppler-ultralyd for å bekrefte en reduksjon i tumor perfusjon og å utforme doseringsregimer for å maksimere effekten av «stjele» fenomen. Kombinasjonsbehandling med hydralazin og TH-302 ble evaluert med hypotesen om at hydralazin behandling vil øke TH-302 effekt i «stjele» -sensitive linjer. Resultatene indikerte at hydralazin forbedret TH-302 effekt, om enn effekten størrelsen var liten og var bare moderat betydning i tumorer (MIA Paca-2) som utviser middels følsomhet for TH-302 som monoterapi.
Materialer og Metoder
Cell Culture
SU.86.86 og Hs766t celler ble hentet fra Terskel Pharmaceuticals (South San Francisco, California) og MIA PACA-2-celler ble oppnådd fra American Type Cell Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler ble opprettholdt i samsvar med ATCC retningslinjer. Celler ble inkubert i RPMI 1640 supplert med 10% FBS (Hs766t og SU.86.86) eller DMEM supplert med 10% FBS (MIA PACA-2), og ble opprettholdt ved 37 ° C i 5% CO
2. Mycoplasma og cellelinje autentisitet (Karyotype) tester ble utført.
Animal Studies
Alle prosedyrer var i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr Resources (1996), National Research Council, og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité, University of South Florida under godkjente protokollen R4033. Immunsupprimerte mus ble plassert i et rent anlegg med spesielle forhold som inkluderer HEPA filtrert ventilerte merder, autoklaveres sengetøy, autoklaveres boliger, autoklaveres vann, bestrålt mat og spesielle bur endre prosedyrer. Mus ble avlivet etter CO
2 innhalering hvis tumorer har bidratt til en gevinst på 20% i kroppsvekt sammenlignet med kontroller på samme tidspunkt, eller mus opplevde en 10% tap i kroppsvekt, en tumor målt større enn 2000 mm
3, eller mus viser tegn på disseminert sykdom som lungemetastase angitt med anstrengt pust. Alle dyr ble plassert enten på USF Vivarium innen Moffitt kreftsenter eller i Arizona Cancer Center anlegget
SCID-beige hunnmus (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) ble inokulert med 5 -. 10 × 10
6 celler i 1: 1 Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ): PBS løsning subkutant på høyre flanke. Tumorveksten ble overvåket annenhver uke med elektroniske målepunkter gjennom hele varigheten av forsøkene. Tumorvolumer ble beregnet ved hjelp av: volum = (
l
×
w
2) /2, der
l
= lengste lengde og
w
= korteste lengde. Orthotopic bukspyttkjertelen tumor modell: Nude hannmus (n = 3) ble injisert med 1 × 10
6/20 mL av MIA PACA-2 celler i PBS. Mus ble anestetisert med 3% isofluran og vedlikeholdes med 1,5% isofluran under hele prosedyren. Etter lateral innsnitt, ble milten og distale bukspyttkjertel mobiliserte celler og injisert direkte inn i bukspyttkjertelen. Abdominal indre veggen ble sydd og den ytre huden snittet ble lukket med stifter. Analgesi ble gitt til det kirurgiske området for smertelindring. Mus ble fulgt daglig inntil stiftene ble fjernet, omtrent en uke. Tumorvolumet ble overvåket ukentlig av ultralyd.
pH-elektrode
pH-målinger ble oppnådd ved anvendelse av en FE20 Fem enkel pH-meter (Mettler-Toledo, Columbus, OH). Alle dyrene ble bedøvet med isofluran (3,5%) og holdt under anestesi (1,5-3,5% isofluran) for varigheten av forsøket. En referanse og pH-elektrode (MI-401F og MI-408b henholdsvis mikroelektroder Inc., Bedford, NH) ble anvendt til måling av pH ved å sette inn referanseelektroden (OD 1 mm) under huden på mus i nærheten av svulsten (flanke). Elektroden pH-verdien (OD 0,8 mm) ble deretter satt opp til 1,3 cm inn i midten av hver enkelt subkutan tumor. Elektrodene ble kalibrert før og etter hvert sett av målinger. To målinger ble tatt ved hvert tidspunkt og i gjennomsnitt. Etter at den innledende pH-målinger ble dyrene tilført 100 ul intraperitoneal (ip) injeksjon av 10 mg /kg hydralazin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). PH ble målt hvert 30. minutt opp til tre timer etter intraperitoneal injeksjon, og omsorg ble tatt for å måle pH-verdien i omtrent det samme sted i svulsten på hvert tidspunkt. Etter den endelige pH-måling, ble dyrene avlivet og tumorene ble høstet for histologi.
Data ble prosessert ved å ta gjennomsnittet av de to pH-verdier, målt på hvert tidspunkt. Endringen i pH, eller delta (Δ (
t
), hvor
t
er tiden etter injeksjon av hydralazin eller saltvann, i minutter) ble målt som forskjellen mellom det første tidspunktet pH-verdien og hver påfølgende tidspunkter pH. For hver tumor type, gjennomsnittlig delta (
Gjennomsnittlig
Δ) er gjennomsnittet delta for alle dyr av at tumor type:
Hvor
t
er tid, som spenner fra 30 til 180 minutter etter injeksjon,
A
er dyret,
n
t
er antall tidspunkter målt, og
n
A
er antall dyr med det tumortypen. Den maksimale forandring i pH på ethvert tidspunkt etter injeksjon ble identifisert for hvert enkelt dyr. Den gjennomsnittlige maksimale over hver tumortype ble beregnet, og den største endring for et hvilket som helst dyr i hver gruppe ble også identifisert. Antall dyr målt varieres pr tumorType: Hs766T, n = 3; MIA PACA-2 n = 4; og SU.86.86, n = 7.
OxyLite
Kreftoksygene nivåer ble overvåket ved hjelp OxyLab (Oxford Optronics, Oxford, UK) triple parameter E-serien fiberoptisk sonder som ble satt inn i alle svulster. Disse forhåndskalibrert hypoksi microprobes er basert på luminescens quenching og måling av pO2 er basert på den oksygen stanset levetid luminescerende fargestoff. Signaler fra OxyLab sonden ble anskaffet ved hjelp av OxyLab pO2 E og OxyLab LDF overvåkingssystemer som er koblet til en PC. Utgang datasignaler fra disse skjermene ble konvertert til PO2 (mmHg) verdier og registrert i sanntid ved hjelp av en flerkanals datainnsamlingssystem (PowerLab 8SP, ADInstruments, Australia) som kjører under Chart for Windows (Ver.5.02, ADInstruments, Australia) . Bedøvede mus (isofluran, 100% O
2) ble satt fast i en tilpasset immobilisering plattform for å hindre bevegelse og ettermonteres med en varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen. Ekstra forholdsregler ble tatt for å forhindre enhver bevegelse av hypoksi prober, så vel som å begrense forstyrrelser fra ytre lyskilder og dermed eliminere artefakter. Microprobes (OD ~450 um) ble satt inn i tumoren og fikseres i stilling ved hjelp av stereotaktisk metoder. Inntreden i hver av tumorer ble gjort med en 19 g nål og sprøyte microprobes ble matet inn i tumoren ved ~3 mm fra tumoroverflaten og nålen ble trukket tilbake. Microprobes ble forsiktig merket med graderinger for å nå den samme dybde i alle tumorer. Tumor PO2-nivåer ble overvåket inntil en stabil grunnlinje ble observert. Sanntids-målinger ble tatt i 10 minutter ved start og kontinuerlig i 60 minutter etter en 100 ul intraperitoneal (ip) injeksjon av 10 mg /kg hydralazin. Tumor oksygene nivåer før og etter hydralazin injeksjoner ble sammenlignet. Antall dyr målt: MIA Paca-2 n = 4.
Ultralyd Imaging
Ultralyd avbildning ble utført på Vevo2100 med 22-55 MHz transducer MS550D (VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada). Mus som bærer MIA PACA-2-tumorer (n = 4) ble bedøvet (som beskrevet ovenfor) gjennom varigheten av bildebehandling. Doppler-fargebilder ble tatt for å fastslå posisjonen til et større blodkar i tumoren. Når en tilstrekkelig stor blodkar var plassert, ble en pulset bølge (PW) tatt for kvantifisering av strømningen. Dyret mottok en 100 ul injeksjon av 10 mg /kg hydralazin, og strømningen i det samme blodkar ble målt hvert 5. minutt i 30 minutter. For Mia Paca-2 ortotopiske svulster, blodstrøm ble målt i 180 minutter.
legemiddelregimer og tumorvekst Kinetics Monitoring
Dyr ble paret matchet av tumorvolum (som beregnes ved hjelp av elektroniske kalippere) når svulster nådd rundt 200 mm
3. Dyrene ble delt inn i fire behandlingsgrupper (n = 9 dyr pr behandlingsgruppe for Hs766T og SU.86.86, tall oppført for MIA Paca-2): i) TH-302 (n = 9), ii) Hydralazine (n = 7 ), iii) TH-302 + hydralazin (n = 7) og iv) saltvann (kontroll, n = 10). Behandlingene ble administrert som ip-injeksjoner til ikke-bedøvet dyr. Dosene var 50 mg /kg TH-302 i 200 ul saltvann i hvert dyr i gruppene I og III, 10 mg /kg hydralazin i 100 ul saltvann pr dyr [29] i grupper II og III, og 200 ul saltvann i gruppe iv . Gruppe iii fikk hydralazine 30 minutter før administrering av TH-302. Under samtidig dosering av hydralazin og TH-302, hydralazin ble injisert ip umiddelbart før TH-302. Alle behandlingsplaner ble administrert QDx5 for to samtidige uker. Tumorvolum ble målt to ganger i uken ved hjelp av elektroniske kalippere for varigheten av forsøket.
Tissue Behandling og Immunohistochemistry
Ved ferdigstillelse av
in vivo
studier, dyr ble avlivet og svulster ble skåret ut. Svulster ble fiksert i formalin og innstøpt i parafin for videre behandling. Beising for hematoksylin og eosin (H 20% i kroppsvekt sammenlignet med kontroller på samme tidspunkt, eller mus opplevde en 10% tap i kroppsvekt, en tumor målt større enn 2000 mm
3, eller mus viser tegn på disseminert sykdom som lungemetastase indikert av vanskelige anstrengt pust.
Resultater
Tidligere studier har vist en variabel respons på tre PDAC cellelinjer , Hs766t, MIA PACA-2 og SU.86.86, til th-302 monoterapi både
in vitro Hotell og
in vivo
. Behandling av celler dyrket under anoksiske forhold med TH-302 viser at MIA PACA-2 celler er de mest sensitive (IC
50 = 2,1 ± 0,7 mikromol /l); SU.86.86 reagerer moderat (IC
50 = 12 ± 1,2 mikromol /l); og Hs766t den minst følsomme (IC
50 = 60 ± 7,5 mikromol /L) [21]. Interessant
in vivo
, tumor xenograft modeller ved hjelp av de samme cellelinjer viser ulike svar på TH-302 monoterapi. Hs766t reagerte mest gunstig å TH-302 behandling [22], med fullstendig hemming av tumorvekst, mens MIA PACA-2 svulster var moderat responsive [34] og SU.86.86 svulster motstandsdyktig mot TH-302 monoterapi [33]. Differensial responsen PDAC celler
in vitro Hotell og
in vivo
understreker viktigheten av hypoksisk fraksjon innenfor en svulst for maksimal TH-302 effekt
in vivo
, som SU .86.86 svulster er svært vaskularisert og godt oksygenrikt, mens Hs766t svulster har store hypoksiske fraksjoner [19] og en mutasjon i homologi-avhengig DNA reparasjon (HDR) genet FANCG som gjør dem mer følsomme for Br-IPM effektor [35].
Hydralazine og «stjeler» effekt
Siden hydralazin behandling har tidligere vist seg å redusere tumor blodstrøm
in vivo product: [28], hypotese vi at hydralazin kan brukes til forbigående øke hypoksisk fraksjonen i svulster og øke TH-302 effekt. Hydralazin har også vist seg å øke tumor acidose [29], som kan være en effektiv metode for å identifisere tumorer som oppviser en «stjele» effekt som ville være mer mottakelige for kombinasjonsbehandling. For å teste vår hypotese, mus med subkutan SU.86.86, ble MIA Paca-2 eller Hs766t tumorer bedøvet og tumor pH ble målt ved hjelp av en pH microelectrode. Å måle endringer pH som følge av endringer i blodstrøm ble musene administrert 10 mg /kg hydralazin via intraperitoneal (ip) injeksjon. Tumor pH-målinger ble oppnådd etter 30 minutter etter hydralazin behandling i tre timer. Vi antok at svulster stiller den «stjeler» effekt vil oppleve svulst forsuring følgende hydralazin behandling. TH-302 følsomme Hs766t tumorer (n = 3) viste ingen endring i gjennomsnittlig pH-verdien etter behandling med hydralazin (fig. 1). TH-302 resistente SU.86.86 tumorer (n = 7), men opplever en paradoksal liten økning i pH-verdien (+0.05 pH-enheter) etter behandling med hydralazin (fig. 1). MIA PACA-2 tumorer (n = 4), som er moderat mottakelig for TH-302, konsekvent viste en ekte «stjele» effekt etter hydralazin behandling, opplever en betydelig reduksjon i pH (- 0,12 pH-enheter) i forhold til SU.86.86 (
p
0,007) og Hs766t (
p
. 0,05) (figur 1). Selv om heterogenitet eksisterte mellom tumorprøver, hver prøve testet reagerte på lignende måte som andre tumorer innenfor sine cohorts, som dokumentert ved å observere den eneste maksimum dyr forandring, er gjennomsnittet av den maksimale responsen fra hvert dyr i løpet av eksperimentet og den gjennomsnittlige endringen i pH-verdi for hvert dyr for hvert tidspunkt måles (fig. 1). Disse resultatene indikerer at administrering av hydralazin førte til redusert perfusjon i MIA PACA-2 svulster, men ikke påvirke perfusjon i enten Hs766t eller SU.86.86 svulster.
mus med subkutan SU.86.86 (n = 7), Hs766t (n = 3) eller MIA PACA-2 (n = 4) flanke tumorer ble bedøvet og tumor pH-målinger ble oppnådd. En referanse-elektrode ble innsatt under huden på mus i en ikke-tumorsted mens pH-elektrode ble innsatt opptil 1,3 cm inn i midten av hver tumor. To målinger ble tatt ved hvert tidspunkt og i gjennomsnitt. Etter de initielle pH-målinger ble musene administrert 10 mg /kg hydralazin via ip injeksjon. Tumor pH-verdien ble målt 3 timer etter behandlingen. Data rapportert representerer den gjennomsnittlige maksimale endring i hver årsklasse, den gjennomsnittlige pH-endring for hver årsklasse og singelen maksimal dyr pH endring for hvert kull. Dataene er rapportert som gjennomsnittlig endring i pH-verdi ± SEM. *
P
0,05; **
P
. 0,007
For ytterligere å undersøke effekten av hydralazin på svulster som viste den «stjeler» effekt, brukte vi Doppler ultralyd for å måle tumorblodstrøm følgende hydralazine behandling i MIA PACA-2 svulster. Før hydralazin behandling, ble fargedoppler bilder innhentet over MIA PACA-2 tumorer (n = 4) for å identifisere store tumorvaskulatur (Fig. 2A, venstre panel). Ved hjelp av en pulset (PW), ble blodstrømmen gjennom tumorvaskulatur målt over 30 minutter etter hydralazine ip administrasjon (Fig. 2A, panel til høyre). Vi observerte en reduksjon i blodstrømmen innen 15 minutter av hydralazin injeksjon (Fig. 2A, panel høyre). Kvantifisering av disse dataene bekreftet en reduksjon i tumorblodgjennomstrømningen begynner 15 minutter etter hydralazine injeksjon med en fortsatt nedgang gjennom 30 minutter (Fig. 2B). Effekten av hydralazin på blodstrømningen kan vare lenger enn 30 minutter. For å utforske denne muligheten, blodstrøm i Mia PACA-2 ortotopiske pankreatiske tumorer (n = 3), en tumor modell som er mer fysiologisk relevant, ble overvåket ved Doppler-ultralyd i 180 minutter. Blodstrømmen redusert til minimalt nivå med 30 minutter, og støtter subkutane svulst observasjoner, men i ortotopiske svulster, forble blodstrøm på dette nivået i 90 minutter med utvinning oppstår mellom 90 og 120 minutter. På grunn av likheter i blodstrømmen mellom subkutane og ortotopiske Mia Paca-2 svulster, var vi sikre på at overvåking tumor oksygenering (70 minutter) med oksygen elektroder i subkutane svulster (N = 5) ville være en nøyaktig representasjon. I likhet med pH elektrode data, tumor oksygennivået redusert i løpet av 5 minutter etter hydralazin, men kom ikke tilbake til baseline innenfor tidsrammen av denne studien. Heterogenitet ble observert som graden av oksygen nedgang varieres (fig. 2D).
Mus som bærer MIA PACA-2-tumorer ble analysert ved hjelp av Doppler-ultralyd for å kvantifisere tumorblodstrøm. A)
Venstre Panel:
Svulster ble skannet med farge Doppler til å identifisere store tumorvaskulatur før behandling. Red representerer blodstrømmen gjennom tumor blodkar. Hvit pilmerkene blodkar valgt for analyse.
Høyre Panel:
Etter hydralazin administrasjon, pulset (PW) ble brukt hvert 5. minutt i 30 minutter for å kvantifisere blodstrømmen gjennom tumor blodkar. Representative diagrammer som viser en nedgang i tumorblodstrømmen etter hydralazine behandling. B) Kvantifisering av tumorblodstrøm endringer i MIA PACA-2 subkutane svulster (n = 4) etter hydralazin behandling. Data er rapportert som midlere hastighet (mm /s) ± SEM. C) Kvantifisering av tumorblodstrøm endringer i Mia Paca-2 ortotopiske pankreastumorer (n = 3) etter hydralazin behandling. Data er rapportert som midlere hastighet (mm /s) ± SEM. D) Tumor oksygene ble målt før og etter hydralazine hjelp OxyLite (oksygen) nål elektroder i subkutane Mia Paca-2 svulster (N = 5). Målinger blir samlet inn over tid på ett enkelt sted inne i svulsten. Fullstendige eksperimentelle detaljer finner du i metodedelen. Data er presentert som pO2 (mmHg). Pilen ved t = 10 minutter betegner I.P. injeksjon av hydralazin.
Histologisk evaluering av PDAC blodkar
tumorprøver fra hver cellelinje ble analysert histologisk å karakter blodkar. CD31 og glatt muskulatur aktin (SMA) er to vanlige tumorvaskulatur immunhistokjemi (IHC) markører som identifiserer tilstedeværelse (CD31), og modenhet og tone (SMA) av blodkar. Svulster med betydelig blodkar som er tone ville ikke forventes å stille ut «stjele» fenomen, som tumorvaskulatur ville strekke i samordning med systemiske effekter av hydralazin behandling. Ved hjelp av positive pixel analyse, kvantifisert vi andelen Hs766t, SU.86.86 og MIA PACA-2 svulster som inneholdt CD31 og SMA farging. I samsvar med tidligere resultater, SU.86.86 svulster hadde signifikant mer CD31 (
p
0,05) (Fig. 3A-B) farging enn både Hs766t eller MIA PACA-2, og betydelig mer SMA (
p
. 0,005) enn MIA Paca-to svulst prøver (figur 3A, C). Disse dataene indikerer at SU.86.86 svulster er godt vaskularisert med modne fartøy som kan forventes å strekke svar på hydralazin behandling. MIA PACA-2 og Hs766t svulster hadde lignende mengder CD31 flekker (Fig. 3A-B). MIA PACA-2 svulster hadde minst mengden SMA flekker blant de tre svulster som ble testet (Fig. 3A, C). Disse dataene indikerer at MIA Paca-2 blodkar er umoden og atonal. Som MIA PACA-2 svulster vises redusert svulst blodstrømmen (fig. 2) og en påfølgende reduksjon i tumor pH (Fig. 1), konkluderer vi med at MIA PACA-2 svulster vise den «stjeler» effekt på grunn av umoden tumor blodkar.
Hs766t, MIA PACA-2 og SU.86.86 svulster ble fiksert og dyppet i parafin i forberedelsene til IHC farging for tumor blodkar markører, CD31 og SMA. A) Representative bilder av svulster farget med CD31 og SMA. Skala barer representerer 100 mikrometer. Positive piksel analyse av B) CD31 og C) SMA flekker over hele området av en svulst. Data presentert som% Positivitet [(Positive piksler /piksler totalt) × 100] ± SEM. *
P
0,05; **
P
. 0,005
Hydralazine forbedrer TH-302 aktivitet in vivo
For å teste TH-302 monoterapi og kombinasjonsbehandling med hydralazin for hver celle linjen xenograft ble mus implantert med subkutan Hs766t, SU.86.86 eller MIA PACA-2 flanke svulster, og par-matchet i fire kohorter: ubehandlet (saltvann), TH-302 alene (50 mg /kg ip), hydralazin alene (10 mg /kg ip) og TH-302 /hydralazin kombinasjonsbehandling. Ved kombinasjonsbehandling, ble TH-302 administrert 30 minutter etter hydralazine administrasjonen så dette syntes å være tidspunktet for maksimal effekt på perfusjon post-hydralazin. Alle kullene ble behandlet i to sykluser av 5 påfølgende behandlinger etterfulgt av 2 dager fri, og tumorvolum ble overvåket med elektroniske målepunkter i løpet av studien. Tumorvolumet kontroll av TH-302 monoterapi eller kombinasjonsterapi ble regnet som tapt når tumorer nådde 1000 mm
3, noe som er beskrevet i Kaplan Meier kurver. Som forventet, Hs766t tumorvekst ble fullstendig hemmet med TH-302 monoterapi (Fig. 4A-B), SU.86.86 tumorvekst var upåvirket av TH-302 monoterapi (fig. 4C-D) og MIA PACA-2 svulster svarte moderat til behandling (fig. 4E-F). Kombinasjonsterapi av hydralazin, etterfulgt av administrering av TH-302 ikke hadde noen gunstig virkning på tumorvolumkontrollen i mus som bærer Hs766t eller SU.86.86 tumorer i forhold til kullene behandlet med TH-302 monoterapi. Viktigere, ingen av disse tumormodeller utstilt «stjele» effekt etter hydralazine administrasjon (Fig. 1). MIA PACA-2-tumorer svare moderat til TH-302 monoterapi (fig. 4E-F), og hadde en økning i tumor acidose på grunn av redusert tumorblodstrømmen følgende hydralazin behandling (fig. 1). Mus med MIA PACA-2 svulster opplevde en beskjeden ytterligere reduksjon i tumorvolumvekst når de ble behandlet med TH-302 /hydralazine kombinasjonsbehandling sammenlignet med TH-302 monoterapi (fig. 4E-F). Til tross for en trend for reduksjon i tumorvekst mellom TH-302 /hydralazin kombinasjonsbehandling og TH-302 monoterapi, statistiske analyser av vekstkurver viser at forskjellene ikke oppnådde statistisk signifikans (
p
0,08). Dette eksperimentet ble gjentatt to ytterligere ganger med lignende resultater (data ikke vist). I alle tilfellene hadde MIA PACA-2-tumorer behandlet med kombinasjonsterapi redusert vekst, men det var ikke signifikant lavere (p = 0,08) enn den for TH-302 monoterapi.
